血管內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)方法的比較

1、血管內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)方法的比較         【摘要】  目的比較不同方法進(jìn)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)形成三維血管狀結(jié)構(gòu)的差異。方法采用表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng),觀察形成的三維管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果表面培養(yǎng)法:細(xì)胞生長(zhǎng)快,管狀結(jié)構(gòu)形成多,細(xì)胞分支連接形成復(fù)雜的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);混合培養(yǎng)法:細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,管狀結(jié)構(gòu)形成少,出現(xiàn)細(xì)胞連接形成的細(xì)胞索與三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量較少。兩種培養(yǎng)方法形成的血管樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量與長(zhǎng)度明顯不同。結(jié)論表面培養(yǎng)法體外血管三維培養(yǎng),具有操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞生長(zhǎng)快、三維血管結(jié)

2、構(gòu)形成數(shù)量多、血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點(diǎn),適用于血管生成影響因素的實(shí)驗(yàn)研究。 【關(guān)鍵詞】  內(nèi)皮細(xì)胞 內(nèi)皮 血管 細(xì)胞 培養(yǎng)的 臍靜脈 新生血管化 病理性   血管生成即由原有血管出芽生長(zhǎng)形成新生血管的過(guò)程。對(duì)于許多生理性過(guò)程(如胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù))以及病理性過(guò)程(如動(dòng)脈硬化、腫瘤發(fā)生),尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移等的一系列病理過(guò)程中,新生血管起了相當(dāng)重要的作用1。新生的毛細(xì)血管既為腫瘤生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng),又為腫瘤轉(zhuǎn)移準(zhǔn)備條件。體外血管三維培養(yǎng)方法可使細(xì)胞呈立體生長(zhǎng),更接近于體內(nèi)生長(zhǎng)模式,為血管生長(zhǎng)模擬了類似于體內(nèi)的三維空間,誘導(dǎo)細(xì)胞出芽、增生、遷移或分化等一系列變化

3、,對(duì)于評(píng)估各種因素對(duì)血管生成的影響具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。筆者采用表面培養(yǎng)法和混合培養(yǎng)法,在三維凝膠培養(yǎng)基中進(jìn)行臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的體外三維培養(yǎng),比較二種體外培養(yǎng)方法在形成三維血管結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和數(shù)量,以及形成血管網(wǎng)的復(fù)雜性等方面的差異,為針對(duì)腫瘤性血管生成的腫瘤治療方法提供實(shí)驗(yàn)方法學(xué)方面的依據(jù)。   1材料與方法   1.1材料主要試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液與0.25%胰蛋白酶(美國(guó) Gibco公司),克隆胎牛血清(FBS,奧地利 PAA公司),支原體抗生素Plasmocin(美國(guó) Invivogen公司),內(nèi)皮生長(zhǎng)支持物(ECGS,美國(guó) Sigma公司

4、),抗第因子抗體、抗CD31抗體、抗CD34抗體及相關(guān)抗原免疫染色試劑(美國(guó) Santa Cruz公司),三維細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒(美國(guó) Chemicon公司),青霉素、鏈霉素、兩性霉素(華北制藥集團(tuán))。主要儀器:水套式CO2培養(yǎng)箱(3110型,美國(guó) Thermo Forma公司),倒置相差顯微鏡(71型,日本 Olympus公司),低速冷凍大容量離心機(jī)(DL4000B型,上海安亭科學(xué)儀器廠),垂直流超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)安泰公司)。   1.2方法   1.2.1人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定酶灌注法分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞:健康產(chǎn)婦分娩后立即無(wú)菌操作取新

5、生兒臍帶20 cm左右,以含有適量青霉素、鏈霉素、兩性霉素的PBS沖洗臍靜脈腔,向臍靜脈腔內(nèi)灌注0.25%胰酶,至臍靜脈充盈,以血管鉗夾閉臍靜脈腔,37 孵育7 min。PBS沖洗臍靜脈腔并收集流出液,FBS終止胰蛋白酶的消化作用,離心收集細(xì)胞,加入含20%FBS及適量青霉素、鏈霉素、兩性霉素的DMEM培養(yǎng)基,37 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),24 h后更換培養(yǎng)基,去除未貼壁的懸浮細(xì)胞。隔天更換培養(yǎng)基,至貼壁細(xì)胞70%80%融合時(shí),消化傳代,取34代用于三維培養(yǎng)。   1.2.2三維培養(yǎng)膠原溶液制備按照試劑盒說(shuō)明書(shū),在無(wú)菌EP管中加入膠原溶液2 mL,然后加入5×DMEM

6、0.5 mL,小心混勻,避免產(chǎn)生氣泡,加入平衡液25 L,混勻,并將配制好的膠原溶液置于冰上備用。   1.2.3臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)   1.2.3.1表面培養(yǎng)法向96孔培養(yǎng)板的每一個(gè)培養(yǎng)孔內(nèi)加入配制好的膠原凝膠溶液100 L,立即將培養(yǎng)板置37 培養(yǎng)箱溫育60 min,使膠原溶液聚合形成固體凝膠。將培養(yǎng)傳代34代的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁消化,并反復(fù)吹打形成單細(xì)胞懸液。將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以每孔約5×104的密度接種于膠原凝膠表面。1 h后倒置相差顯微鏡下觀察凝膠表面的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況,待細(xì)胞貼壁達(dá)到70%80%融合時(shí),更換培養(yǎng)基為DMEM+

7、20%FBS+ECGS 200 g/mL。培養(yǎng)24 h后,倒置相差顯微鏡下每個(gè)培養(yǎng)孔隨機(jī)選擇若干個(gè)視野,記錄每個(gè)視野   A:表面培養(yǎng)法; B:混合培養(yǎng)法; 1:接種12 h(×200); 2:接種24 h(×200); 3:接種24 h凝膠垂直切片(HE×100).   A1:內(nèi)皮細(xì)胞遷移連接,形成細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu),數(shù)量較多,出現(xiàn)連接溝通; A2:細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu)趨復(fù)雜,細(xì)胞索分支溝通連接形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu); A3:,內(nèi)皮細(xì)胞索形成管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu). B1:細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu)數(shù)量較少; B2:細(xì)胞索數(shù)量與網(wǎng)絡(luò)分支較少; B3:少量細(xì)胞索結(jié)構(gòu),

8、罕見(jiàn)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu).   下生長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞管的長(zhǎng)度和管狀結(jié)構(gòu)數(shù)目;而后將膠原凝膠進(jìn)行4甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片等一系列處理,顯微鏡下觀察臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在膠原凝膠中的生長(zhǎng)情況。   1.2.3.2混合培養(yǎng)法將培養(yǎng)傳代34代的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞自培養(yǎng)瓶壁消化,吹打形成單細(xì)胞懸液。將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞以1×106 mL-1的濃度與膠原溶液混合,小心吹打,形成單細(xì)胞懸液,避免產(chǎn)生氣泡。向96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔內(nèi)滴加臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞膠原溶液混合液100 L,避免產(chǎn)生氣泡。立即將培養(yǎng)板置37 培養(yǎng)箱60 min,使膠原溶液聚合形成固體凝膠。向凝膠表面添加培養(yǎng)基DME

9、M+20%FBS+ECGS 200 g/mL。后續(xù)步驟同1.2.3.1。   1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示,采用PEMS 3.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較。            2結(jié)果   2.1細(xì)胞鑒定取少許貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞作免疫組織化學(xué)染色鑒定,CD31、CD34、因子染色均為陽(yáng)性,證實(shí)該細(xì)胞為臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(圖1)。   2.2形態(tài)學(xué)觀察   2.2.1表面培養(yǎng)法接種1 h后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在

10、膠原凝膠表面發(fā)生融合生長(zhǎng),逐漸從凝膠表面向凝膠內(nèi)遷移,最早于接種6 h后即可觀察到少量由細(xì)胞遷移連接形成的細(xì)胞索結(jié)構(gòu),12 h后細(xì)胞索結(jié)構(gòu)數(shù)量增多,并且相互之間出現(xiàn)連接溝通,隨著時(shí)間推移,細(xì)胞索結(jié)構(gòu)越趨復(fù)雜,24 h左右細(xì)胞索的分支之間相互溝通連接形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),3 d后凝膠內(nèi)細(xì)胞仍生長(zhǎng)旺盛。將培養(yǎng)24 h膠原凝膠固定包埋切片,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞索形成的血管狀結(jié)構(gòu)。   2.2.2混合培養(yǎng)法細(xì)胞在凝膠內(nèi)生長(zhǎng),12 h后可觀察到由內(nèi)皮細(xì)胞連接形成的細(xì)胞索結(jié)構(gòu),但數(shù)量較少,24 h左右細(xì)胞索分支間相互溝通連接形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),與表面培養(yǎng)法形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)相比,細(xì)胞索數(shù)量

11、較少,網(wǎng)絡(luò)分支也較少,48 h左右凝膠內(nèi)的細(xì)胞逐漸出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,血管分支結(jié)構(gòu)漸崩解。將培養(yǎng)24 h的膠原凝膠固定包埋切片,光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)由內(nèi)皮細(xì)胞連接形成的細(xì)胞索結(jié)構(gòu),而由細(xì)胞索溝通連接形成的血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)相對(duì)少見(jiàn)(圖2)。   2.3血管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度和數(shù)量表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法分別培養(yǎng)24 h后,前者形成的血管樣結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度和數(shù)量為(2.06±0.29)mm和(11.43±1.43),后者為(1.18±0.11)mm和(5.42±0.77),差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。   3討論   內(nèi)皮細(xì)

12、胞在三維培養(yǎng)體系與二維培養(yǎng)體系中的生物學(xué)行為存在顯著差異,三維培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)更類似于體內(nèi)血管生成。血管生成對(duì)于許多生理性過(guò)程和病理性過(guò)程,尤其是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移等一系列病理過(guò)程中,具有相當(dāng)重要的作用。內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng)方法多種多樣,國(guó)內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過(guò)20余年的研究,發(fā)展出了表面培養(yǎng)法、混合培養(yǎng)法、微載體培養(yǎng)法以及基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞聚集體侵襲法(RIMAC)、磁標(biāo)記法等方法37,并且應(yīng)用這些方法,在血管生成促進(jìn)因子、抑制因子以及各種血管生成影響因素等方面進(jìn)行大量的研究。   本研究比較表面培養(yǎng)法與混合培養(yǎng)法臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外三維培養(yǎng),兩種培養(yǎng)方法均能在膠原凝膠中觀察

13、到細(xì)胞索樣結(jié)構(gòu)以及由細(xì)胞索連接形成的復(fù)雜管網(wǎng)樣結(jié)構(gòu),但使用前者最早于培養(yǎng)6 h可以觀察到細(xì)胞索結(jié)構(gòu),同時(shí)在膠原凝膠中形成三維管狀結(jié)構(gòu)的數(shù)量明顯多于后者,長(zhǎng)度明顯大于后者,且所形成的管狀結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性更甚于后者。在實(shí)驗(yàn)操作方面,表面培養(yǎng)法將內(nèi)皮細(xì)胞接種于已凝固的膠原凝膠表面,操作過(guò)程簡(jiǎn)便易行,不必將細(xì)胞混懸于膠原溶液中,避免了因混懸內(nèi)皮細(xì)胞而出現(xiàn)的凝膠氣泡的現(xiàn)象,同時(shí)避免了由于實(shí)驗(yàn)操作機(jī)械損傷內(nèi)皮細(xì)胞而降低細(xì)胞活力,因此不影響細(xì)胞在三維凝膠中的伸展、遷移等一系列生物學(xué)過(guò)程,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察,具有操作簡(jiǎn)便、方便觀察等特點(diǎn)。   與混合培養(yǎng)法相比較,表面培養(yǎng)法在內(nèi)皮細(xì)胞的體外三

14、維培養(yǎng)方面還具有管狀結(jié)構(gòu)數(shù)量多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、細(xì)胞生存期長(zhǎng)等特點(diǎn),更適用于對(duì)血管生成促進(jìn)因子、抑制因子以及各種血管生成影響因素等方面的研究。【參考文獻(xiàn)】  “1“Ucuzian A A, Greisler H P. In vitro models of angiogenesis“J“. World J Surg, 2007,31(4):654663.“2“Martins G G,Kolega J. Endothelial cell protrusion and migration in threedimensional collagen matrices“J“. Cell Motil C

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