《中國藥典》無菌及微生物限度檢查法發(fā)展與修訂

1、LOGO1中國藥典中國藥典無菌及微生物無菌及微生物限度檢查法發(fā)展與修訂限度檢查法發(fā)展與修訂重慶市食品藥品檢驗所 2醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)v 醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)明與發(fā)展進步極大地改變了人類的命運醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)明與發(fā)展進步極大地改變了人類的命運v 獨具特色的中藥注射液獨具特色的中藥注射液v 特殊的醫(yī)藥環(huán)境使我國成為規(guī)模龐大的特殊的醫(yī)藥環(huán)境使我國成為規(guī)模龐大的“吊瓶大國吊瓶大國”v 注射用藥品成為注射用藥品成為“高風險產(chǎn)品高風險產(chǎn)品”3醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)v微生物控制及檢驗成為高難度工作微生物控制及檢驗成為高難度工作 一百多年來人們努力提高在一百多年來人們努力提高在“有

2、菌的環(huán)境有菌的環(huán)境”生產(chǎn)生產(chǎn)“無菌的產(chǎn)品無菌的產(chǎn)品”的能力，事實證明這一努的能力，事實證明這一努力至今充滿挑戰(zhàn)。力至今充滿挑戰(zhàn)。 20062006年年7 78 8月發(fā)生了震驚月發(fā)生了震驚 全國的全國的“欣弗事件欣弗事件” 直接死亡直接死亡1111人人 企業(yè)倒閉企業(yè)倒閉 至今余震不斷至今余震不斷4醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)v “欣弗事件欣弗事件”對我國的藥品生產(chǎn)監(jiān)管產(chǎn)生了深遠的影響，對我國的藥品生產(chǎn)監(jiān)管產(chǎn)生了深遠的影響，直接推動了新的藥典方案和新版直接推動了新的藥典方案和新版GMPGMP規(guī)定的出臺。規(guī)定的出臺。 “欣弗事件欣弗事件”將永遠成為無菌藥品生產(chǎn)典型反面教材將永遠成為無菌藥

3、品生產(chǎn)典型反面教材 有人借此詆毀中國醫(yī)藥產(chǎn)品是在廁所生產(chǎn)的，理由是從未開封的欣弗中分離出了污水常見菌肺炎克雷伯菌 顯微圖顯微圖像像單菌落單菌落5醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展與挑戰(zhàn)v20122012年年1010月，美國新英格蘭合成制藥中心月，美國新英格蘭合成制藥中心生產(chǎn)的注射用類固醇霉菌污染，造成數(shù)百生產(chǎn)的注射用類固醇霉菌污染，造成數(shù)百人感染真菌腦炎，至年底統(tǒng)計死亡人感染真菌腦炎，至年底統(tǒng)計死亡3939人。人。 v在50支密封藥瓶中檢測出曲霉菌和突臍乳孢菌兩種類型 6藥品微生物污染的反思藥品微生物污染的反思v在醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展過程中，盡管世界在醫(yī)藥產(chǎn)品的發(fā)展過程中，盡管世界各國付出過慘重代價

4、，實際上稍有不各國付出過慘重代價，實際上稍有不慎悲劇仍然可能重演。慎悲劇仍然可能重演。 悲劇的避免悲劇的避免! 尊重規(guī)律，科學監(jiān)管，全程無縫監(jiān)控，嚴格落實各項管理、驗證、檢查和分析調(diào)查措施，切實降低無菌藥品的微生物污染風險。7歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展歷版藥典微生物檢測方面所取得的進展v 74年、年、84年、年、90年衛(wèi)生部年衛(wèi)生部藥品衛(wèi)生學檢查法藥品衛(wèi)生學檢查法；86年衛(wèi)生部頒年衛(wèi)生部頒布布藥品衛(wèi)生標準藥品衛(wèi)生標準v 1995年版藥典首次收載微生物限度檢查法年版藥典首次收載微生物限度檢查法v 2000年版藥典首次收載微生物限度標準年版藥典首次收載微生物限度標準v 2005版版 將按劑

5、型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度將按劑型制定限度修訂為按給藥途徑制定限度 首次收載方法驗證要求首次收載方法驗證要求 無菌檢查培養(yǎng)時間與國外接軌無菌檢查培養(yǎng)時間與國外接軌v 2010版版 首次收載培養(yǎng)基適用性檢查要求首次收載培養(yǎng)基適用性檢查要求 強調(diào)對微生物檢驗過程的驗證及過程控制強調(diào)對微生物檢驗過程的驗證及過程控制 部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論部分品種特別是抗生素品種的無菌檢查法由附錄走入了各論8中國藥典中國藥典2010年版的框架組成年版的框架組成v無菌檢查法無菌檢查法v微生物限度檢查法微生物限度檢查法v滅菌法滅菌法 抑菌效力檢查法指導原則 藥品微生物檢驗替代方法驗證

6、指導原則 藥品微生物限度檢查法應用指導原則 藥品微生物實驗室規(guī)范指導原則9修訂背景修訂背景v歐、美、日等主要藥典均收載了協(xié)調(diào)一致歐、美、日等主要藥典均收載了協(xié)調(diào)一致的微生物檢查法和限度標準，由于歷史原的微生物檢查法和限度標準，由于歷史原因，我國目前的微生物限度檢查體系與國因，我國目前的微生物限度檢查體系與國際相比存在差距，這一差距對于目前我國際相比存在差距，這一差距對于目前我國企業(yè)產(chǎn)品出口造成很大的障礙，也對我國企業(yè)產(chǎn)品出口造成很大的障礙，也對我國的微生物質量控制造成很大困惑。的微生物質量控制造成很大困惑。10修訂背景修訂背景v雖然中國目前不是雖然中國目前不是ICH的成員國，而的成員國，而是以

7、觀察員的身份進入，但中國與國是以觀察員的身份進入，但中國與國外制藥行業(yè)交往日益增多，中國藥品外制藥行業(yè)交往日益增多，中國藥品要想進入國際市場，藥品的檢驗方法要想進入國際市場，藥品的檢驗方法和標準與和標準與ICH保持一致，勢在必行。保持一致，勢在必行。 112015版藥典修訂的具體原則版藥典修訂的具體原則v檢驗方法與國外藥典進一步協(xié)調(diào)；檢驗方法與國外藥典進一步協(xié)調(diào)；v已有的指導原則實用化，通過科研解決指導原則已有的指導原則實用化，通過科研解決指導原則實用化問題；實用化問題；v增加新的指導原則，特別是對與企業(yè)過程控制相增加新的指導原則，特別是對與企業(yè)過程控制相關的指導原則。關的指導原則。12201

8、5版藥典無菌及微生物限度檢查法目標版藥典無菌及微生物限度檢查法目標v建立統(tǒng)一的質量技術要求，保持各方藥典科技建立統(tǒng)一的質量技術要求，保持各方藥典科技水平一致，保證用藥安全、有效。水平一致，保證用藥安全、有效。 質量控制、檢驗技術、檢驗標準等v減少國際貿(mào)易的障礙。減少國際貿(mào)易的障礙。v統(tǒng)一醫(yī)藥產(chǎn)品進入國際市場的技術門檻，促進統(tǒng)一醫(yī)藥產(chǎn)品進入國際市場的技術門檻，促進國際間藥品在同一技術平臺的公平競爭。國際間藥品在同一技術平臺的公平競爭。 132015版藥典無菌及微生物限度檢查法版藥典無菌及微生物限度檢查法化學藥品與生物化學藥品與生物制品：制品：與協(xié)調(diào)案統(tǒng)一與國際先進水平同步發(fā)展具體目標具體目標中藥

9、：中藥： 加大科研投入，在方法上與協(xié)調(diào)案統(tǒng)一，在項目、限度等方面制定與中藥相適應的目標。 以我為主，引領國際發(fā)展。142015版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內(nèi)容版藥典無菌及微生物限度檢查法修訂內(nèi)容v修訂后的中國藥典微生物檢驗系統(tǒng)成為一個較修訂后的中國藥典微生物檢驗系統(tǒng)成為一個較完備的標準體系，將收載完備的標準體系，將收載15個左右的微生物檢個左右的微生物檢查法和指導原則。查法和指導原則。v 修訂后的中國藥典微生物檢測系統(tǒng)與國外完全修訂后的中國藥典微生物檢測系統(tǒng)與國外完全一致。一致。v對實驗環(huán)境進行了重大修訂。對實驗環(huán)境進行了重大修訂。15無菌檢查實驗室環(huán)境規(guī)定的修訂無菌檢查實驗室環(huán)境規(guī)定的修

10、訂 修訂依據(jù)及意義：修訂依據(jù)及意義： 2010年版年版GMP中附錄一中附錄一無菌藥品無菌藥品和附錄三和附錄三生物制生物制品品中均規(guī)定，非最終滅菌產(chǎn)品各工序關鍵操作環(huán)境應為中均規(guī)定，非最終滅菌產(chǎn)品各工序關鍵操作環(huán)境應為B級級背景下的背景下的A級；無菌檢查的潔凈環(huán)境不得低于生產(chǎn)關鍵區(qū)的潔級；無菌檢查的潔凈環(huán)境不得低于生產(chǎn)關鍵區(qū)的潔凈環(huán)境要求。凈環(huán)境要求。2010年版2015年版應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)進行應在潔凈度B級背景下的局部A級單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進行16無菌檢查法的培養(yǎng)基系統(tǒng)無菌檢查法的培養(yǎng)基系統(tǒng)培養(yǎng)體系的差異是導致中國藥典無菌檢查與國外

11、藥典無菌檢查的系統(tǒng)性差異，從而帶來結果之間的不確定性及不可比性。 這是我國藥典無菌檢查法必須關注的問題！ 藥典USP/EP/JP中國藥典2010及之前版本分類依據(jù)按營養(yǎng)和培養(yǎng)條件分按微生物類別分質控分類需氣、厭氣菌細菌、真菌檢驗體系與廣譜的培養(yǎng)條件對應人為地選擇培養(yǎng)評價嚴謹易誤導結果判斷或造成漏檢17無菌檢查培養(yǎng)基及其有關內(nèi)容的修訂無菌檢查培養(yǎng)基及其有關內(nèi)容的修訂v 無菌檢查是一個定性試驗，根據(jù)檢查方法，要求所用培養(yǎng)基具有廣無菌檢查是一個定性試驗，根據(jù)檢查方法，要求所用培養(yǎng)基具有廣譜的促菌生長能力，而不是也不可能一開始就對可能污染的微生物譜的促菌生長能力，而不是也不可能一開始就對可能污染的微生

12、物分類進行培養(yǎng)。為此，各國藥典無菌檢查用培養(yǎng)基都有一個不斷改分類進行培養(yǎng)。為此，各國藥典無菌檢查用培養(yǎng)基都有一個不斷改進至基本確定的發(fā)展過程。進至基本確定的發(fā)展過程。 1950年美國藥典第十六章已確定使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB) 現(xiàn)USP、BP、EP、JP及ICH均規(guī)定使用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(FTG)和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB) 但在我國長期的微生物分類培養(yǎng)觀念下，認為改良馬丁培養(yǎng)基(MM)更適用于真菌檢查。18v2011年藥典會微生物專業(yè)委員會立題對無年藥典會微生物專業(yè)委員會立題對無菌檢查用培養(yǎng)基進行了研究菌檢查用培養(yǎng)基進行了研究國產(chǎn)胰國產(chǎn)胰酪大豆

13、胨培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的微生酪大豆胨培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的微生物促生長能力考察物促生長能力考察 對國產(chǎn)的3個廠家的MM培養(yǎng)基和3 個廠家的TSB培養(yǎng)基與BD公司的TSB培養(yǎng)基進行了系統(tǒng)對比實驗。19實實 驗驗 菌菌 株株v細菌：細菌： 藤黃微球菌CMCC(B)28001 枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501 克氏庫克菌（北京所參加國際微生物鑒定所得）v真菌：真菌： 黑曲霉CMCC(F)98003 臘葉芽枝霉CMCC(F)7702 一株從樣品或環(huán)境中分離的霉菌 207個實驗室的實驗結論個實驗室的實驗結論v經(jīng)統(tǒng)計分析表明：國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基經(jīng)統(tǒng)計分析表明：國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB

14、)和改良馬丁培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基(MM)的促菌生長能力無的促菌生長能力無顯著性差異。顯著性差異。v國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基國產(chǎn)胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)和改良馬丁培和改良馬丁培養(yǎng)基養(yǎng)基(MM)適宜生長的微生物種群（廣譜性）無顯適宜生長的微生物種群（廣譜性）無顯著性差異。著性差異。v國產(chǎn)的兩種培養(yǎng)基不比國產(chǎn)的兩種培養(yǎng)基不比BD公司生產(chǎn)的胰酪大豆公司生產(chǎn)的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基胨液體培養(yǎng)基(TSB)質量差。質量差。212015版無菌檢驗用培養(yǎng)基的修訂版無菌檢驗用培養(yǎng)基的修訂2010年版2015年版硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基3035；2025 （三部）改良馬丁培養(yǎng)基置2328 培養(yǎng)硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

15、3035；2025 （生物制品兩種溫度）胰酪大豆胨肉湯培養(yǎng)基（TSB)置2025 培養(yǎng)選擇性培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基0.5%葡萄糖肉湯培養(yǎng)基胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基222015版無菌檢查法修訂版無菌檢查法修訂v增訂了無菌檢查法所用培養(yǎng)基的性能定義增訂了無菌檢查法所用培養(yǎng)基的性能定義 “硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（FTG）是厭氧菌檢查的首選培養(yǎng)基，同時也可用于需氣菌檢查。” “胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）適用于真菌和需氣菌的檢查?！奔茨撤N污染了需氣菌的供試品，無論被接種在硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基

16、（FTG）中還是被 接種在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）中均可被檢出。意義：糾正了微生物學檢查中長期存在的對微生物分類培養(yǎng)的概念，提高污染微生物的檢出率，與先進國家藥典保持一致。23根據(jù)培養(yǎng)基的調(diào)整所做的相關調(diào)整根據(jù)培養(yǎng)基的調(diào)整所做的相關調(diào)整培養(yǎng)基修訂培養(yǎng)基修訂培養(yǎng)基靈敏培養(yǎng)基靈敏度檢查及方度檢查及方法適用性試法適用性試驗中的修訂驗中的修訂菌液制備用培菌液制備用培養(yǎng)基的修訂養(yǎng)基的修訂硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（大腸埃希菌）、生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌（大腸埃希菌）、生孢梭菌胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉胰酪大豆胨液

17、體培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉24三部藥典無菌檢查方法的整合修訂三部藥典無菌檢查方法的整合修訂v整合中的焦點：整合中的焦點： 三部無菌檢查法中規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)三部無菌檢查法中規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基必須分成雙份，分別置基必須分成雙份，分別置3035、2025 兩個溫度兩個溫度下培養(yǎng)。以致在下培養(yǎng)。以致在取樣量取樣量、檢驗量檢驗量、接種方式接種方式、培養(yǎng)溫培養(yǎng)溫度度、陽性對照試驗陽性對照試驗等方面存在與二部不一致的規(guī)定。等方面存在與二部不一致的規(guī)定。25國際上生物制品無菌檢查法的情況國際上生物制品無菌檢查法的情況v美國美國FDA（May2001）和歐盟（）和歐盟

18、（March1999）均早已接受藥典無菌檢查法適用于生物技術產(chǎn)均早已接受藥典無菌檢查法適用于生物技術產(chǎn)品及生物制品（見品及生物制品（見ICH Q6B生物技術產(chǎn)品生物技術產(chǎn)品/生物生物制品檢定規(guī)程及標準）。制品檢定規(guī)程及標準）。vUSP、EP、BP、JP及ICH的無菌檢查法中均沒有對生物制品作出特殊的規(guī)定。26v分歧出現(xiàn)在我國對分歧出現(xiàn)在我國對WHO 6號規(guī)程的引用號規(guī)程的引用上。從可以查到的上。從可以查到的中國生物制品規(guī)程中國生物制品規(guī)程1979年版開始，規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽年版開始，規(guī)定樣品接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基雙份置雙溫度下分別培養(yǎng)。流體培養(yǎng)基雙份置雙溫度下分別培養(yǎng)。v 這一規(guī)定一直被

19、延續(xù)到這一規(guī)定一直被延續(xù)到2010年版三部的年版三部的無菌檢查法，成為長達無菌檢查法，成為長達35年的我國生物制年的我國生物制品無菌檢查法的特殊規(guī)定。品無菌檢查法的特殊規(guī)定。 27整合調(diào)查整合調(diào)查v 據(jù)反映，歷史上個別地區(qū)在生物制品無菌檢查中曾經(jīng)發(fā)據(jù)反映，歷史上個別地區(qū)在生物制品無菌檢查中曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)個別品種在現(xiàn)個別品種在2025 培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中有菌生長的情況（但未作鑒定和溯源明確是什么菌）。有菌生長的情況（但未作鑒定和溯源明確是什么菌）。v 從微生物適宜培養(yǎng)條件分析從微生物適宜培養(yǎng)條件分析 嗜熱型需氧菌適宜生長溫度為4558； 嗜溫型需氧菌適宜生長溫度為

20、2044； 嗜冷型需氧菌適宜生長溫度為1018；疑點和疑問：疑點和疑問：陽性產(chǎn)品實驗操作中是否有確保無污染的證明？陽性產(chǎn)品實驗操作中是否有確保無污染的證明？是否存在未知的是否存在未知的厭氧菌厭氧菌必須在必須在2025 培養(yǎng)才能生長？培養(yǎng)才能生長？在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基在胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基2025 下培養(yǎng)能不能被檢出？下培養(yǎng)能不能被檢出？28v修訂原則修訂原則 以國際發(fā)展趨勢為主導，遵照以國際發(fā)展趨勢為主導，遵照2015年版藥典編制大年版藥典編制大綱三部藥典必須整合的要求進行，以二部為基礎，在綱三部藥典必須整合的要求進行，以二部為基礎，在檢驗數(shù)量、檢驗量、陽性對照樣品量、陽性對照試驗檢驗數(shù)量、

21、檢驗量、陽性對照樣品量、陽性對照試驗方法、培養(yǎng)溫度等方面互相兼顧，作原則性要求而不方法、培養(yǎng)溫度等方面互相兼顧，作原則性要求而不作具體細則規(guī)定。作具體細則規(guī)定。 致力于今后逐步統(tǒng)一完善。致力于今后逐步統(tǒng)一完善。 29無菌檢查法其他主要的修訂無菌檢查法其他主要的修訂2010年版2015年版薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄薄膜過濾法應優(yōu)先采用封閉式薄膜過濾器，也可使用一般過濾器。膜過濾器，也可使用一般過濾器。薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。薄膜過濾法應采用封閉式薄膜過濾器。直接接種法即取規(guī)定量供試品分直接接種法即取規(guī)定量供試品分別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培別等量接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和改良馬丁培

22、養(yǎng)基中養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基中直接接種法適用于無法用薄膜過濾法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。進行無菌檢查的供試品。即取即取;除除生物制品外，一般樣品兩種培養(yǎng)基接生物制品外，一般樣品兩種培養(yǎng)基接種的支種的支/ /瓶數(shù)相等；生物制品硫乙醇酸瓶數(shù)相等；生物制品硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基接種的支基接種的支/ /瓶數(shù)為瓶數(shù)為2:12:1不能從外觀上判斷有無微生物生不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量接種至同長，可取該培養(yǎng)液適量接種至同種新鮮培養(yǎng)基中，種新鮮培養(yǎng)基中，細菌培養(yǎng)細菌培養(yǎng)2天、天、真菌培養(yǎng)真菌培養(yǎng)3天。天。不能從

23、外觀上判斷有無微生物生長，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量接種至同種新鮮培可取該培養(yǎng)液適量接種至同種新鮮培養(yǎng)基中，養(yǎng)基中，培養(yǎng)培養(yǎng)3天天。30312015年版中國藥典微生物限度檢查法修訂年版中國藥典微生物限度檢查法修訂非無菌藥品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法微生物計數(shù)法非無菌藥品微生物限度檢查：非無菌藥品微生物限度檢查：控制菌檢查法控制菌檢查法非無菌藥品微生物限度標準非無菌藥品微生物限度標準參照參照USP35版和版和版對版對微生物限度微生物限度檢查法檢查法收載形式收載形式進行了修訂，將進行了修訂，將其分為三個附錄：其分為三個附錄：32微生物限度檢查法實驗

24、環(huán)境的變化微生物限度檢查法實驗環(huán)境的變化2010年版2015年版應在潔凈度10000級背景下的局部100級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行。應在受控潔凈環(huán)境下（不低于D級）的局部不低于B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進行?？偟脑瓌t：總的原則： 無外源性微生物污染樣品無外源性微生物污染樣品 樣品的微生物檢測環(huán)境不低于樣品的生產(chǎn)環(huán)境樣品的微生物檢測環(huán)境不低于樣品的生產(chǎn)環(huán)境33微生物限度檢查法技術方法適用范圍變化微生物限度檢查法技術方法適用范圍變化2010年版2015年版系檢查非滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)明確規(guī)定本檢查法不適用于活菌制劑的檢查明確規(guī)

25、定本檢查法可采用替代檢查方法，包括自動化檢測方法，但必須證明其替代方法等效于藥典規(guī)定的檢查方法。嗜溫型微生物最適生長溫度為嗜溫型微生物最適生長溫度為20 44（ 2543）金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌最適生長溫度為37白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為白色念珠菌、黑曲霉最適生長溫度為2834微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂微生物限度檢查法試劑和試藥的修訂v試劑和試藥試劑和試藥 中和劑、滅活劑和表面活性劑均應對微生物無毒性，其相互間具有相容性，有利于樣品中微生物均勻分布。 v稀釋液稀釋液 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液； pH7.2

26、無菌磷酸鹽緩沖液； 無菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）； 無菌磷酸鹽緩沖液（結腸溶制劑）； 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基不限于上述稀釋液（如0.9%無菌氯化鈉溶液）35微生物限度檢查計數(shù)法微生物限度檢查計數(shù)法修訂前修訂前大腸埃希菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉試驗菌株試驗菌株修訂后修訂后銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌白色念珠菌黑曲霉黑曲霉36微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)基和試驗菌的修訂微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)基和試驗菌的修訂2010年版2015年版營養(yǎng)瓊脂：營養(yǎng)瓊脂： 大腸埃希菌大腸埃希菌 金

27、黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌玫瑰紅鈉瓊脂：玫瑰紅鈉瓊脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉胰酪胨大豆瓊脂：胰酪胨大豆瓊脂： 金黃色葡萄球菌金黃色葡萄球菌 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉沙氏葡萄糖瓊脂：沙氏葡萄糖瓊脂： 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉37微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)溫度和時間的修訂微生物限度檢查計數(shù)法培養(yǎng)溫度和時間的修訂2010年版2015年版細菌數(shù) 營養(yǎng)瓊脂 3035 3天 霉菌及酵母菌數(shù) 玫瑰紅鈉瓊脂 2328 5天需氧菌總數(shù) 胰酪胨大豆瓊脂 3035 35天霉菌及酵母菌數(shù) 沙氏葡萄糖瓊脂 20

28、25 57天38微生物限度檢查計數(shù)法接種方法的修訂微生物限度檢查計數(shù)法接種方法的修訂2010年版2015年版1、平皿傾注法2、薄膜過濾法1、平皿法（包括傾注法和涂布法），平皿法（包括傾注法和涂布法），明確可使用直徑較大的平皿，且培養(yǎng)基的用量應相應增加。2、薄膜過濾法薄膜過濾法3、最可能數(shù)最可能數(shù)（Most-Probable-Number,簡稱MPN）。MPN法用于微生物計數(shù)時精密度較差，但對于某些微生物污染量很小的供試品可能是更適合的方法。MPN法僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，且不適用于霉菌計數(shù)。39微生物限度檢查計數(shù)法方法的修訂微生物限度檢查計數(shù)法方法的修訂2010年版2

29、015年版術語變化術語變化：計數(shù)方法驗證細菌計數(shù)法細菌計數(shù)法用三種菌種進行驗證菌液加入方式菌液加入方式：平皿計數(shù)驗證時菌液和供試液同時加入平皿，加菌量10100cfu術語變化術語變化：計數(shù)方法適用性試驗總需氧菌計數(shù)法總需氧菌計數(shù)法用五種菌種試驗菌液加入方式菌液加入方式：菌液加入供試液中，使每ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu,且所加菌液的體積不超過供試液體積的1%。40適用性試驗加入方式舉例：適用性試驗加入方式舉例：各試驗組溶液各試驗組溶液分裝分裝5份份每份每份金黃色葡萄球菌液金黃色葡萄球菌液銅綠假單胞菌液銅綠假單胞菌液枯草芽孢桿菌液枯草芽孢桿菌液白色念珠菌液白色念珠

30、菌液黑曲霉菌液黑曲霉菌液41微生物限度檢查計數(shù)法檢測項目及結果判斷的修訂微生物限度檢查計數(shù)法檢測項目及結果判斷的修訂2010年版2015年版細菌數(shù)細菌數(shù)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌數(shù)霉菌和酵母菌數(shù)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基酵母菌數(shù)酵母菌數(shù)酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基需氧菌總數(shù)需氧菌總數(shù)生長在胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上所有菌落（包括霉菌和酵母菌）霉菌和酵母菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)指生長在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上的所有菌落（包括細菌菌落數(shù)）?；厥章驶厥章剩?0%以上回收率回收率：0.5-2（50%-200%）42微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷有計數(shù)干擾情況時的修訂微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷有計數(shù)干擾情況時的修訂20

31、10年版2015年版若營養(yǎng)瓊脂上生長霉菌與酵母菌、玫瑰紅鈉上生長細菌，則分別點計霉菌和酵母菌、細菌數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂上霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉上細菌數(shù)與玫瑰紅鈉上霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂上細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中菌數(shù)為計數(shù)結果。若因沙氏葡萄糖瓊脂上生長的細菌使霉菌及酵母菌的計數(shù)結果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素)的沙氏葡萄糖瓊脂或選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂）。43微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷的修訂微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷的修訂2010年版2015年版供試品的細菌數(shù)、霉菌數(shù)和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試

32、兩次，以三次結果的平均值報告菌數(shù)。無相關內(nèi)容描述，因微生物試驗的特殊性，在實際操作過程中應依據(jù)附錄藥品微生物實驗室質量管理指導原則對實驗結果進行充分和全面的評價。44微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷增訂內(nèi)容微生物限度檢查計數(shù)法結果判斷增訂內(nèi)容2010年版2015年版無各品種項下要求執(zhí)行的微生物限度標準如下：101cfu 可接受的最大限度為20；102cfu 可接受的最大限度為200；103cfu 可接受的最大限度為2000；依次類推.若供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)的檢查結果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。45微生物限度檢查

33、控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸埃希菌大腸菌群大腸菌群沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌大腸埃希菌耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌沙門菌銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌梭菌白色念珠菌46微生物限度檢查控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版大腸菌群方法驗證用大腸埃大腸菌群方法驗證用大腸埃希菌進行驗證希菌進行驗證耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌用大腸耐膽鹽革蘭氏陰性桿菌用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌進行方埃希菌和銅綠假單胞菌進行方法適用性試驗法適用性試驗加菌量：加菌量：1010100cfu100cfu加菌量：不大于加菌量：不大

34、于100cfu100cfu47微生物限度檢查控制菌檢查的修訂微生物限度檢查控制菌檢查的修訂2010年版2015年版?zhèn)鹘y(tǒng)的鑒別試驗為主個體形態(tài)、菌體形態(tài)生理生化反應生態(tài)學特征血清學反應對噬菌體及抗生素的敏感性用傳統(tǒng)的鑒別試驗或采用其它適宜的方法進行鑒別分子生物學技術應用（溯源分析）482015版微生物限度標準的修訂版微生物限度標準的修訂將2010版中國藥典一、二、三部微生物限度標準項目進行對比、整合。采用一部的限度標準項目作為合并后限度標準的基礎。修訂思路修訂思路與美、歐、日藥與美、歐、日藥典比較，修訂中國典比較，修訂中國藥典的微生物限度藥典的微生物限度標準。標準。采用清晰直觀的表格形式，按給藥

35、途徑，分液體、固體性質，列出各類藥品的限度標準。49修訂后限度標準的總體結構及規(guī)定（共修訂后限度標準的總體結構及規(guī)定（共9項，項，4個表）個表）1、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規(guī)定。、制劑通則、品種項下要求無菌的制劑及標示無菌的制劑和原輔料應符合無菌檢查法規(guī)定。2、用于手術、燒傷或嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查規(guī)定、用于手術、燒傷或嚴重創(chuàng)傷的局部給藥制劑應符合無菌檢查規(guī)定3、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準（見表、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準（見表1）4、非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表、非無菌不含藥

36、材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表1）5、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準（見表2）6、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準（見表3）7、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準（見表4）8、有兼用途徑的制劑應符合各給藥途徑的標準、有兼用途徑的制劑應符合各給藥途徑的標準9、霉變、長螨者以不合格論、霉變、長螨者以不合格論限限度度標標準準50v表表1、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度標準及非無菌不含藥材原粉的、非無菌化學藥品及生物制品制劑的微生物限度

37、標準及非無菌不含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準中藥制劑微生物限度標準v表表2、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準、非無菌含藥材原粉的中藥制劑微生物限度標準v表表3、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準、非無菌的藥用原料及輔料微生物限度標準v表表4、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準、中藥提取物及中藥飲片的微生物限度標準需氧微生物總數(shù)（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)（cfu/g或cfu/ml)控制菌藥用原料、輔料103102未作統(tǒng)一規(guī)定需氧微生物總數(shù)（cfu/g或cfu/ml)霉菌和酵母菌總數(shù)（cfu/g或cfu/ml)控制菌中藥提取物103102未作統(tǒng)一規(guī)定中藥飲片未作統(tǒng)

38、一規(guī)定未作統(tǒng)一規(guī)定不得檢出沙門菌（10g)耐膽鹽革蘭陰性菌應小于104（1g)51微生物檢測體系及藥品微生物檢驗的關鍵點微生物檢測體系及藥品微生物檢驗的關鍵點環(huán)境保證環(huán)境保證培養(yǎng)基保證培養(yǎng)基保證藥品微生物藥品微生物實驗室規(guī)范實驗室規(guī)范指導原則指導原則潔凈實驗室微生物潔凈實驗室微生物控制和監(jiān)測指導原則控制和監(jiān)測指導原則無菌檢查隔離無菌檢查隔離系統(tǒng)指導原則系統(tǒng)指導原則SOP操作操作有效的方法有效的方法方法適用性（驗證）方法適用性（驗證）有效的結果有效的結果可靠的結論可靠的結論結果判斷結果判斷無菌性檢查無菌性檢查靈敏度檢查靈敏度檢查對照培養(yǎng)基對照培養(yǎng)基藥品微生物檢驗藥品微生物檢驗替代方法驗證替代方法

39、驗證指導原則指導原則微生物檢查微生物檢查法指導原則法指導原則522015版藥典修訂的基本目標版藥典修訂的基本目標v2015年版中國藥典微生物檢驗標準體系將推動年版中國藥典微生物檢驗標準體系將推動藥品微生物實驗室從一個簡單的藥品微生物實驗室從一個簡單的終產(chǎn)品檢驗終產(chǎn)品檢驗實實驗室向驗室向微生物風險調(diào)查分析型微生物風險調(diào)查分析型實驗室方向發(fā)展。實驗室方向發(fā)展。 案例介紹53v氟康唑注射液生物負荷偏差調(diào)查及處理氟康唑注射液生物負荷偏差調(diào)查及處理v 2011年7月，在進行趨勢分析時，發(fā)現(xiàn)有5批 氟康唑注射液灌裝后生物負荷監(jiān)測有超限趨勢，經(jīng)過初步評估后，負責污染問題的委員會決定啟動偏差調(diào)查，查明導致產(chǎn)生

40、污染的根本原因、確定和實施相關預防措施，并監(jiān)測其有效性。54v （1）確定調(diào)查范圍：根據(jù)產(chǎn)品發(fā)生情況和調(diào)查時間，）確定調(diào)查范圍：根據(jù)產(chǎn)品發(fā)生情況和調(diào)查時間，調(diào)查相關批號調(diào)查相關批號206個。個。v （2）鑒定：根據(jù)細菌鑒定，氟康唑注射液瓶中的微生）鑒定：根據(jù)細菌鑒定，氟康唑注射液瓶中的微生物有兩種：一種為水里存在的微生物，一種為環(huán)境存在物有兩種：一種為水里存在的微生物，一種為環(huán)境存在的微生物。的微生物。v （3）調(diào)查發(fā)生原因：一是注射用水連接管路在技術夾）調(diào)查發(fā)生原因：一是注射用水連接管路在技術夾層中有一個低點，有存水；二是洗瓶間的一個空氣過濾層中有一個低點，有存水；二是洗瓶間的一個空氣過濾器檢漏有問題。器檢漏有問題。 制定改正措施55v 改正措施改正措施1-管路坡度修正：管路用管路坡度修正：管路用5%NaOH進行鈍化、進行鈍化、滅菌；灌裝前增加一個過濾器；增加灌裝前后取樣檢測滅菌；灌裝前增加一個過濾器；增加灌裝前后取樣檢測頻次；注射用水循環(huán)管路每周滅菌一次。頻次；注射用水循環(huán)管路每周滅菌一次。v 改正措施改正措施2-更換過濾器：用更換過濾器：用m m的過濾器取代的過濾器取代m m的過濾器。的過濾器。v 改正措施改正措施3 3-注射劑產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的各個階段進行微注射劑產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的各個階段進行微生物檢測，以核