脂肪酶產(chǎn)生菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)綿陽(yáng)師范學(xué)院本科生畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題 目 脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2 發(fā)酵條件的優(yōu)化 專 業(yè) 生 物 技 術(shù) 院 部 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 學(xué) 號(hào) 姓 名 杜 長(zhǎng) 蔓 指 導(dǎo) 教 師 李 俊 剛 答 辯 時(shí) 間 2012 年 5 月 論文工作時(shí)間：2011 年 7 月 至 2012 年 5 月精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2 發(fā)酵條件的優(yōu)化學(xué) 生：杜長(zhǎng)蔓指導(dǎo)老師：李俊剛摘 要：本文對(duì)綿陽(yáng)師范學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室篩選和鑒定的產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌M-6-2的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究；通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對(duì)脂肪酶產(chǎn)生菌M-6-

2、2 搖床發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得出較佳的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成配方為：1.5%淀粉+0.5%酵母膏為碳源、 4.5%豆餅粉+1.5%硝酸銨為最佳的氮源、0.05%磷酸氫二鈉和0.15%硫酸鎂；最優(yōu)的發(fā)酵條件為：初始pH7.5，接種量1.5 %，裝液量20ml/250ml，發(fā)酵溫度35，在轉(zhuǎn)速180r/min下，培養(yǎng)16h，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后發(fā)酵液脂肪酶酶活力最高可達(dá)到15.60 U/ml,較優(yōu)化前提高了49.57%。脂肪酶產(chǎn)生菌M-6-2與國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道的產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌相比產(chǎn)酶活力高。對(duì)該菌株發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后，為生產(chǎn)性試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2；脂肪酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

3、；正交試驗(yàn)；精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)Lipase to produce bacteria M-6-2 Optimization of fermentation conditionsUndergraduate: Du ChangmanSupervisor: Li Jun GangAbstract: In this paper, Laboratory screening and identification of lipase production by bacteria in the M-6-2 growth kinetics and enzyme production kin

4、etics were studied; through single factor experiments and orthogonal test, the lipase to produce bacteria M-6-2 shaker fermentation lipase medium composition and culture conditions were optimized to come to a better enzyme production medium composition formula: 1.5% starch and 0.5% yeast extract as

5、carbon source, 4.5% of the soybean powder and 1.5% ammonium nitrate for the best source of nitrogen, 0.05% disodium hydrogen phosphate and 0.15% magnesium sulfate. Optimal fermentation conditions were: initial pH 7.5, 1.5% of the inoculum size, liquid volume 20ml/250ml, fermentation temperature 35 C

6、, in the speed 180r/min next, cultured 16h After optimization of the fermentation broth lipase activity can reach 49.57% to 15.60 U / ml, compared to before optimization. Lipase to produce bacteria M-6-2 and reported in China in the production of lipase bacteria compared to the high activity of enzy

7、me production. Of the strain fermentation conditions optimized, laid the foundation for the production of test.Key words: Lipase producing strain M-6-2；lipase ；fermentation conditions；optimization ；orthogonal test 精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)目 錄精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)1 前言1.1 脂肪酶的概況脂肪酶酶EC

8、 3.1.1.3又稱三?；视王；饷福╝cylglycerol hydrolases）1，是一類具有多種催化能力的酶，廣泛存在于動(dòng)植物、植物及微生物中。脂肪酶具有多種催化能力，能夠催化酯類的醇解，水解，轉(zhuǎn)酯，酯化化及酯類的逆向合成反應(yīng)23456。除此之外，還表現(xiàn)出其他一些酶的活性，如磷脂酶、膽固醇酯酶、溶血磷脂酶、酰肽水解酶活性等。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換，它具有化學(xué)選擇性和立體異構(gòu)專一性，反應(yīng)不需要輔酶，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，因此被廣泛的應(yīng)用于輕紡、食品、皮革、化妝品、香料、醫(yī)藥、有機(jī)合成、洗滌劑 、污水處理等7

9、。微生物脂肪酶種類多、易發(fā)生遺傳與變異，繁殖快，pH 值范圍及作用溫度比動(dòng)植物脂肪酶廣，而且底物專一性高，而且微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，便于工業(yè)生產(chǎn)以獲得較高純度的酶制劑，已成為工業(yè)生產(chǎn)脂肪酶的主要來(lái)源，并在理論援救方面也具有重要的意義。脂肪酶是一種特殊的酯鍵水解酶，它可作用于甘油三酯的酯鍵，使甘油三酯降解為 單酯油酯、甘油二酯、脂肪酸和甘油。作為一種高效無(wú)污染的脫脂劑，脂肪酶在皮革脫脂工藝上尤其具有重要的用途，它可以把不易皂化，難溶于水的脂肪分解為易溶于水的脂肪酸和甘油，且在堿性條件下使得脂肪更容易從皮中除去。與傳統(tǒng)的乳化法、皂化法和溶劑法脫脂相比較，酶法脫脂皮板柔軟，對(duì)皮革

10、質(zhì)量有明顯的提高。脂肪酶還可以作為臨床診斷胰腺炎、脂血病等疾病的依據(jù)之一，市場(chǎng)上也已經(jīng)有作血脂分析用的酶制劑出售。屠宰場(chǎng)、餐飲業(yè)、奶制品加工廠等產(chǎn)生的廢水中富含易生物降解的有機(jī)物和難生物降解的油脂。普通餐飲廢水中油脂含量為 100 831 mg/L8，如果不經(jīng)處理直接排放，會(huì)造成環(huán)境的嚴(yán)重污染。油脂漂浮在水面形成油膜，阻礙氧氣傳輸，從而威脅水生動(dòng)植物的生存9。目前的油脂廢水處理工藝有生態(tài)處理和生物處理。生物處理技術(shù)包括厭氧、好氧以及二者組合工藝。采用生物反應(yīng)器處理油脂廢水時(shí)，油脂包裹在污泥表面，阻礙了傳質(zhì)作用，降低了底物轉(zhuǎn)化速率10；此外，反應(yīng)器中絲狀菌大量繁殖，油脂附著在污泥表面，造成污泥沉

11、降困難，易導(dǎo)致活性污泥的大量流失。在上述情況下，反應(yīng)器會(huì)出現(xiàn)惡臭氣味溢散和堵塞等運(yùn)行問(wèn)題。采用人工濕地等生態(tài)法處理油脂廢水也很容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象11。目前，成熟的油脂降解技術(shù)尚未出現(xiàn)，而國(guó)家規(guī)定的污水排放標(biāo)準(zhǔn)日益嚴(yán)格，油脂廢水處理技術(shù)的改進(jìn)非常需要。 對(duì)于飲食習(xí)慣中，油占重要部分的國(guó)家，油脂廢水處理難題尤為突出。由于微生物資源豐富，生產(chǎn)不受自然環(huán)境的影響，可用人工控制來(lái)大量生產(chǎn)目的酶，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)酶周期短，是一種經(jīng)濟(jì)而實(shí)用的方法。脂肪酶在微生物界分布很廣，土壤是微生物的大本營(yíng)，不同土壤中的微生物所產(chǎn)生脂肪酶精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)性能不盡相同。其產(chǎn)生菌主要是 細(xì)菌和霉菌 12

12、。已經(jīng)公布的適用于甘油三酯加工的不同來(lái)源的脂肪酶有 33 種，其中 7 種是細(xì)菌，18 種是霉菌。目前報(bào)道的用于產(chǎn)生脂肪酶的微生物主要有無(wú)根根霉(Rhizopus arrhizus)13、擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)14、假絲酵母(Candidarugosa)15、假單孢菌(Pseudomonas sp.)16等, 其中從根霉菌中已分離到 30 多種脂肪酶, 且有多種根霉脂肪酶已被制成商品化酶制劑17。1.2 國(guó)內(nèi)外脂肪酶的研究概況脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發(fā)的合成和水解反應(yīng)，這些反應(yīng)通常具有對(duì)映選擇性，區(qū)域性或，高底物專一性，使脂肪酶成為有機(jī)合成中重要的生

13、物催化劑。近年來(lái)，微生物脂肪酶在各種不同行業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，主要是利用脂肪酶的水解反應(yīng)，水解反應(yīng)是指脂肪酶催化脂肪或脂水解為其組成脂肪酸和甘油或醇，以此應(yīng)用脂肪酶的方面及行業(yè)包括：污水處理、脂肪酸提純、脂肪水解、甘油酯結(jié)構(gòu)的測(cè)定、生產(chǎn)紙漿和造紙、皮革、加酶洗滌劑、醫(yī)學(xué)應(yīng)用、食品成分、底紙脫墨等；其次，應(yīng)用脂肪酶合成作用的包括低中相對(duì)分子質(zhì)量聚脂、脂、手性化合物的合成、藥物、油脂改性和化妝品等。2003年，中國(guó)極地研究中心的俞勇18等，從南極喬治王島凍土來(lái)源的76 株低溫細(xì)菌中，篩選到13 株低溫脂肪酶產(chǎn)生菌,并對(duì)其中的BTs10022 菌株進(jìn)行了鑒定和酶學(xué)性質(zhì)的初步研究；2004 年邵鐵娟1

14、9等對(duì)渤海海泥中篩選到的一株產(chǎn)低溫脂肪酶微生物進(jìn)行了菌種鑒定及產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件的研究；2006 年,張金偉20等從南極普里茲灣深海沉積物中篩選到一株產(chǎn)低溫脂肪酶菌株7195 ,并對(duì)其進(jìn)行了鑒定和初步分離純化；其中南極假絲酵母脂肪酶B 的污水處理方面用途最為廣泛，該酶從南極假絲酵母( Candida antarctica) 中分離得到，對(duì)非水溶性和水溶性物質(zhì)都有極強(qiáng)的催化活性21；Cihangir 和Sarikaya22從土耳其土樣中分離了一株曲霉菌，在pH 5.5、溫度30 下培養(yǎng)96 h 獲得了酶活為17U/ml的脂肪酶；Azeredo 等23針對(duì)青霉菌展開液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵研究，在pH 5

15、.5、溫度30 下液態(tài)發(fā)酵96 h 獲得了酶活為12 U/ml 的脂肪酶，而在濕度70%、溫度30下固態(tài)發(fā)酵24 h 獲得了酶活為17 U/g的脂肪酶。盡管目前已經(jīng)對(duì)脂肪酶產(chǎn)生菌展開了一些研究,但有關(guān)產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌的報(bào)道還不多,作者從自然界中分離和篩選得到一株產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌M-6-2,顯示其可以分泌脂肪酶的高產(chǎn)菌株,故對(duì)其產(chǎn)酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。使其產(chǎn)酶活力更高，為生產(chǎn)性試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。1.3 本研究的目的及意義 隨著對(duì)脂肪酶研究的日益深入，其應(yīng)用領(lǐng)域正日漸拓寬，與此相應(yīng)，新型脂肪酶的研究開發(fā)就備受關(guān)注24。通過(guò)對(duì)原有脂肪酶改進(jìn)或?qū)赀M(jìn)行優(yōu)化培養(yǎng)可得到新型的脂肪酶25。本研究的具體目標(biāo)是對(duì)產(chǎn)脂肪酶

16、的細(xì)菌 M-6-2 發(fā)酵條件的優(yōu)化，為中試、生產(chǎn)性試驗(yàn)提供參考數(shù)據(jù)，從而提高其產(chǎn)脂肪酶酶活力，精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)使其產(chǎn)酶達(dá)到國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平。該菌種如果應(yīng)用于生產(chǎn)，將對(duì)屠宰廠、肉聯(lián)廠、大型食堂等含油脂的污水廠廢水處理帶來(lái)巨大的社會(huì)效益和環(huán)境生態(tài)效益。2 實(shí)驗(yàn)材料和器具2.1 實(shí)驗(yàn)菌種本實(shí)驗(yàn)采用從綿陽(yáng)六里村屠宰場(chǎng)廢水溝的污泥中篩選和鑒定出的的脂肪酶高產(chǎn)菌株 M-6-2。2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 移液管（10ml） ；磁力攪拌器；酸式滴定管（25ml） ；堿式滴定管（25ml） ； SPX-250B-生化培養(yǎng)箱（上?？等A生化儀器制造廠出產(chǎn)） ； HZ-9311K 恒溫振蕩器（金壇市

17、新航儀器廠出產(chǎn)） ； SP-DJ 系列超凈工作臺(tái)（吳江市凈化設(shè)備總廠出產(chǎn)） ； 手提式高壓滅菌鍋（上海三中醫(yī)療器械有限公司出產(chǎn)） ； 申溢牌電熱不繡鋼蒸餾水器（上海三中醫(yī)療器械有限公司出產(chǎn)） ；冰箱（BCD-216E/BN 海爾集團(tuán)公司） ；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9053A 型 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司） ； 高速冷凍離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司廣州分公司） ； 電子萬(wàn)用爐（220V.AC 1000W，北京市永光明醫(yī)療儀器廠） ；FA1104A 電子天平（上海精天電子儀器有限公司） ；Sartorius BP211D 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；HHS-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海

18、康華生化儀器制造有限公司） ；721 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Amersham biosciences） ；2.3 實(shí)驗(yàn)試劑a) 0.05mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：稱取分析純的氫氧化鈉 4.5g 用蒸餾水溶解定容至 1000ml（約 0.1mol/L 氫氧化鈉） ，用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定，然后再用蒸餾水稀釋至 0.05mol/L。儲(chǔ)存于附有鈉石灰管的玻璃瓶中；b) 2%的聚乙烯醇溶液：取 20g 聚乙烯醇加蒸餾水約 1000mL，水浴加熱至溶，冷卻后定容至 1000mL，配成 2%的聚乙烯醇溶液，雙層紗布過(guò)濾備用；c) 聚乙烯醇橄欖油乳化液：將橄欖油與上述 2%的聚乙烯醇溶液以 1：3 的

19、比例混合。用高速組織搗碎機(jī)處理 6min，分兩次，每次 3min，間隔 5min，即成乳白色聚乙烯醇橄欖油乳化液；d) 酚酞試劑：稱取酚酞 0.1g，溶于 250ml 90%的乙醇中；e) 丙酮乙醇混合液：將丙酮和乙醇按 1:1 混合；精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)f) 磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH7.5）：0.2 mol/L 磷酸氫二鈉 84ml，0.2 mol/L 磷酸二氫鈉 16ml，加蒸餾水稀釋至 200ml。2.4 培養(yǎng)基26斜面培養(yǎng)基：0.2% NaNO3，0.1% Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4，3%蔗糖，1.

20、5%-2.0%瓊脂。種子培養(yǎng)基：0.5%葡萄糖，2%黃豆餅粉，0.5%酵母膏，1% NaNO3，0.1% Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基：4%黃豆餅粉，1%橄欖油，1% NaCl，0.1% Na2HPO4，0.05%KCl，0.05% MgSO4，0.001% FeSO4。3 實(shí)驗(yàn)流程4. 實(shí)驗(yàn)方法4.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定27（1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取 0.

21、5ml菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 13 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，即 30 , 180 r /min；（5）每隔 4h 拿出一瓶(包括 0h)，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在 560nm 處測(cè)吸光度值，填入下列表 1-1；（6）以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作生長(zhǎng)曲線。表 1-1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Table 1-1 Determination of growth curve培養(yǎng)時(shí)間/h081624324048566472808896OD 值實(shí)驗(yàn)流程實(shí)驗(yàn)流程生長(zhǎng)曲線的測(cè)定脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肪酶培養(yǎng)基的優(yōu)化產(chǎn)酶曲線的測(cè)定菌體生長(zhǎng)條件的確定精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情

22、為你奉上專心-專注-專業(yè)4.2 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定(1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取 0.5ml菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 13 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，即 30 , 180 r /min；（5）每隔 4h 取出一瓶(包括 0h)，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，并填入下列表 1-2；（6）以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以酶活力為縱坐標(biāo)，繪制出產(chǎn)酶曲線。表 1-2 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定able 1-2 for enzyme pro

23、duction curve determination培養(yǎng)時(shí)間/h04812162024283236404448酶活/U4.3 脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2 菌體生長(zhǎng)的最佳條件的確定4.3.1 pH 對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響（1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取 0.5ml菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 11 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，其中 pH 值，分別為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5

24、、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0（根據(jù)初篩和復(fù)篩確定） ，即 30 , 180 r /min；（5）放在相同的條件下培養(yǎng) 24h 后，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在 560nm 處測(cè)吸光度值，填入下列表 1-3；（6）以培養(yǎng)的 pH 值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作曲線。表 1-3 生長(zhǎng)最佳 pHTable 1-3 growth optimum pH培養(yǎng)pH 值4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0OD 值4.3.2 溫度對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響（1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，

25、培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取0.5ml 菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 11 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，其中溫度分別為 20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40（根據(jù)初篩和復(fù)篩確定） ， 180 r /min；精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)（5）放在相同的條件下培養(yǎng) 24h 后，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在 560nm處測(cè)吸光度值，填入下列表 1-4；（6）以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作曲線。表 1-4 生長(zhǎng)最佳溫度Table 1-4 optimum growth

26、 temperature培養(yǎng)溫度2022242628303234363840OD值4.3.3 裝液量對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響（1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取 0.5ml菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 11 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，其中裝液量，分別為每 250ml 三角瓶中為10ml、12ml、14ml、16ml、18ml、20ml、22ml、24ml、26ml、28ml、30ml（根據(jù)初篩和復(fù)

27、篩確定） ，30 ，180 r /min；（5）放在相同的條件下培養(yǎng) 24h 后，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在 560nm 處測(cè)吸光度值，填入下列表 1-5；（6）以培養(yǎng)的 pH 值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作曲線表 1-5 裝液量的影響Table 1-5 installed the influence of the fluid volume裝液量/ml1012141618202224262830OD值4.3.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響（1）制配種子培養(yǎng)基和初始發(fā)酵培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min，備用；（2）將受試菌種在斜面培養(yǎng)基上活化，培養(yǎng)成熟；（3）從成熟斜面上挑取

28、 5 環(huán)菌苔或孢子接入 7ml 無(wú)菌水中，搖勻，吸取 0.5ml菌懸液接發(fā)酵培養(yǎng)基中，一共接 7 瓶；（4）將三角瓶放入搖床上，在復(fù)篩確定的適合的條件下培養(yǎng)，其中搖床轉(zhuǎn)速，分別為 160 r /min、170 r /min、180 r /min、190 r /min、200 r /min、210 r /min、220 r /min（根據(jù)初篩和復(fù)篩確定） ，30；（5）放在相同的條件下培養(yǎng) 24h 后，以不接種的培養(yǎng)基作對(duì)照，在 560nm 處測(cè)吸光度值，填入下列表 1-6；（6）以培養(yǎng)的 pH 值為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作曲線。表 1-6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響Table

29、1-6 of the rotation speed of the M-6-2 cell growth精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)搖床轉(zhuǎn)速r/min160170180190200210220OD 值4.4 脂肪酶培養(yǎng)基的優(yōu)化284.4.1 脂肪酶培養(yǎng)基單因素條件的優(yōu)化4.4.1.1 最佳碳源的優(yōu)化 以初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別將橄欖油替換為葡萄糖、淀粉、酵母膏、麥芽糖、蔗糖、乳糖；接種體積分?jǐn)?shù)均為 1%，30，180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 16h 后，用滴定法測(cè)酶活，以確定碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。4.4.1.2 復(fù)合碳源的優(yōu)化 以初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別將橄欖油替換為淀

30、粉和酵母膏（最佳碳源優(yōu)化的結(jié)果） ，按不同成分比例混合后，以 1%的含量分別作為培養(yǎng)基中的碳源，接種體積分?jǐn)?shù)均為 1%，30，180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 16h 后，用滴定法測(cè)酶活，以確定碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。 4.4.1.3 最佳氮源的優(yōu)化以初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基和上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，分別將黃豆粉替換為豆餅粉和硝酸銨，按不同成分比例混合后，以 4%的含量分別作為培養(yǎng)基中的氮源；接種體積分?jǐn)?shù)均為 1%，30，180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 16h 后，用滴定法測(cè)酶活，以確定氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。4.4.1.4 復(fù)合氮源的優(yōu)化以初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基和上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，分別將黃豆粉替換豆餅

31、粉和硝酸銨（最佳氮源優(yōu)化的結(jié)果）；接種體積分?jǐn)?shù)均為 1%，30，180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 16h 后，用滴定法測(cè)酶活，以確定氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。4.4.1.5 最佳無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化以初始設(shè)計(jì)發(fā)酵培養(yǎng)基上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，分別將無(wú)機(jī)鹽替換為硝酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸鐵；接種體積分?jǐn)?shù)均為 0.1%，30，180r/min 條件下?lián)u瓶培養(yǎng) 16h 后，用滴定法測(cè)酶活，以確定無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響4.4.2 產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)（1）選擇豆餅粉+硝酸銨（豆餅粉：硝酸銨=3:1）(2%、4%、6%)、淀粉+酵母膏（淀粉：酵母膏=3:1） （1%、2%、3%） 、磷酸氫二鈉（0.

32、05%、0.1%、0.15%）、硫酸鎂(0.05%、0.1%、0.15%)這四個(gè)因素，每一因素設(shè)定 3 個(gè)水平，按下表 1-3 配置 9 組培養(yǎng)基（W/V） ，分裝于 250ml 三角瓶中，每瓶 25ml。用 8 層紗布包扎后于 0.1MPa 滅菌 30min；（2）接種：挑取斜面菌苔 5 環(huán)接入 5ml 無(wú)菌水中，搖勻后用無(wú)菌移液管吸取 0.5ml 菌懸液，接到每一組培養(yǎng)基中（接種量要完全一樣） ；（3）發(fā)酵：將三角瓶放于搖床上，30，180 r /min 搖床培養(yǎng) 16h；（4）取下?lián)u瓶，立即進(jìn)行酶活力的測(cè)定，比較各組培養(yǎng)基配方的酶活力，確定最佳的培養(yǎng)基配方。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心

33、-專注-專業(yè)表 1-6 產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)Table 1-6 Lipase Production orthogonal test medium 因素水平A 豆餅粉+硝酸銨B 淀粉+酵母膏C 磷酸氫二鈉 D 硫酸鎂 1 2% 1% 0.05% 0.05% 2 4%2%0.1% 0.1% 36% 3% 0.15% 0.15%4.5 脂肪酶發(fā)酵條件優(yōu)化294.5.1 發(fā)酵條件單因素條件優(yōu)化4.5.1.1 培養(yǎng)基初始 pH 的優(yōu)化 將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配好后，在復(fù)篩的基礎(chǔ)上，用 1mol/L 的氫氧化鈉或1mol/L 的氯化氫分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0（

34、根據(jù)初篩和復(fù)篩的條件） ，分別至 250ml 三角瓶中，每瓶 25ml，0.1MPa 滅菌 30min。冷卻后以 1%的接種量接種，在 30恒溫?fù)u床上以 180 r /min 的轉(zhuǎn)速培養(yǎng) 16h，在同一時(shí)間取出，測(cè)定其酶活，確定產(chǎn)脂肪酶的的最佳初始 pH。4.5.1.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配好后，以上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，將培養(yǎng)基分別至250ml 三角瓶中，每瓶 25ml，0.1MPa 滅菌 30min。冷卻后接種，1%的接種量，將接種后的三角瓶在 20、25、30、35、40、45下（根據(jù)初篩和復(fù)篩的條件）搖床培養(yǎng)(180 r /min) 16h，在同一時(shí)間取出，測(cè)定其酶活，確定

35、產(chǎn)脂肪酶的的最佳的培養(yǎng)溫度。4.5.1.3 培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化 將優(yōu)化后培養(yǎng)基配好后，以上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，在 250ml 的三角瓶中分裝培養(yǎng)基，裝量分別為 10ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml（根據(jù)初篩和復(fù)篩的條件） ，以 8 層紗布作為瓶口布，0.1MPa 滅菌 30min。1%的接種量，接種后，搖床培養(yǎng)(180 r /min) 16h，在同一時(shí)間取出，測(cè)定其酶活，確定產(chǎn)脂肪酶的的最佳的裝液量。4.5.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配好后，以上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)，在 250ml 的三角瓶中分裝 25ml 的培養(yǎng)基，0.1MPa 滅菌 30min。接種后在 1

36、50 r /min、160 r /min、180 r /min、200 r /min、220 r /min、240 r /min（根據(jù)初篩和復(fù)篩的條件）的搖床中搖瓶培養(yǎng) 16h，在同一時(shí)間取出，測(cè)定其酶活，確定產(chǎn)脂肪酶的的最佳的搖床轉(zhuǎn)速。4.5.1.5 接種量的優(yōu)化 將優(yōu)化后的培養(yǎng)基配好后，以上述優(yōu)化的條件為基礎(chǔ)， 將配好的培養(yǎng)基在0.1MPa 滅菌 30min。按接種量為 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（根據(jù)初篩和復(fù)篩的條件）接種后，搖床中搖瓶培養(yǎng) 16h，在同一時(shí)間取出，測(cè)定精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)其酶活，確定產(chǎn)脂肪酶的的最佳的接種量。4.5.

37、2 產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件的正交試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)發(fā)酵條件的單因素實(shí)驗(yàn)得知，選擇以下的因素和水平，設(shè)制初始 pH值（6.5、7.0、7.5）、裝液量（250ml 三角瓶裝液量為 15ml、20m、25ml）、接種量(1.5%/、2.0%、2.5%)、培養(yǎng)溫度（25、30、35）四個(gè)因素三水平的正交試驗(yàn)，見(jiàn)表 1-6。表 1-7 因素水平表Table 1-7 of the factors the level of table因素水平A 初始 pH 值B 裝液量 mlC 接種量%D 培養(yǎng)溫度16.5151.52527.0202.03037.5252.5355 分析方法5.1 脂肪酶酶活測(cè)定與計(jì)算方法30 采用橄

38、欖油乳化法測(cè)定脂肪酶酶活31。5.2 酶活測(cè)定的原理 脂肪酶從橄欖油中分解出脂肪酸，這些脂肪酸又被過(guò)量添加的氫氧化鈉中和，然后用氯化氫回滴，可測(cè)定出脂肪酸的量。5.3 酶活的定義 以 1 分鐘生成 1u mol 的脂肪酸所需的脂肪酶量定義為 1 個(gè)酶活力單位，記為 1 個(gè) U。5.4 酶活的測(cè)定在 100ml 的三角瓶中加入 5.0ml 橄欖油乳化液（4%PVA:橄欖油=2:1）及4.0ml 0.05M 的磷酸緩沖液（pH=7.5）并置于 37水浴鍋中預(yù)熱 10min，加入1ml 發(fā)酵液濾液(為 V)，塞上瓶塞充分振蕩（每隔 10min 左右要重新?lián)u動(dòng)一次）。精確保溫 30min 后加 10m

39、l 丙酮乙醇混合液終止反應(yīng)。加入 10ml 經(jīng)過(guò)標(biāo)定的0.05mol/L 氫氧化鈉溶液，再加 10ml 丙酮乙醇混合液和 2 滴酚酞，用經(jīng)過(guò)標(biāo)定的氯化氫滴定至顏色退去，30s 不變色為終點(diǎn)，記錄消耗的氯化氫的量 V1。在相同條件下做空白對(duì)照，無(wú)須在 37下保溫 30min，加了發(fā)酵液濾液后直接加入丙酮乙醇混合液即可進(jìn)行后續(xù)操作。其氯化氫消耗的量為 V2。5.5 酶活的計(jì)算方法：脂肪酶酶活力（Uml.min） =(V2-V1).M （V.t）精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)式中，V1-滴定樣液所消耗的 HCl 溶液的體積（ml）； V2-滴定空白樣所消耗的 HCl 溶液的體積（ml）；

40、 V-酶液體積（ml）； t-反應(yīng)時(shí)間（min）； M-滴定用的 HCl 溶液的濃度（mmol/L）。5.6 生物量的測(cè)定 比濁法測(cè)定生物量32。將活化后的斜面菌株接入種子培養(yǎng)基中，于 30,180 r /min 搖床培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，用 721 型分光光度計(jì)在 600nm 下測(cè)其 OD 值。6 結(jié)果與討論6.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果按照上述方法，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 2-1。表 2-1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定Table2-1 Determination of growth curve根據(jù)表 2-1，繪制出生長(zhǎng)曲線，如圖 1 所示。圖 1 生長(zhǎng)曲線Figure 1 growth curve

41、從圖 1 中可以看出，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中的菌體 M-6-2，1-12h 為它的生長(zhǎng)延遲期，12-24h 為它的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，24-54h 為它的生長(zhǎng)穩(wěn)定期，54h 以后為它的衰退期。培養(yǎng)時(shí)間/h061218243036424854606672OD 值0.30.410.611.301.952.192.202.232.082.011.781.360.84精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)6.2 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定結(jié)果按照上述方法，進(jìn)行產(chǎn)酶曲線的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表 2-2。表 2-2 產(chǎn)酶曲線的測(cè)定table 1-2 for enzyme production curve determination根

42、據(jù)表 2-2，繪制出產(chǎn)酶曲線，如圖 2 所示。圖 2 產(chǎn)酶曲線Figure 2 enzyme production curve由圖 2 可知，酶活力在 16h 達(dá)到最佳，16-40h 保持穩(wěn)定，到 40h 后開始下降。6.3 菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)關(guān)系圖 2 與圖 1 比較可知，細(xì)菌菌體 M-6-2 在對(duì)數(shù)時(shí)期 12h24h 產(chǎn)酶達(dá)到最高水平，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶相偶聯(lián)，脂肪酶的生成速率隨著菌體生長(zhǎng)速率的增長(zhǎng)而提高，屬于呈正相關(guān)型。6.4 脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2 菌體生長(zhǎng)最佳條件的確定結(jié)果6.4.1 pH 對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表 2-3。表 2-3 生長(zhǎng)

43、最佳pHTable 1-3 growth optimum pH培養(yǎng) pH值4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0OD 值1.451.67 1.891.982.032.252.222.181.961.941.83 根據(jù)表 2-3，繪制出曲線，如圖 3 所示。培養(yǎng)時(shí)間/h04812162024283236404448酶活力/U003.335.8310.5310.4310.3710.3310.3010.079.978.677.63精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)00.511.522.50246810OD值值OD值圖 3 生長(zhǎng)的最佳 pHFigure 3 the

44、optimal pH of the growth 由圖3可知，菌體M-6-2生長(zhǎng)的最佳的pH值為6.5。查文獻(xiàn)可知，大多數(shù)產(chǎn)脂肪酶細(xì)菌最適pH 值693334，與此相符合。6.4.2 溫度對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響 按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表 2-4。表 2-4 生長(zhǎng)最佳溫度Table 2-4 optimum growth temperature培養(yǎng)溫度2022242628303234363840OD 值1.481.721.942.162.312.222.182.081.961.931.87根據(jù)表 2-4，繪制出曲線，如圖 4 所示。圖 4 生長(zhǎng)最佳溫度Figure 4 best

45、 growth temperature 由圖4可知，菌體M-6-2生長(zhǎng)的最佳的溫度為28。查文獻(xiàn)可知，大多數(shù)顯示脂肪酶細(xì)菌的最佳溫度范圍介于30403536，與此基本相符合。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)6.4.3 裝液量對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表 2-5。表 2-5 裝液量的影響Table 2-5 installed the influence of the fluid volume裝液量/ml1012141618202224262830OD值1.761.982.062.122.342.262.151.971.861.701.64根據(jù)表 2

46、-5，繪制出曲線，如圖 5 所示。圖 5 裝液量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響Figure 5 liquid volume on cell growth 由圖 5 可知，菌體 M-6-2 生長(zhǎng)的最佳的裝液量為 18ml/250ml。裝液量主要是和耗氧量有關(guān)，而且培養(yǎng)基中的碳源種類對(duì)菌體的耗氧量有很大的影響，好氧速率由大到小依次為，油脂或烴類葡萄糖蔗糖乳糖，本實(shí)驗(yàn)的碳源用的是橄欖油對(duì)耗氧量有很大的影響。6.4.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表 2-6。表 2-6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響Table 2-6 of the rotation speed

47、of the M-6-2 cell growth搖床轉(zhuǎn)速r/min160170180190200210220OD 值2.032.272.332.292.141.981.83根據(jù)表 2-6，繪制出曲線，如圖 6 所示。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)圖 6 搖床轉(zhuǎn)速對(duì) M-6-2 菌體生長(zhǎng)的影響Figure 6 Effect of shaking speed on the M-6-2 cell growth 由圖 6 可知，菌體 M-6-2 生長(zhǎng)的最佳的搖床轉(zhuǎn)速為 180r/min。搖床轉(zhuǎn)速能消除氣泡增加氧傳遞，搖床轉(zhuǎn)速越小，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通氣量就少，溶解氧就??；搖床轉(zhuǎn)速越大，培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)通氣量

48、就大，溶解氧就大。但這對(duì)培養(yǎng)瓶和發(fā)酵罐的要求高，而且對(duì)菌體也會(huì)造成影響。6.5 脂肪酶培養(yǎng)基的優(yōu)化6.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)6.5.1.1 最佳碳源的優(yōu)化 按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，結(jié)果如圖 7 所示。圖 7 碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 7 Effect of carbon sources on enzyme production由圖 7 可知，產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基中，脂肪酶活力最高的碳源為酵母膏，但因?yàn)槠涑杀据^高，在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，在考慮到產(chǎn)量和成本的關(guān)系，選擇以淀粉為主酵母膏為輔的復(fù)合碳源。6.5.1.2 復(fù)合碳源的優(yōu)化按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，結(jié)果如表 2-7 所示。表 2-7

49、 復(fù)合碳源的優(yōu)化Table 2-7 composite carbon source optimization精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)復(fù)合碳源酶活（U/mL）4%淀粉（對(duì)照）7.023.5%淀粉+0.5%酵母膏8.233.0%淀粉+1.0%酵母膏10.162.5%淀粉+1.5%酵母膏10.202.0%淀粉+2.0%酵母膏10.321.5%淀粉+2.5%酵母膏10.361.0%淀粉+3.0%酵母膏10.48根據(jù)表 2-7，繪制出曲線，如圖 8 所示。024681012酶酶活活力力U/ml酶活力U/ml圖 8 復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶的結(jié)果Figure 8 the results of co

50、mplex nitrogen source on enzyme production如圖 8 所示，1%碳源中的酵母膏成分含量也多酶活力越高，但酵母膏的成產(chǎn)成本太高，當(dāng)碳源成分為 3.0%淀粉+1.0%酵母膏時(shí)，即淀粉：酵母膏為 3:1時(shí)，酶活力已接近最高酶活，因此可選擇 0.75%淀粉+0.25%酵母膏為碳源。6.5.1.3 最佳氮源的優(yōu)化 按照上述實(shí)驗(yàn)操作后，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，結(jié)果如圖 9 所示。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)圖 9 氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 9 Effect of nitrogen source on enzyme production 由圖 9 可知，產(chǎn)

51、脂肪酶培養(yǎng)基中，蛋白胨、尿素、豆餅粉為遲效氮；硫酸銨和硝酸銨為速效氮。脂肪酶活力最高的氮源為蛋白胨，因?yàn)槠涑杀据^高，在工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，考慮到產(chǎn)量和成本的關(guān)系，可選以豆餅粉和硝酸銨為復(fù)合氮源。6.5.1.4 復(fù)合氮源的優(yōu)化按照實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，結(jié)果如表 2-8 所示。表 2-8 復(fù)合氮源的優(yōu)化Table 2-8 optimization of complex nitrogen source復(fù)合氮源酶活（U/mL）3.5%豆餅粉+0.5%硝酸銨7.233.0%豆餅粉+1.0%硝酸銨10.262.5%豆餅粉+1.5%硝酸銨9.202.0%豆餅粉 2.0%硝酸銨8.371.5%豆餅粉+2.

52、5%硝酸銨7.661.0%豆餅粉+3.0%硝酸銨6.480.5%豆餅粉+3.5%硝酸銨5.45根據(jù)表 2-8，繪制出曲線，如圖 10 所示。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)024681012酶酶活活力力U/ml酶活力U/ml圖 10 復(fù)合氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 10 complex nitrogen source on enzyme production如圖 10 所示，豆餅粉為遲效氮，硝酸銨為速效氮，速效氮有利于菌體生長(zhǎng)，遲效氮有利于產(chǎn)脂肪酶，4%氮源中的豆餅粉成分含量也多酶活力越高，當(dāng)?shù)闯煞譃?3.0%豆餅粉+1.0%硝酸銨時(shí)，這樣的組合即有利于菌體生長(zhǎng)，又有利于產(chǎn)脂肪酶

53、，即選擇 3%的豆餅粉+1%硝酸時(shí)， ，銨為最佳的氮源。6.5.1.5 最佳無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化 按照上述實(shí)驗(yàn)操作后，進(jìn)行酶活力的測(cè)定，結(jié)果如圖 11 所示.圖 11 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure11 of inorganic salts on the enzyme production由圖 11 可知，產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基中，無(wú)機(jī)鹽磷酸氫二鈉和硫酸鎂對(duì)產(chǎn)酶的影響最大。6.5.2 正交試驗(yàn)按實(shí)驗(yàn)方法所述，進(jìn)行培養(yǎng)基的優(yōu)化，并測(cè)定其脂肪酶的酶活，結(jié)果見(jiàn)表2-9。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)表 2-9 產(chǎn)脂肪酶培養(yǎng)基的正交試驗(yàn)Table 2-9 Lipase Production orthogo

54、nal test medium因素 A因素 B因素 C因素 D組別豆餅粉+硝酸銨淀粉+酵母膏磷酸氫二鈉硫酸鎂酶活 U1 12% 1 1% 10.05% 10.05%15.302 1 2% 2 2% 20.1% 20.1%15.27 3 1 2% 3 3% 30.15% 30.15%14.83 4 2 4% 1 1% 20.1% 30.15%14.87 5 2 4% 2 2% 30.15% 10.05%14.68 6 2 4% 3 3% 10.05% 20.1%15.12 7 3 6% 11% 30.15% 20.1%14.97 8 3 6% 2 2% 10.05% 30.15%15.73 9

55、3 6% 3 3% 20.1% 10.05 %15.07K145.4045.1446.1545.05 K244.6745.6845.2145.36 K345.7745.0244.4845.43 K115.1315.0515.3815.02 K214.8915.2315.0715.12 K315.2615.0114.8315.14極差R0.370.220.550.12因素主次順序 C A B D優(yōu)水平A3B2C1D3優(yōu)組合 A3B2C1D3計(jì)算各水平酶活力和(Ki)和各水平酶活力和的平均值ki (ki= Ki/3)，其結(jié)果見(jiàn)表2-9。計(jì)算各因素列的極差RR=(kimax- kimin)，R表示該

56、因素在其取值范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)變化的幅度。根據(jù)極差R的大小，進(jìn)行因素的主次排列。R越大，表示該因素的水平變化對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響越大，因此在本實(shí)驗(yàn)中這個(gè)因素就越重要。反之，R越小，這個(gè)因素就越不重要。由上表可見(jiàn)，通過(guò)極差分析，影響因素主次為C A B D，即磷酸氫二鈉豆餅粉+硝酸 淀粉+酵母膏硫酸鎂；通過(guò)方差分析，優(yōu)組合為為A3B2C1D3，所以最佳培養(yǎng)基組成4.5%豆餅粉+1.5%硝酸銨、1.5%淀粉+0.5%酵母膏、0.05%磷酸氫二鈉、0.15%硫酸鎂。精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)6.6 脂肪酶產(chǎn)生菌 M-6-2 發(fā)酵條件的優(yōu)化6.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)6.6.1.1 培養(yǎng)基初始 pH 的

57、優(yōu)化在不同的起始培養(yǎng)基 pH 值下，對(duì)菌株 M-6-2 所產(chǎn)生的脂肪酶活力進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得 pH 對(duì)脂肪酶酶活的影響，結(jié)果見(jiàn)表 2-10。表 2-10 初始 pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 2-10 Initial pH on enzyme productionpH 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0酶活力/U5.337.8311.33129.677根據(jù)表 2-10，繪制出圖 12，如下圖所示。0510150246810酶酶活活力力U/ml酶活力/U 圖 12 初始 pH 對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 12 Initial pH on enzyme production由圖 12 可知，菌

58、株 M-6-2 發(fā)酵的最佳初始 pH 在 7.0 左右時(shí)酶活最高。與菌體生長(zhǎng)的最佳的 pH 6.5 相比，相差不大。因此發(fā)酵時(shí)可選擇的較佳 pH 為6.5-7.0。6.6.1.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 在不同的溫度下，測(cè)定菌株 M-6-2 所產(chǎn)生脂肪酶的活力，結(jié)果見(jiàn)表 2-11。 表 2-11 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 2-11 the impact of incubation temperature on enzyme production溫度/202530354045酶活力/U12 12.85 13.07 12.82 10.53 7.58根據(jù)表 2-11，繪制出圖 13，如下所示。精選優(yōu)質(zhì)

59、文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè) 圖 13 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 13 the impact of incubation temperature on enzyme production由圖 13 可知，在一定范圍內(nèi)，溫度越高，該菌所產(chǎn)生酶活力越高，當(dāng)溫度超過(guò) 30時(shí)，隨著溫度的升高，酶蛋白質(zhì)會(huì)逐漸變性，使酶活力會(huì)下降，甚至最終喪失酶活力，因此，該菌的最佳發(fā)酵溫度選擇為 30。和菌體生長(zhǎng)的最佳溫度 28相差不大。發(fā)酵時(shí)可選擇的較佳溫度為 28-30。6.6.1.3 培養(yǎng)基裝液量的優(yōu)化 在 250ml 培養(yǎng)瓶中，不同裝液量的條件下，測(cè)定菌株 M-6-2 所產(chǎn)生脂肪酶的活力，結(jié)果見(jiàn)表

60、 2-12。表 2-12 培養(yǎng)基裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 2-12 medium liquid volume in the production of enzymes裝液量/ml 10 20 25 30 35 40酶活力/U12.8713.312.8212.6811.510.97 根據(jù)表 2-12，繪制出圖 14，如下所示。1111.51212.51313.5010203040酶酶活活力力U/ml酶活力/U圖 14 培養(yǎng)基裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Figure 14 medium liquid volume in the enzyme production精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專心-專注-專業(yè)