人源漢坦病毒疫苗候選株的分離鑒定及其某些特性研究

1、人源漢坦病毒疫苗候選株的分離鑒定及其某些特性研究【摘要】目的對(duì)人源漢坦病毒疫苗候選株作分離鑒定及特性的研究。方法用Vero細(xì)胞分離病毒，用免疫熒光法作病毒效價(jià)測(cè)定。用RT-PCR及部分核苷酸序列分析等檢定。結(jié)果用Vero細(xì)胞從安徽省鳳臺(tái)縣腎綜合征出血熱病人血清中分離一株漢坦病毒(HV)，其抗原特性及PCR分型結(jié)果證明為漢灘病毒(型病毒)；其免疫血清對(duì)來(lái)源于不同地區(qū)的HV均有中和活性。M片段部分序列分析結(jié)果表明，該毒株與76-118等毒株核苷酸序列有較大差異，但氨基酸序列同源性甚高。病毒株對(duì)Vero細(xì)胞敏感，繁殖高峰一般在9天以后，可多次收獲病毒。結(jié)論上述特性表明，分離病毒株適合用作研制滅活疫苗

2、后備株。【主題詞】出血熱，病毒性； 漢坦病毒； 序列分析，DNA； Vero細(xì)胞 Isolation,identification and certain characteristics of a Hantaan virus proposed as candidate virus for killed vaccineXIE Yanxiang, HANG Changshou, WANG Hua, et al.（Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine, Beijing 100052, China）【Abstract

3、】ObjectiveIsolation and identification of a Hantaan virus from HFRS patients serum for killed vaccine development.MethodsThis virus temporally called FT14 detected by IFAT, RT-PCR. Partial sequence of M segment was determined by Sangers dideoxy chain termination method.ResultsThe antigenicity and PC

4、R amplification of the newly isolated virus FT14 proved that it belongs to virus of HTN type. Antiserum to the virus can neutralized many strains of Hantaan virus from different areas. The partial sequence of M segment of FT14, as compared with other HTN strains, showed great differences among nucle

5、otied sequences, while the deduced amino acid sequence is comparatively conservative. The titer of the virus reached its peak at 9 days post inoculation in vitro, then the peak titer could last for a long time. ConclusionThis virus strain FT14 would be a good candidate virus for killed vaccine devel

6、opment.【Key words】Hemorrhagic fever,viral; Hantaan virus; DNA sequencing; Vero cells腎綜合征出血熱(HFRS)是我國(guó)重點(diǎn)防治的急性傳染病。安徽省是我國(guó)HFRS的老疫區(qū)和重疫區(qū)。因此，對(duì)流行于該地區(qū)的漢坦病毒(HV)進(jìn)行分離和系統(tǒng)的鑒定，能為HFRS的防治提供科學(xué)依據(jù)。特別是流行株的血清型和基因型的確定，是選擇使用疫苗的型別和確定防治重點(diǎn)及對(duì)策的前提，也為研究我國(guó)漢坦病毒的遺傳性及進(jìn)化提供一定的依據(jù)。同時(shí)，對(duì)毒株的免疫原性、抗原性及其在Vero細(xì)胞中增殖特性進(jìn)行研究，為傳代細(xì)胞疫苗候選株的選擇提供基礎(chǔ)材料。1材料

7、和方法TM Taq酶。逆轉(zhuǎn)錄酶為GibcoBRL公司的Super ScriptTM 逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR片段回收使用Promega公司的Wizard?-2接種病毒后，每天收獲1瓶，刮取細(xì)胞作熒光檢查；上清凍存檢測(cè)病毒滴度；細(xì)胞凍化后檢測(cè)ELISA抗原滴度。1.7實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所。2結(jié)果表1FT14抗原檢測(cè)HFRS病人雙份血清結(jié)果Tab.1Reactivity of FT14 with paired sera from HFRS patients血清號(hào)Serum No.發(fā)病后天數(shù)Days post onsetof the diseaseIFA抗體滴度*IFA(An

8、tibody titer)*FT1476-11884 FLi1A*3408040C*191 2801 2806402A4808040C201 2801 2801 2803A3404040C186401 280640 *A：急性期(Acute phase)?*C：恢復(fù)期(Convalescent phase)?*以血清稀釋度的倒數(shù)表示(Reversion of the serum dilution titer) 表2FT14抗原及其免疫血清與其他毒株交叉中和試驗(yàn)Tab.2Cross plaque-reduction neutralization test between FT14 and oth

9、er virus strains病毒株Strain免疫血清中和滴度PRNT titers of immune sera微量細(xì)胞病變中和試驗(yàn)MCPENTL99R22Chen76-118FT14FT14C41010160160160160Chen201032032032032084 FLi1010160320320320FT142010160160640320H52010160160160160H3201016016016016076-1182010160640320320A9402080808080L993208020202040R2216016010101020 表3FT14在Vero細(xì)胞中的

10、傳代情況Tab.3Passages of FT14 on Vero cells傳代Passage感染后天數(shù)Days postinfection抗原檢測(cè)Detection of antigenIFAELISAPFU/ml123ND220+11510237+164510547+1128610557+12565106表4FT14在Vero細(xì)胞上的增殖動(dòng)態(tài)Tab.4The multiplication of FT14 on Vero cells感染后天數(shù)Days postinfection抗原檢測(cè)Detection of antigenIFAELISAPFU/ml3ND21006+13251059+1

11、128610612+1256710615+1256610618+1256710621+1256110724+12561107 1FT14在Vero細(xì)胞上的繁殖曲線Fig.1Growth curve of virus FT14 on Vero cells2.5RT-PCR對(duì)FT14擴(kuò)增及鑒定用型引物從29份病人血清中擴(kuò)增出陽(yáng)性帶8份，其中包括分離出FT14毒株的血清。29份病人血清與型引物均不反應(yīng)。2.6FT14部分M片段核酸序列測(cè)定測(cè)得了對(duì)應(yīng)于M基因組片段2 0032 302位的300堿基對(duì)的核苷酸序列(見2)，并就核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與一些已知序列進(jìn)行了比較(見表5)，結(jié)果FT14與

12、HTN型病毒株核苷酸序列的同源性為81.0%82.3%；推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為96%。 2FT14病毒M片段部分核苷酸序列Fig.2Partial nucleotide sequence of M segment of FT14 virus表5FT14M片段部分核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與已知病毒相應(yīng)片段序列的同源性(%)Tab.5Comparison of partial nucleotide and amino-acid sequences of M segment among FT14 and other known virusesFT1476-118ChenR22FT1482.38

13、1.069.076-11896.086.770.0Chen96.097.068.7R2276.879.878.8 注：空白對(duì)角線上為核苷酸序列，下為氨基酸序列Note:The upper part of diagonal represents nucleotide sequence, the lower part the amino acid sequence 3討論用Vero細(xì)胞作為疫苗生長(zhǎng)的基質(zhì)，是當(dāng)前HFRS疫苗發(fā)展的方向6。我國(guó)以Vero細(xì)胞為基質(zhì)的HFRS疫苗尚處于實(shí)驗(yàn)室開發(fā)階段，迫切需要在Vero細(xì)胞上繁殖力高的適應(yīng)病毒株。FT14因其用Vero細(xì)胞分離、適應(yīng)性好、滴度高而具備上述

14、條件。和鼠源病毒株相比，盡管核苷酸序列有較大差異，但氨基酸序列差別不大，這表明了在HV進(jìn)化過(guò)程中其結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列保持相對(duì)穩(wěn)定的特點(diǎn)，也決定了FT14具有相對(duì)穩(wěn)定的抗原性。而且其來(lái)源及傳代歷史清楚，有可能適合作為Vero傳代細(xì)胞型疫苗候選株。作者單位：解燕鄉(xiāng)（100052北京，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所出血熱與蟲媒病毒室）杭長(zhǎng)壽（100052北京，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所出血熱與蟲媒病毒室）王華（100052北京，中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所出血熱與蟲媒病毒室）朱公文（安徽省鳳臺(tái)縣人民醫(yī)院）參考文獻(xiàn)2，Lee HW, Lee PW, Johnson KM. Isolation of the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. J Infect Dis,1978,137:298-308.4，Schmaljo