WB原理步驟及總結(jié)

1、蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上， 然后利用抗原抗體反 應(yīng)來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白分子的技術(shù)， 包括三個(gè)部分：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳， 蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，SDS是陰離子 去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵， 使分子去折疊， 破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)。 SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為:1，由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合 時(shí)掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別， 使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的負(fù)電 荷，形似長(zhǎng)橢圓棒， 蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。 因此， 利用相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2、，可以求得未知蛋白的相對(duì)分子質(zhì) 量。電泳后蛋白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中，探針?lè)肿雍茈y通過(guò)凝膠孔，將蛋白質(zhì)從 凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測(cè)分析。 方法有兩種： 水平半 干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液浸濕的濾紙中間，通電 1030min可完成垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間，浸在轉(zhuǎn)移 裝置的緩沖液中，通電 24h 或過(guò)夜可完成。固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、聚 偏二氟乙烯膜和尼龍膜。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后，通過(guò)蛋白質(zhì)染料如麗春紅S檢測(cè)膜上的總蛋 白，或用考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)凝膠上的蛋白剩余量， 以驗(yàn)證轉(zhuǎn)移是否成功。 用抗體作 為探針進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)檢測(cè)抗原蛋白

3、，分為4步：用非特異性、非反應(yīng)活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)， 以防止作為探針的抗體結(jié)合 到膜上，出現(xiàn)檢測(cè)時(shí)的高背景固定化膜用專一性的一抗溫育，使一抗與膜上的抗原蛋白分子特異性結(jié)合酶標(biāo)二抗與一抗特異結(jié)合加入酶底物，適當(dāng)保溫， 膜上便可見(jiàn)到顏色反應(yīng)，檢測(cè)出抗原蛋白區(qū)帶。主要溶液10%分離膠水 、 30% 丙烯酰胺混合液 、 L Tris ()、 10% SDS、 10%過(guò)硫酸銨、 TEMED5%濃縮膠水、 30%丙烯酰胺混合液、 L 、 10%10%過(guò)硫酸銨、1X Tris -甘氨酸電泳緩沖液Tris 堿、甘氨酸、SDS 1g,用去離子水定容至1L2X SDS凝膠加樣緩沖液Tris

4、-HCI () 100mmol/L,B -巰基乙醇 10% 10%t油，溴酚藍(lán)，10%SDS 轉(zhuǎn)移緩沖液Tris ，甘氨酸，甲醇100mL加去離子水至1LTBSTTris NaCI ，Tween-20 1 mL，加去離子水至 1LStrippingTris(pH )，4mL10%SDS140卩l(xiāng) B -巰基乙醇，用水定容到 20mL實(shí)驗(yàn)步驟1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置 分離膠的配置： 將配置好的分離膠液混勻后迅速倒入膠槽中， 至距離短玻 璃板頂端約2cm處，停止灌膠。檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在膠 液界面上加蒸餾水進(jìn)行水封。 1530min 后，凝膠和水封層界面清晰，說(shuō)明膠

5、已 經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。 （使蛋白樣品分 離） 濃縮膠的配置： 將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上， 直至短玻璃板的頂 端，然后插入樣品槽梳子。室溫下濃縮膠聚合，約2030min。（使蛋白樣品濃縮） 蛋白樣品的處理將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為 1mg/ml。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中， 輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加熱時(shí)液體迸出），在100C沸水浴中加熱3min, 取出冷卻后備用， 使用前需要將樣品離心除去顆粒物質(zhì)。 暫時(shí)用不到的話， 可放 在-20C冰箱長(zhǎng)期保存，使用時(shí)沸水浴中加熱3mi n,以除去亞穩(wěn)聚合態(tài)物質(zhì)。上樣前的樣品一定要均勻以防電泳時(shí)出現(xiàn)縱向條帶

6、。加樣 拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒(méi)過(guò)短板約以上，若樣品槽中有氣泡， 用槍頭挑除。 按順序向凝膠樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白和未知蛋白樣品， 每孔的加樣 量要相同，一般加樣體積為 1030卩l(xiāng)，加樣時(shí)槍頭深入到加樣槽內(nèi)，盡量接近 底部，記錄加樣順序。電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開(kāi)直流穩(wěn)壓電源，先 80V 過(guò)了濃縮膠后改為 120V,待溴酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠下沿 1cm時(shí)停止電泳。2 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移水平半干式電轉(zhuǎn)移 戴乳膠手套剪濾紙6張，濾紙長(zhǎng)與寬比SDS-PAGE交各大1cm 裁剪與SDS-PAGE膠長(zhǎng)寬相等的NC膜。 將3張濾紙和SDS-PAGE交浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中待用。 將另3張濾紙和NC轉(zhuǎn)

7、移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。 將浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中的濾紙取出， 盡量少帶液體， 置于轉(zhuǎn)移槽負(fù)極上， 然 后在負(fù)極濾紙上依次鋪放SDS-PAGE交、NC膜、3張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾紙。 注意排除氣泡，因?yàn)?氣泡會(huì)產(chǎn)生高阻抗點(diǎn)， 形成低效印跡區(qū)， 即所謂“禿斑”。 蓋上石墨陽(yáng)極板，設(shè)定50mA恒流，轉(zhuǎn)移一定時(shí)間。垂直濕式轉(zhuǎn)移 凝膠片的平衡：把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的 大培養(yǎng)皿中，浸泡3060min,以除去膠中的SDS使其pH及離子強(qiáng)度和印跡緩沖 液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮。 將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4C 準(zhǔn)備NC膜和濾紙：戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的NC膜和4張濾紙，用轉(zhuǎn)移緩

8、沖液浸潤(rùn)膜和濾紙15mi n,直到?jīng)]有氣泡， 將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕 打開(kāi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾， 依次放入： 浸濕的海綿， 兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸過(guò)的膠，NC膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。 轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負(fù)極NO!靠近正極將轉(zhuǎn)移槽放到4 °C冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流80 mA 4 h。3 免疫印跡分析NC膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的NCS取出，置于培養(yǎng)皿中。 麗春紅S染色3min后，用鉛筆輕輕標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶的位置以備計(jì)算特異性蛋白 質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅 S脫色液輕輕漂

9、洗數(shù)次至紅色消失。特異性抗體檢測(cè) 脫色后的NC膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖， 室溫下封閉2h以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合） 倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。（除去封閉液） 漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，4C搖床過(guò)夜或室溫放搖3h （一抗與目的抗原蛋白特異性結(jié)合） 利用水平搖床，用TBST洗膜3次，每次5min。（洗去未結(jié)合的一抗） 將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標(biāo)二抗中，在室溫下孵育30mi n 傾去二抗，用TBST洗膜，室溫?fù)u洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于 保鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體

10、積混合，于暗室中，按的量滴加于膜表 面，孵育1mi n,濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內(nèi)曝光數(shù)秒。在暗室中，將1 X顯影液和定影液分別到入塑料盤(pán)中； 在紅燈下取出X 光 片，剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L(zhǎng)和寬均需大 1cm）;打開(kāi)X-光片夾，把X 光片放 在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上 X-光片夾，開(kāi)始計(jì)時(shí)；根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱 適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min，曝光完成后，打開(kāi)X-光片夾，取出 X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間 一般為12min （2025C）,溫度過(guò)低時(shí)（低于16 C）需適當(dāng)延長(zhǎng)顯影時(shí)間； 顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影

11、液中，定影時(shí)間一般為510min,以膠片 透明為止；用自來(lái)水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項(xiàng) 在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性； 不同濃度的凝膠用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白 選擇合適的表面活性劑和還原劑， 破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵、二硫鍵；對(duì)于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS- PAGER能測(cè)定它們的亞基或單條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量。 盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子； 蛋白質(zhì)樣品在處理過(guò)程中應(yīng)低溫下進(jìn)行， 以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶對(duì) 其進(jìn)行修飾 盡量使用新鮮的 loading buffer ，樣品要與 loading buffer 混合均勻，

12、 不可將蛋白質(zhì)反復(fù)凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性， Buffer 一定要漫過(guò)梳子孔，否則可能會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動(dòng)； 電泳時(shí)先用低電壓跑過(guò)濃縮膠， 再換高電壓跑分離膠， 特別是對(duì)于高分子 量的目的蛋白， 硝酸纖維素（NC）膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無(wú)需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響??； 非特異性本底顯色淺；價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在 NC 上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失；NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化 膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。但價(jià)格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，

13、然后浸入20%勺甲醇，待完全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用 于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1X麗春紅染液染5min （于脫色搖床上搖），然 后用水沖洗掉沒(méi)染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易 產(chǎn)生較高的背景。 高背景可能的原因：膜未均勻浸泡；膜或緩沖液污染；封閉 不充分；抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應(yīng)；抗體濃度過(guò)高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用 100%?醇將膜完全浸泡；雜交前檢測(cè)一抗、二抗；檢測(cè)一抗、二抗與封閉液是否 有交叉反應(yīng)。轉(zhuǎn)膜的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的 1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也

14、可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色， 以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)膜 效果。也 可以用考 馬斯亮藍(lán)快 速染色 液對(duì)完成轉(zhuǎn) 膜的 SDS-PAG膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。作用定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，分析目的蛋白表達(dá)的特異性。蛋白樣品的制備（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。?、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵?直立放置一會(huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細(xì)胞加3ml 4 C預(yù)冷的PBS（）。平放輕輕搖動(dòng) 1min洗滌 細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml

15、裂解液加10卩l(xiāng) PMSF （ 100mM，搖勻置于冰上。（ PMSF 要搖勻至無(wú)結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4、每瓶細(xì)胞加400卩1含PMSF勺裂解液，于冰上裂解 30min，為使 細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來(lái)回?fù)u動(dòng)。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6、于4°C下12000rpm離心5min。（提前開(kāi)離心機(jī)預(yù)冷）7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于20 C保存。（2）組織中總蛋白的提取：1、將少量組織塊置于 12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組 織塊盡量剪碎。2、加400卩1單去

16、污劑裂解液裂（含 PMSF于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。 然后置于冰上。3、幾分鐘后再碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至離心管中，然后在4C 下12000rpm離心5min，取上清分裝于離心管中并置于 20C保存。（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊?，一些細(xì)胞脫落下來(lái)，除了按（一）操作外還應(yīng)收 集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提?。?、 將培養(yǎng)液倒至 15ml離心管中，于 2500rpm離心5min。2、 棄上清，加入 4ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心 5min。棄上清后用 PBS重復(fù)洗滌

17、一次。3、 用槍洗干上清后，加 100 1裂解液（含 PMSF冰上裂解30min， 裂解過(guò)程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、 將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm離心5min，取 上清分裝于離心管中并置于20C保存。（三）蛋白含量的測(cè)定（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、從一20C取出1mg/ml BSA，室溫融化后，備用。2、取18個(gè)離心管，3個(gè)一組，分別標(biāo)記為 0mg,。3、按下表在各管中加入各種試劑。0mg1mg/ml BSA100m L NaCIG250考馬斯亮藍(lán)溶 液1ml1ml1ml1ml 1ml 1ml4、混勻后，室溫放置 2min。在生物分光光度計(jì)上比色分析。（2）檢測(cè)

18、樣品蛋白含量1、 取若干離心管，每管加入4°C儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。室溫放置30min后即可用于測(cè)蛋白。2、 取一管考馬斯亮藍(lán)加 L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為 空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測(cè)空白 樣品。3、 棄空白樣品，用無(wú)水乙醇清洗比色杯2次（每次），再用無(wú)菌水 洗一次。4、 取一管考馬斯亮藍(lán)加95 L NaCl NaCl溶液和5ml待測(cè)蛋白樣品，混勻后靜置2min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測(cè)樣品。注意：每測(cè)一個(gè)樣品都要將比色杯用無(wú)水乙醇洗2次，無(wú)菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測(cè)，這樣對(duì)測(cè)定大量的蛋白樣品可節(jié) 省很多時(shí)間。測(cè)得的結(jié)果是 5 ml樣品含的蛋白量。主要參考生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程劉箭主編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)魏群主編還有百度上搜的關(guān)于 wb的方法步驟及試驗(yàn)中出現(xiàn)的問(wèn)題熱致相分離法的英文縮寫(xiě)TIPS，是Thermally Induced PhaseSeparation的簡(jiǎn)稱