細(xì)胞工程第三章細(xì)胞培養(yǎng)基本方法

1、細(xì)胞工程第三章細(xì)胞培養(yǎng)基本方法一、無(wú)菌操作技術(shù)根據(jù)使用器材不同選擇正確合適的方法進(jìn)行消毒和滅菌。地面：0.1%新潔爾滅或2-5%來(lái)蘇爾滅菌，紫外線照射30-50min；超凈工作臺(tái)及器具：每次實(shí)驗(yàn)前95%酒精擦拭消毒，紫外線照射消毒。3.洗手和著裝：口罩、無(wú)菌服、帽子紫外線照射消毒；手部消毒。4.無(wú)菌培養(yǎng)操作：無(wú)菌操作技術(shù)要領(lǐng)無(wú)菌操作技術(shù)要領(lǐng)點(diǎn)燃酒精燈：加熱消毒。動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷 ：不應(yīng)太快。不用手觸及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定順序 培養(yǎng)用瓶和吸管的放置 防止各種用液的交叉污染不向操作者講話或咳嗽維護(hù)各種設(shè)備，保持良好工作狀態(tài)。超凈臺(tái)內(nèi)培養(yǎng)用品布局 二、培養(yǎng)細(xì)胞的觀察（一）相差顯微鏡觀

2、察（一）相差顯微鏡觀察1.原理：利用光在通過(guò)不同密度物質(zhì)時(shí)的折射率和物體厚度差別，由于折射光程不同產(chǎn)生衍射而引起的光程變化。產(chǎn)生衍射而引起的光程變化。光程的變化引起相位差相位差變化來(lái)觀察物體結(jié)構(gòu)。一般情況下人眼不能分辨相差，而相差顯微鏡利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹罴懊靼抵钕嗖钭優(yōu)檎穹罴懊靼抵?，就可以分辨出被檢物體的結(jié)構(gòu)。 2.生長(zhǎng)良好的細(xì)胞的鏡下?tīng)顟B(tài)：細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清。細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓清。 相差顯微鏡觀察時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞部分細(xì)微結(jié)構(gòu)。 B.若細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)不良，可見(jiàn)細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)?，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞之間空隙增大，細(xì)胞形態(tài)

3、不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落，有時(shí)細(xì)胞表面及周?chē)霈F(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應(yīng)及時(shí)處理。（二）倒置顯微鏡（二）倒置顯微鏡1.光源和聚光器位于載物臺(tái)上方。2.物鏡位于載物臺(tái)下方。3.載物臺(tái)上可放置培養(yǎng)皿，便于觀察貼服于底壁上的活細(xì)胞。4.倒置顯微鏡可裝配各種輔助設(shè)備：相差長(zhǎng)焦距聚光器、暗視野聚光器、熒光顯微鏡光源、恒溫調(diào)節(jié)器、照相機(jī)、攝影機(jī)等。5.可根據(jù)不同觀察目的選用不同的相差物鏡：正反差物鏡、PL物鏡、PLL物鏡、NH物鏡。培養(yǎng)的CHO細(xì)胞 中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞1.用相差顯微鏡觀察細(xì)胞應(yīng)注意瓶（或皿）的厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。2.天氣較冷時(shí)，若與顯微鏡觀察處溫

4、差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，此時(shí)可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好的相差像。3.若對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，最好選擇換選擇換液液后進(jìn)行。（三）相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的注意事項(xiàng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況有關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)方法 1. 細(xì)胞計(jì)數(shù) （四）、 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)目，以測(cè)定細(xì)胞增殖和調(diào)整細(xì)胞濃度的方法。Cell counting using a haemocytometer 計(jì)算四角大方格計(jì)算四角大方格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；內(nèi)的細(xì)胞數(shù)；每個(gè)方格容積為每個(gè)方格容積為110-4ml細(xì)胞數(shù)/ML4大格細(xì)胞總數(shù)/410000稀釋倍數(shù)1毫

5、米計(jì)數(shù)原則：不數(shù)死計(jì)數(shù)原則：不數(shù)死細(xì)胞（染藍(lán)）、壓細(xì)胞（染藍(lán)）、壓線細(xì)胞數(shù)上不數(shù)下，線細(xì)胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團(tuán)數(shù)左不數(shù)右，一團(tuán)細(xì)胞按一個(gè)計(jì)數(shù)！細(xì)胞按一個(gè)計(jì)數(shù)！ 1毫升毫升1立方厘米立方厘米 三、培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè)指標(biāo) 2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：觀察細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過(guò)程的重要指標(biāo)；培養(yǎng)時(shí)間d為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。條件：具備自身穩(wěn)定生長(zhǎng)特性。 生長(zhǎng)曲線是培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一，是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)。 常用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響！ 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 3. 細(xì)胞分裂指數(shù) 細(xì)胞分裂指數(shù)是表示細(xì)胞增殖旺盛程度增殖旺盛程度的指標(biāo)。它

6、以被測(cè)1000個(gè)細(xì)胞中的分裂細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算。 測(cè)定方法：用秋水仙素秋水仙素將細(xì)胞處理12小時(shí)后，按染色體制片法染色體制片法制片制片并染色，計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中分裂相的數(shù)目，重復(fù)4次取平均值，用百分比表示。 分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)100% 4. 細(xì)胞貼壁率 細(xì)胞貼壁率又稱(chēng)細(xì)細(xì)胞接種存活率胞接種存活率。 它是細(xì)胞被制成分散的懸液后，以低密度(25個(gè)細(xì)胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長(zhǎng)形成細(xì)胞小群(克隆)的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)值，用以表示細(xì)胞的生存能力和細(xì)胞群的活力。 細(xì)胞接種存活率只表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞數(shù)，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的

7、細(xì)胞。 克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。 由于細(xì)胞生物學(xué)性狀不同，細(xì)胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細(xì)胞克隆形成率弱，傳代細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成率弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞克隆形成率弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。5. 細(xì)胞周期 一個(gè)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)周期時(shí)間；與細(xì)胞群體倍增時(shí)間的區(qū)別（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)細(xì)胞數(shù)量增加一倍所用的時(shí)間）。標(biāo)記有絲分裂百分率法（percentage labeledmitoses，PLM）： 對(duì)測(cè)定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時(shí)取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞，通過(guò)統(tǒng)計(jì)標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來(lái)測(cè)定細(xì)胞周期。放射標(biāo)記物為3H或者14C標(biāo)記的TdR。 G1：DNA合成

8、前期合成前期S：DNA合成期合成期G2：DNA合成后期合成后期M：有絲：有絲分裂期分裂期 6. MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍(lán) 四唑鹽比色法的原理：活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 MTT法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確，廣泛應(yīng)用于新藥篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、腫瘤放射敏感性實(shí)驗(yàn)等。 活細(xì)胞率 =（細(xì)胞總數(shù)-死細(xì)胞數(shù)）/ 細(xì)胞總數(shù) x 100%三、細(xì)胞培養(yǎng)中常用的染色方法（一）活體

9、染色在體外條件下用某種染色劑對(duì)活的組織或細(xì)胞進(jìn)行染色，而不影響活細(xì)胞生命活動(dòng)的方法?；铙w染料：堿性活體染料+酸性活體染料常用堿性活體染料，使用濃度較低，0.005%、0.01%、0.1%、0.2%，采用平衡鹽溶液、PBS、生理鹽水配制。 用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)（Trypan blue）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對(duì)死細(xì)胞死細(xì)胞著色（藍(lán)色），可測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。 （二）染料排除檢測(cè)法熒光染料染色觀察 2.溴化乙錠（溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（）和碘化丙啶（PI）染色）染色嵌入核酸雙鏈之間，只能標(biāo)記死死細(xì)胞！ （紅色熒光）3.Acridine Orange（AO）丫啶橙直接染色觀

10、察活細(xì)胞，同時(shí)標(biāo)記DNA和RNADNA：亮綠色熒光RNA：橘紅色-紅色熒光 吖啶橙(AO)能透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞透過(guò)胞膜完整的細(xì)胞，嵌入細(xì)胞核嵌入細(xì)胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠僅能透過(guò)胞膜受損的細(xì)胞胞膜受損的細(xì)胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。 凋亡的細(xì)胞呈現(xiàn)為染色增強(qiáng)，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)。非凋亡細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結(jié)構(gòu)樣特征。 在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)四種細(xì)胞形態(tài)： 活細(xì)胞(VN)，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)； 早期凋亡細(xì)胞(VA)，核染色質(zhì)著綠色呈固縮狀或圓珠狀； 非凋亡的死亡細(xì)胞(NVN)，核染色質(zhì)著橘紅色并呈正常結(jié)構(gòu)； 晚期凋亡細(xì)胞(NVA)

11、，核染色質(zhì)為橘紅色呈固縮狀或圓珠狀。1污染及途徑：細(xì)胞培養(yǎng)中，與培養(yǎng)無(wú)關(guān)的雜質(zhì)的混入培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)稱(chēng)為污染。 空氣：最主要途徑，消毒不嚴(yán)格，季節(jié)、凈化工作臺(tái)故障、濕度、溫度、周邊環(huán)境等。 器材清洗消毒不徹底 操作：基本功不扎實(shí)、不認(rèn)真、不規(guī)范、交叉污染、器具消毒不嚴(yán)格等。 血清：制備水平低，支原體或病毒污染。 組織 樣本四、細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)-污染污染(contamination) 細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題十分重要，一旦發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)的污染問(wèn)題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定生污染，將導(dǎo)致前功盡棄。所以細(xì)胞培養(yǎng)一定要建立要建立無(wú)菌觀念無(wú)菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要

12、分析原因，。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時(shí)處理。及時(shí)處理。 培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回，培養(yǎng)細(xì)胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無(wú)法挽回，加入抗生素也基本無(wú)能為力。特別是霉菌和細(xì)加入抗生素也基本無(wú)能為力。特別是霉菌和細(xì)菌。菌。 1.細(xì)胞培養(yǎng)中常見(jiàn)的污染物有細(xì)菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞可能有污染：酸堿度酸堿度發(fā)生異常的改變。b. 培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁?；鞚?。c. 光鏡觀察到菌絲和顆粒菌絲和顆粒。d. 細(xì)胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢死亡或增殖緩慢等 2.細(xì)菌污染：常見(jiàn)革蘭氏陰性菌（白色葡萄球菌） 、大腸桿菌、假單胞菌。現(xiàn)象：初期變化不明顯，后期培養(yǎng)液渾濁，鏡下可見(jiàn)菌體。預(yù)防：青霉素和鏈

13、霉素可預(yù)防。3.真菌污染 ：常見(jiàn)煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特點(diǎn)：大多呈白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)液表面；鏡下呈絲狀、管狀或樹(shù)枝狀，縱橫交錯(cuò)，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。抗真菌制劑可預(yù)防和排除真菌污染。4.支原體污染：介于細(xì)菌和病毒之間，能獨(dú)立生活的最小微生物。最常見(jiàn)、不易察覺(jué)；大小介于0.2-2 m，約1%可通過(guò)濾菌器 對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱較敏感，青霉素?zé)o效 ?！罢！备杏X(jué) 。支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變支原體污染細(xì)胞后，能抑制細(xì)胞代謝和生長(zhǎng)，改變核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改核酸合成，影響細(xì)胞的抗原性，引起細(xì)胞染色體改變，干擾變，干擾DNA的

14、復(fù)制，以及具有類(lèi)病毒作用。在培的復(fù)制，以及具有類(lèi)病毒作用。在培養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而養(yǎng)細(xì)胞初期，由于支原體對(duì)細(xì)胞的繁殖影響較小而往往被忽略。往往被忽略。 支原體檢測(cè)方法和處理1）熒光技術(shù)檢測(cè)：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結(jié)合，可根據(jù)細(xì)胞表面的熒光來(lái)顯示細(xì)胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實(shí)驗(yàn)室常用。3）放射自顯影檢測(cè)：4）DNA分子雜交及PCR法5）電鏡檢測(cè)法6）3H-胸腺嘧啶摻入法在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色螢光小點(diǎn)和絲狀點(diǎn)，表示測(cè)試樣品有支原體的污染。 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細(xì)胞的細(xì)胞核，測(cè)試樣品沒(méi)有支原體的污染。 支原體污染細(xì)胞的Hoechst33258染色結(jié)果 支原體污染電鏡照片（30K） 5.病毒的污染及檢測(cè)： 借助宿主細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制裝配成新的病毒顆?；蛘系剿拗鱀NA上進(jìn)行復(fù)制。1）致細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathic effect,CPE）或集落的檢測(cè)：采用相差顯微鏡檢測(cè)