人乳頭瘤病毒L2蛋白的病毒樣顆粒疫苗研究.docx

1、doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.016人乳頭瘤病毒L2蛋白的病毒樣顆粒疫苗研究蔣蓉李軍強(qiáng)楊鳴鳴朱濤宇學(xué)鋒邵忠琦（天津康希諾生物技術(shù)有限公司，天津市呼吸道細(xì)菌重組及結(jié)合疫苗企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300457）中圖分類號(hào)R373.9R392-33文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號(hào)10004MX(2016)03_03664)6摘要目的:構(gòu)建乙肝病毒核心抗原(HBcAg)與人乳頭瘤病毒(HPV)L2抗原的融合蛋白.在大腸桿菌中重組表達(dá)形成病毒樣顆粒結(jié)構(gòu);通過小鼠模型檢測(cè)HBc-L2融合蛋白的免疫原性，并研究免疫后獲得的小鼠血清對(duì)HPV假病毒的中和效力。方法:通過DNA合成構(gòu)建

2、16型人乳頭瘤病毒12基因片段與HBcAg基因的融合基因，將其克隆至表達(dá)載體PET9a并在大腸桿菌中進(jìn)行HBc-L2融合蛋白表達(dá);將經(jīng)純化、鑒定后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中針對(duì)12抗原的抗體效價(jià)，并分別研究小鼠血清對(duì)16型和18型HPV假病毒的中和效力。結(jié)果:HBc-L2融合基因經(jīng)大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)形成可溶性蛋白，經(jīng)硫酸鉉沉淀和CL4B凝膠分離純化后獲得純度>80%的HBc-L2蛋白；分子篩高效液相色譜-多角度激光光散射(SEC-MALS)聯(lián)用技術(shù)和透射電子顯微鏡的分析結(jié)果表明,HBc-L2融合蛋白在表達(dá)過程中自動(dòng)組裝形成穩(wěn)定的病毒樣顆粒;將純化后的

3、HBc-12蛋白免疫BALB/c小鼠可獲得針對(duì)12抗原的高滴度抗體,且小鼠血清具有中和16和18型兩種假病毒的中和抗體活性。結(jié)論:HBc-12病毒樣顆粒可以有效地增強(qiáng)12抗原的免疫原性，并可剌激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)多型HPV的免疫保護(hù)力，是一個(gè)具有潛力的新型廣譜HPV疫苗。關(guān)鍵詞人乳頭瘤病毒;12抗原;乙肝病毒核心抗原;病毒樣顆粒;免疫原性；中和抗體Studyofavirus-likeparticlevaccinecontainingN-terminalepitopesofhumanpapillomavirusL2proteinJIANGRong,LIJun-Qiang,YANGMing-Ming9Z

4、HUTaoyYUXue-FengtSHAOZhong-Qi.TianjinCanSinoBiotechnologyInc.TianjinCorporateKeyLaboratoryofRespiratoryBacterialRecombinantandConjugateVaccinetTianjin300457,ChinaAbstractObjective:Toprepareavirus-likeparticle(VLP).containingHepatitisBviruscoreantigen(HBcAg)andN-terminalpeptidesoftheL2proteinofhumanp

5、apillomavirus(HPV),andinvestigatetheimmunogenicityoftheVLPinmiceandtheprotectionagainstdifferentstrainsofHPV.Methods：AfusiongenewassynthesizedtoinsertaDNAfragment.codingfortheN-terminalepitopesoftheL2proteinofHPV16,intotheHBcAgcodingsequence;HBc-L2fusionproteinwashighlyexpressedinE.coliusingthepET9a

6、andBL2(DE3)expressionsystem；thepurifiedfusionproteinwasusedtoimmunizeBALB/cmiceandantibodytitersagainsttheL2epitopesinmouseseraweredeterminedbyindirectELISA；thelevelsofneutralizingantibodiesagainstbothHPV16and18werealsoanalyzed.Results：HBc-L2fusionproteinwasexpressedinE.coliandpurified,withthepurity

7、>80%,byammoniumsulfateprecipitationandCL-4BgelGltration；analysisofthepurifiedfusionprotein,usingsizeexclusionchromatographywithmulti-anglelaserlightscatteringdetection(SEC-MALS)andelectronmicroscope,revealedthatHBc-12wasassembledintoastableVLPstructureautomaticallyfollowingitsexpression;immunizat

8、ionofBALB/cmicewiththepurifiedVLPsresultedinhighantibodytitersinmouseseraagainstthe12epitopes；furthermore,itwasdemonstratedthattheserafromtheimmunizedmicehadneutralizationactivitiesagainstbothHPV16andHPV18.Conclusion:TheimmunogenicityoftheL2epitopeswashighlyenhancedbytheconstructionofHBc-L2fusionpro

9、teinandtheformationoftheVLPstructure;thefusionproteinwasalsocapableofinducingprotectionsagainstdifferentserotypesofHPV,therefore,itcouldbeapotentialHPVvaccinewithabroadcoverageandlowproductioncostKeywordsHumanpapillomavirus;L2peptide;HepatitisBviruscoreantigen；Virus-likeparticles;Immunogenicity;Neut

10、ralizationantibody人乳頭瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)是作者簡(jiǎn)介:暮蓉（1986年-）,女，碩士，高級(jí)技術(shù)員，主要從事病原微生物免疫學(xué)方面研究，E-mail：rong.jiangcansino-o通訊作者及指導(dǎo)教師:邵忠琦（1962年-）,男，博士，研發(fā)總監(jiān)，主要從事疫苗研發(fā)方面研E-mail：zhongqi.shaocansinotech,conu一種無(wú)包膜雙鏈DNA病毒，能引起子宮頸癌、生殖器疣等腫瘤疾病或癌癥。宮頸癌在婦女中發(fā)生率位列第二，在發(fā)展中國(guó)家發(fā)生率明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家。統(tǒng)計(jì)表明,我國(guó)每年新增宮頸癌患者約15萬(wàn)人左右，且年輕患者比例上升明顯

11、。近年來(lái)，運(yùn)用重組DNA技術(shù)制備基因工程HPV疫苗的研究獲得了突破性進(jìn)展。L1與12基因分別編碼HPV的主要及次要衣殼蛋白，L1蛋白約占衣殼蛋白80%以上，能自動(dòng)組裝成病毒樣顆粒(Virus-likeparticle,VLP)；12蛋白在衣殼蛋白中含量:少于20%,且無(wú)法單獨(dú)形成VLP。國(guó)外已上市或獲批的產(chǎn)品，如默沙東四價(jià)、九價(jià)加德西(Gardasil,HPV6,11,16,18；HPV6,11,16,18,31,33,45,52,58)與葛蘭素史克二價(jià)卉妍康(Cervarix,HPV16,18)均利用L1自身形成VLP結(jié)構(gòu)的原理進(jìn)行研制。但這些疫苗生產(chǎn)工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴，無(wú)法廣泛滿足市場(chǎng)，尤

12、其是發(fā)展中國(guó)家低收入人群的需求。研究表明，接種氨基酸序列較為保守的12蛋白能誘導(dǎo)產(chǎn)生涵蓋多種血清型HPV的保護(hù)力，但S蛋白或L2多肽本身免疫原性較低。通過將E2與Toll樣受體2(TLR2)融合、在腺伴隨病毒顆粒骨架中插入12多肽抗原或?qū)⒔?jīng)修飾的細(xì)菌鞭毛蛋白(Fha)與L2融合等方法均可以提高L2的免疫原性,并獲得具有中和多種血清型HPV的免疫血清(8-，01o本研究選用的兩個(gè)E2蛋白的N-端多肽在不同型的HPV間具有較強(qiáng)保守性,并在早期研究中被證實(shí)對(duì)HPV16、18、31具有一定交叉保護(hù)活性重組的乙肝病毒核心抗原(HepatitisBviruscoreantigen,HBcAg或HBc)可在

13、大腸桿菌中高效表達(dá),易純化，并能自身組裝形成VLPO構(gòu)建合適的HBc與目標(biāo)抗原融合蛋白，將目標(biāo)抗原展示在HBc形成的VLP表面，能有效地提高目標(biāo)抗原的免疫原性。ACAMBIS公司將流感M2e蛋白插入HBc制備了ACAM-FLU-A的新型通用型抗流感疫苗，該疫苗具有較好的免疫原性及保護(hù)性，并已經(jīng)進(jìn)入臨床研究階段。除病毒疫苗之外，HBc載體還被廣泛運(yùn)用于細(xì)菌、寄生蟲等多種病原疫苗研究E】o本研究將兩段16型人乳頭瘤病毒L2抗原多肽(1347位與65-81位氨基酸)偶聯(lián)后作為抗原片段插入到HBc蛋白中，在大腸桿留中表達(dá)融合蛋白并自動(dòng)組裝成VLP。研究結(jié)果顯示,HBc-I2病毒樣顆粒顯著增強(qiáng)了12多肽

14、抗原的免疫原性，所獲得的小鼠血清具有中和16型與18型HPV的能力。此項(xiàng)研究為開發(fā)廣譜、低成本的宮頸癌疫苗提供了一個(gè)新途徑。1材料與方法1.1材料1.1.1假病毒、細(xì)胞、菌株與動(dòng)物HPV16.HPV18假病毒與陽(yáng)性血清由北京微谷生物醫(yī)藥有限公司饋贈(zèng);293FT細(xì)胞由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曹勝波教授饋贈(zèng)；感受態(tài)BL2A(D”)、DH5a與T載體購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司;SPF級(jí)BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司;pET9a載體、pFN2K(GST)FlexiVector購(gòu)自Promega公司。1.1.2試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基.0.25%胰酶、胎牛血清購(gòu)自Gib

15、co公司；HRP羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHI、NdeI、PmeI與AsiSI購(gòu)自NewEnglandBiolabs公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司，膠回收試劑盒購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司;SepharoseCL-4B購(gòu)自GE公司，GSTSEPHAROSE購(gòu)自索萊寶公司；蛋白純化儀為AktaPrimePlus(GE公司)；流式細(xì)胞儀為MilliporeguavaeasyCyteHT,熒光顯微成像系統(tǒng)為尼康TE2000U,透射電子顯微鏡為FEITecnai20o1.2方法1.21表達(dá)載體的構(gòu)建本研究中采用的HBc蛋白為去掉C-端1

16、64183位氨基酸的截短蛋白，取而代之的是一個(gè)半胱氨酸。在HBc蛋白178位置上插入了兩個(gè)抗原片段,分別為L(zhǎng)2蛋白13-47位和6581位氨基酸片段。插入到HBc的12多肽序列為ASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIA-DQILQ和GTGGRTGYIPLGTRPPTo融合基因(包括兩端的BamHI和A&I酶切位點(diǎn))委托LifeTechnology公司合成構(gòu)建。將擴(kuò)增的DNA片段經(jīng)Bam/H和N&I雙酶切后回收目的基因，然后與經(jīng)同樣酶切的載體質(zhì)粒pET9a連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化挑取并純化卡那霉素抗性菌落；陽(yáng)性克隆經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將獲得的HB

17、c-U融合基因的表達(dá)質(zhì)粒命名為pET9a-HBc-L2o委托Invitrogen公司合成以下兩個(gè)DNA引物：5'-GCGATCGCTCAACTTTATAAAACATGCAAACAG-V與5-GTITAAACTTAAACCTTAGGTATAATGTC-AGGT-3'。以12融合基因的表達(dá)質(zhì)粒pET9a-HBc-12為模板，加入上述引物,PCR擴(kuò)增12抗原編碼片段。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，對(duì)獲得的質(zhì)粒進(jìn)行和P*I雙酶切，膠回收L2目的條帶，將其與經(jīng)同樣酶切的載體質(zhì)粒pFN2K(GST)FlexiVector連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a,挑取卡那霉素抗性菌落，陽(yáng)性克隆經(jīng)LB培養(yǎng)基擴(kuò)增

18、后提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，將獲得的表達(dá)質(zhì)粒命名為PGST-L2。1.2.2重組融合蛋白的表達(dá)與純化將表達(dá)質(zhì)粒PET9a-HBc-L2轉(zhuǎn)化BI21(DE3),挑取卡那霉素抗性菌落，純化后接種LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，在培養(yǎng)液中加入20%甘油，分裝后于-80Y保存菌種。取凍存偏種接種至10mlLB培養(yǎng)基，373C搖菌過夜復(fù)蘇;轉(zhuǎn)接入400ml新鮮培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)至ODg,約0.6-0.7時(shí)，加入1mmol/LIPTG,25Y誘導(dǎo)4h；離心收集萌體，用TGEbuffer(50mmol/LTris,0.5mmol/LEDTA.50mmol/LNaCI,5%甘油)重懸細(xì)胞；超聲破碎后高心收集上清，加入10%w/v

19、(NH4)2SO4沉淀蛋白，用TGEbuffer重懸沉淀，收集幣:忌液并用0.22濾膜過濾,然后用100kD膜包超濾濃縮。用CL-4B凝膠對(duì)濃縮液進(jìn)一步分離純化，收集日的蛋白。將表達(dá)質(zhì)粒pGST-EZ轉(zhuǎn)化B12(DE3)感受態(tài)細(xì)胞獲得GSTJ2表達(dá)隋株。取凍存菌種接種10mlLB培養(yǎng)基,37Y搖曲過夜復(fù)蘇；轉(zhuǎn)接入400ml新鮮培算基擴(kuò)大培弄至()D頌約0.60.7時(shí)，加入1mmol/LIPTG,37T誘導(dǎo)4h;離心收集菌體，用PBS幣:懸細(xì)胞;超聲破碎后離心收集沉淀。加入200ml8rnol/L尿素過夜溶解包涵體.離心收集上清，濃度梯度透析至PBS中，經(jīng)GSTSEPHAROSE柱純化，收集目的

20、蛋白。1.2.3病毒樣顆粒大小和形態(tài)的分析鑒定采用分子篩高效液相色譜(SEGHPLC)及HPLC-多角度激光光放射(MALS)聯(lián)用技術(shù)鑒定蛋白純度和VLP顆粒大小。激光放射儀與色譜分離系統(tǒng)連接將泵頭放入經(jīng)0.22過濾并超聲后的流動(dòng)相后.流速調(diào)至0.1ml/min,柱體平衡后分別對(duì)BSA和待測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。委托中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所蛋白質(zhì)實(shí)騎平臺(tái)生物成像中心采用透射電子顯微鏡進(jìn)行VLP形態(tài)觀察。1.2.4小鼠免疫與血清樣本制備分別對(duì)兩個(gè)批次HB<-I2(HBc-I2-1與IIBc-12-2)病存樣顆粒樣品和一批GST-I2融合蛋白樣品進(jìn)行免疫原性研究。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為體重10-12g的BALB

21、/c小鼠，共104Ho每批HB<-I2VLP樣品設(shè)四個(gè)濃度組，分別為20、10、5、1W只，每組1。只小鼠；GST-L2樣品設(shè)兩個(gè)濃度，分別為20J0叫/只，每組7只；另設(shè)陰性對(duì)照組,10只小鼠.注射生理鹽水。所有組別均在0天皮下注射5005對(duì)應(yīng)樣品，第14天、28天分別進(jìn)行第二和第三次免疫。分別在免疫第28、42天采血,6000r/min高心8min,分離血清,-20弋暫存。1.2.5間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)配制5jig/mlGSTJ2蛋白溶液，10()山/孔包被的標(biāo)板，4弋過夜。0.05%TweenPBS洗3次，加入I%BSA2(X)./孔，37W育2h；PBST洗3次，加入待檢血

22、清(HBe-12實(shí)驗(yàn)組)100W孔,37弋孵育.Ih；PBST洗3次，加入HRP-羊抗鼠IgG100jd/孔,375育1h；PBST洗5次，加入TMB底物顯色1015min；每孔加入50心的2mol/LH2SO4終止顯色反應(yīng)，酬標(biāo)儀檢測(cè)。1)蜘讀數(shù)'檢測(cè)GST-12融合蛋白免疫后獲得的血清時(shí)，采用HBc-12包被酶標(biāo)版.檢測(cè)步驟同1.01.2.6HPV中和抗體檢測(cè)在96孔細(xì)胞板每孔中加入100p.1293FT細(xì)胞懸浮液，含1.5x10個(gè)細(xì)胞,37,5%CO2培養(yǎng)6ho待測(cè)血清(HBc-12三免血清)經(jīng)56Y滅活30min后按1：15J：30、1：60J:120進(jìn)行系列稀釋，陰性血清(未

23、免疫小鼠血清)處理后僅進(jìn)行1：15稀釋。根據(jù)假病毒提供方的研究數(shù)據(jù)，分別對(duì)PsV16和PsV18進(jìn)行1：200和：100稀祥。將假病毒和血清按I：1進(jìn)行混合檢于4Y共孵育60min,再將混合液加入已培養(yǎng)6h的細(xì)胞板中,37龍、5%C()2繼續(xù)培養(yǎng)“。72h培養(yǎng)結(jié)束后用熒光顯微鏡觀察EGFP熒光表達(dá)。觀察結(jié)束后，奔去培養(yǎng)基,每孔加入0.25%胰酶205,37Y消化5min,每孔加入200心10%FBS的DMEM培養(yǎng)基頂恐細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至新的96孔板，用Milli|x»reguavaeasyCyteHT流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間差異選用，檢驗(yàn)進(jìn)行分析，/yo.05為差異具有顯普性

24、。2結(jié)果2.1表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建編碼HBc-12的融合基因氏度為663bp,表達(dá)出的融合蛋白大小約為24kl)o如圖1A所示，將構(gòu)建的HBc-12表達(dá)載體pET9a-進(jìn)行HamH|和Nde雙能切，得到兩個(gè)大小分別約為670bp和4300bpDNA片段，與融合基因編碼片段和PET9a載體大小相符。經(jīng)驗(yàn)證.GST.12的表達(dá)載體AsiS|和RneI雙胸切后進(jìn)行電泳.條帶大小分別約為107bp和3765bp,也與預(yù)期的質(zhì)粒大小及基因片段一致(圖IB)o圖1表達(dá)載體雙酶切鑒定圖Fig.1RestrictiondigestionofexpressionplasmidsNote：A.DigtMion<&

25、gt;TpET9aHB<12uithHamH|andA</rI；B.Digc-HticHiofp(JST-12withAsiS|andPmr|.2.2HBc-L2取組蛋白的表達(dá)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，高心收集倘體;超聲破碎細(xì)胞后分別對(duì)上清和沉淀中的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳結(jié)果（圖2）顯示，IPTG誘導(dǎo)后上清和沉淀樣品中均出現(xiàn)了一條約為24kl）的明顯蛋白條帶，與HBc-12融合蛋白的理論分子量相符。因此.HBc-12融合基因可在大腸桿菌有效表達(dá)，獲得產(chǎn)物主要為聽溶性蛋白，少部分形成包涵體。2.3蛋白純化與病毒樣顆粒的鑒定對(duì)細(xì)胞破碎上清進(jìn)行硫酸鉉沉淀處理（圖3A）,夏溶并超

26、濾濃縮，并用CL4B分子篩層析進(jìn)一步純化，在外水體積收集到蛋門峰（圖3B.峰I）;對(duì)所獲樣品進(jìn)行蛋白電泳，結(jié)果如圖3C所示，樣品中目的蛋白純度大于80%,主要雜質(zhì)為分子ht約30kD的蛋白。用SEC-HPLC方法對(duì)純化的HBc-12融合用白進(jìn)行分析。HBc-12分子仙約為24kl）,而結(jié)果顯示HBc-12賀白的出峰時(shí)間遠(yuǎn)早于66kl）的BSA（出峰時(shí)間約23min）,表明該蛋白并不以單體形式存在,而是自組裝成大分子結(jié)構(gòu)（圖4A）；SEC-HPLC-MAlt聯(lián)用技術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步表明，狹得的HBcL2融合蛋白分子M大，且分布集中、結(jié)構(gòu)均一（圖4B）O通過透射電f顯微鏡對(duì)兩批純化的HBc-12進(jìn)行

27、觀察（圖5）,鏡卜可見大依均一分布、直徑約為30nm的圓形顆粒，與報(bào)道的HBr病成樣顆粒相符,&明構(gòu)建的融合蛋白HBc-12能有效門動(dòng)包裝形成大分子病毒樣顆粒。2.4血清抗體效價(jià)對(duì)小取,二次與三次免疫后的血清進(jìn)行抗12抗體效價(jià)檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示。二次免疫后.低劑ht組（1或5jig）血清中滴度達(dá)到10“左右，而高劑帝組（1?；?0嚇）抗體滴度已接近或超過IO%圖6A）；三次免疫后，各劑ht組抗體圖2HBc-IJ誘導(dǎo)表達(dá)鑒定Fig.2ExpressionofHBcI2afterinductionN(Mc：M.Markrr;lame1.Solublefractionofcelllysat

28、r；Ine2.Insolublefractionofcelllysatr.滴度較二免結(jié)果略有增加（圖6B）,但沒有顯著差異（P>0.05）o比較不同批次的樣品,HBc-L2-2較HBr-12-l的免疫原性似乎更強(qiáng)，但兩批間差異不顯著（P>0.05）o上述結(jié)果表明,HBc-L2具有良好的免疫原性,二次免疫即訶刺激機(jī)體產(chǎn)生高滴度的抗12抗體，且不同批次樣品的結(jié)構(gòu)和免疫原性較-致。圖6C為GST-I2融合蛋白免疫小鼠所得結(jié)果。高劑址（I。和20»ig）GST-12蛋白三次免疫后，血清中抗12的抗體效價(jià)分別為102或10遠(yuǎn)低于HBc-12的免疫效果。因此tHBc-L2形成的VLP

29、可有效地增強(qiáng)12抗原的免疫原性。2.5HPV中和抗體檢測(cè)小鼠免疫血清對(duì)兩種HPV假病推（PsV16與PsV18）的中和效力.初步評(píng)價(jià)HB（-I2疫苗的保護(hù)性和廣譜性。如圖7所示,PsV16與PsV18能有效感染293FT'細(xì)胞，陰性對(duì)照血清（1：15倍稀釋）對(duì)假病毒感染效力無(wú)影響，鏡下可觀察到大量:感染后表達(dá)熒光的細(xì)胞。當(dāng)將小鼠免疫血清（1：15倍稀釋）與PsV16、PsV18分別共孵育72h后，PsV16與PsV18的感染能力明顯被抑制，鏡卜僅能找到極少表達(dá)熒光的細(xì)胞，1：30、1：60和1：120稀釋度的免疫血清與PsV16或PsV18共孵育.圖3HBc-IJ«合帶白純化

30、Fig.3PurificationofHBcI2fusionproteinNote:A.SDS-PAGEanalynisofNimplmbeforeandafteranmioniusulfateprecipitation；B.SDS-PAGEanalysisofsaniplrsbeforeamiafterCL-4Bgelflhnition；C.PurificationofHB<'-I2byCL-4BgelGItralionchronuitograpliy:A：M.Marker；I.Cellly»atebeforeinduction;2.Celllysateafterin

31、duction:3.nuprmatantafterAmmoniumsulfateprecipitation:4.TGEHupenxionofAmmoniumMilfalcprecipitation;5.Precipitateafterrentrirugation；6.Suprmatantafterrrntrifugitlion；B：M.Marler；1.HBcL2beforeCL-4Bp*lGltnili<»n；2.HBc12afterCL-4Bgrlfiltration.圖4HBC-L2融合蚤白分子大小分析Fig.4AnalysisofsizeofHBc-Ufusionpro

32、teinNote：A.SE-HPLCanalysisofHBc-L2；B.SEC-HPIX-MALSanalysisofHBc-12.圖5HBc-IJ病毒樣顆粒電子透鏡鑒定Fig.5ObservationofHBol2virus-likeparticlesbyTEMNote：A.HBe-12-l；B.MlIBc-U-lMMBt-LM圖6血清中抗L2抗體滴度檢測(cè)Fig.6AntiL2antibodytitersinmouseseraNote：A.AftertwoinjectionswithHBc-12;B.AfterthreeinjectionswithAfterthn-einjet'l

33、ionwithGSTI2.GST4U后，也對(duì)兩個(gè)假病春的感染效力有不同程度的抑制（結(jié)果未顯示）。將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移后進(jìn)行流式分析.結(jié)果顯示陰性對(duì)照血清對(duì)假病毒無(wú)中和作用,PsV16與其共再育后感染細(xì)胞.約有16%細(xì)胞表達(dá)熒光。當(dāng)PW16與1：15J：30、1：60、1：120四個(gè)梯度稀釋的小鼠免疫血清共孵背后，檢測(cè)出感染熒光細(xì)胞比例分別下降至4.48%、7.54%、9.32%與11.23%。PsV18與陰性血清反應(yīng)后感染細(xì)胞，可以檢測(cè)到約11%的細(xì)胞表達(dá)熒光。、1PsV18與4個(gè)梯度稀釋的小鼠免疫血清共孵育后感染細(xì)胞，所檢測(cè)熒光細(xì)胞比例分別為3.46%,4.81%、9.61%、11.96%。圖7H

34、PV假病毒中和試驗(yàn)熒光采集Fig.7FluorescenceassayofHPVpseudovirionneutralization綜合顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀分析結(jié)果.HB<-12免疫小鼠后獲得的血清具有中和16型HPV的能力，并對(duì)18型HPV病毒也有較強(qiáng)交叉中和活性'3討論引發(fā)宮頸癌的人乳頭痛病屜上要包括HPV6、II、16、18、31、33、45、52與58等血清型15。國(guó)外已上市的疫苗均采用主要衣殼蛋白L】作為抗原七要成分，但L1蛋白具有較強(qiáng)型特異性，不能覆蓋其他血清型的病毒，6jr,需分別制備不同型的疫苗組分以形成多價(jià)制劑。山蛋白在昆蟲細(xì)胞與酵時(shí)細(xì)胞中表達(dá)量低，制備工藝復(fù)

35、雜，生產(chǎn)成本高，S0而世界上約有80%的宮頸癌病例發(fā)生石發(fā)展中國(guó)家，昂貴的HPV疫苗無(wú)法使這些地區(qū)的人群完全受益”o因此，開發(fā)更廣潛、更經(jīng)濟(jì)的宮頸癌疫苗勢(shì)在必行。研究表明，次要:衣殼蛋白12雖不威F維持病毒結(jié)構(gòu)的主要蛋白,在病毒表面含ht相對(duì)較少，但能與次級(jí)病毒受體結(jié)合從而促進(jìn)病毒基因組從胞內(nèi)體向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，與乳頭痛病毒感染有更要聯(lián)系如。但12免疫原性相對(duì)較弱，極大限制K基于12抗原的疫苗開發(fā)。近年來(lái)，人們開展r大站的研究以增強(qiáng)12抗原的免疫原性和保護(hù)性，Tumban等利將HPVI6的12短肽插入到編碼MS2病毒樣顆粒的質(zhì)粒后，小鼠模型免疫原性得到明顯提高。Tyler等E將含有12蛋白整合到Q。

36、咚萌體VLPI*免疫小鼠血清能有效中和PW16、18、3I、45、58多種血清型假病毒，證實(shí)廣以12制備的HPV疫苗具有更廣泛的中和保護(hù)力。本研究中，我們將兩個(gè)16型HPVI2蛋白N端具有交叉保護(hù)功能的多肽抗原插入到HB。蛋門中，在大腸桿菌中表達(dá)獲得HBc-I2融合蛋白，并證明經(jīng)純化的HBc-I2自動(dòng)組裝形成了VLP結(jié)構(gòu)。由于HBc-L2可在細(xì)菌中高效表達(dá),VLP純化過程簡(jiǎn)單且收率高，生產(chǎn)成本將能得到有效控制。在小鼠試驗(yàn)中,HBc-L2二免及三免血清中針對(duì)12的特異性抗體滴度能達(dá)到10'1。6,免疫效果遠(yuǎn)高于不能形成VLP結(jié)構(gòu)的GST-L2融合蛋白。因此，將L2抗原多肽展示在HBc形成

37、的VLP表面E能有效增強(qiáng)12抗原的免疫原性。通過假病毒中和試驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)了HBc-E2VLP免疫后血清不僅可以顯著地中和16型HPV的感染效力，對(duì)18型HPV也有較強(qiáng)中和活性。綜上,HBc-12VLP可能成為一個(gè)生產(chǎn)成本低，且對(duì)不同血清型有廣泛覆蓋率的新型HPV疫苗。HPV外殼表面主要是L1蛋白，12蛋白數(shù)量相對(duì)較少，因此，基于L2抗原的HPV疫苗能否達(dá)到足夠保護(hù)性是一個(gè)需要在臨床試驗(yàn)中回答的關(guān)鍵問題。HBc-L2VLP良好的免疫原性，以及獲得的免疫血清對(duì)HPV16和HPV18具有交叉中和活性，無(wú)疑為該疫苗的進(jìn)一步開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為基于以蛋白的疫苗開發(fā)提供了有力支持。我們將在后續(xù)試驗(yàn)中對(duì)

38、添加佐劑是否會(huì)增強(qiáng)HBc-UVLP的免疫原性，以及體內(nèi)動(dòng)物模型中該疫苗是否能有效降低HPV的感染率等問題進(jìn)行研究。我們也將進(jìn)一步改進(jìn)HBc-L2的組成和結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其免疫原性，使該疫苗可以覆蓋更多血清型的HPV。參考文獻(xiàn)：J姜志欣，吳玉確.HPV感染及預(yù)防性HPV疫苗研究J.中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志,2008.16(5)：315-317.2JYuDY,Xuexinchun.TherelationbetweenhumanpapillomavirusandcervicalcancerJ.PortHealthControl,2003,8(1)：40-45.3 GongYL,SuDM,LiuYA.Constr

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