快速液相色譜法與常規(guī)高效液相色譜法測(cè)定克林霉素磷酸酯及有關(guān)物質(zhì)的比較

1、快速液相色譜法與常規(guī)高效液相色譜法測(cè)定克林霉素磷酸酯及有關(guān)物質(zhì)的比較                    作者：張斗勝 李進(jìn) 許明哲 王晨 姚蕾 相秉仁 胡昌勤【摘要】  目的 比較分析快速液相色譜法(UFLC)與常規(guī)液相色譜法(HPLC)測(cè)定克林霉素磷酸酯含量及有關(guān)物質(zhì)。 方法 UFLC法色譜柱采用Waters C18雜化柱(50mm×4.6mm，2.5m)，流速1.5ml/min；

2、HPLC法色譜柱采用Apollo C18(250mm×4.6mm，5m)，流速1.0ml/min。兩方法均以0.1mol/L磷酸二氫鉀(85%的磷酸調(diào)pH3.5)乙腈甲醇(700150150)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。結(jié)果 在UFLC法中，克林霉素磷酸酯在0.011.5mg/ml呈良好線性，r=0.9999；最低檢測(cè)限為20ng；最低定量限為60ng；精密度RSD為0.41%。與HPLC法相比，該法測(cè)定克林霉素磷酸酯含量快速、準(zhǔn)確、靈敏度高；但測(cè)定有關(guān)物質(zhì)，其專屬性、準(zhǔn)確性不如HPLC法，雜質(zhì)檢出數(shù)目少且部分雜質(zhì)分離不完全。論文論文參考網(wǎng)結(jié)論 UFLC法可準(zhǔn)確、快速、高效測(cè)定克林

3、霉素磷酸酯含量，適合在工作量較大的檢測(cè)項(xiàng)目如制劑含量、含量均勻度及溶出度中應(yīng)用；但經(jīng)簡(jiǎn)單方法轉(zhuǎn)換建立的UFLC方法通常難以勝任對(duì)藥物復(fù)雜體系如有關(guān)物質(zhì)的分析。 【關(guān)鍵詞】  快速液相色譜法； 高效液相色譜法； 克林霉素磷酸酯； 有關(guān)物質(zhì)    ABSTRACT  Objective  To compare and analyze the UFLC and HPLC method for determination of the content of clindamycin phosphate and its related subst

4、ances.  Methods  UFLC: a Waters C18 hybrid column was used, the flow rate was 1.5ml/min; HPLC: a Apollo C18 Column was applied, the flow rate was 1.0ml/min; 0.1mol/L potassium dihydrogen phosphate (pH was adjusted to 3.5 by 85% phosphoric acid)acetonitrilemethanol (700150150, V/V) as mobil

5、e phase; the detective wavelength was 210nm. Results  The linear range of clindamycin phosphate was 0.01 1.5 mg/ml, r=0.9999; the LOD was 20ng and the LOQ was 60ng, and RSD was 0.41%. The accuracy of UFLC method in determination the content of clindamycin phosphate was good, and it was more sen

6、sitive and rapid than HPLC, but in determination of related substances, it had a poor performance.  Conclusion  The UFLC method was proved to be simple, accurate, rapid and high efficient, so it could be applied to rapid analysis of the content of clindamycin phosphate in preparations that

7、 need detect the test items such as content, uniformity of dosage units, dissolution and so on, however this UFLC method was not suitable for determination of the related substances in the components.    KEY WORDS  Ultrafast liquid chromatography method;  HPLC;  Clindam

8、ycin phosphate;  Related Substances  快速液相色譜(ultrafast liquid chromatography，UFLC)是一種新的快速分析技術(shù)，它與超高效液相色譜(ultraperformence liquid chromatography，UPLC)的最大區(qū)別是其不需要系統(tǒng)超高壓(485830bar)，在略高于普通液相色譜壓力極限(345bar)下即可實(shí)現(xiàn)高流速、高分辨率分析，適用于要求高通量、高效率的分析工作，在藥物分析領(lǐng)域前景廣闊1，2。目前，國內(nèi)外已有UFLC分析藥物的報(bào)道24。本文以克林霉素磷酸酯注射液為研究對(duì)象，借鑒藥品

9、標(biāo)準(zhǔn)中收載的HPLC法5，6，建立了克林霉素磷酸酯UFLC分析方法，并與常規(guī)HPLC法分析克林霉素磷酸酯含量及有關(guān)物質(zhì)的情況進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：UFLC法能準(zhǔn)確測(cè)定克林霉素磷酸酯含量，適用于工作量較大的檢測(cè)項(xiàng)目如制劑含量、含量均勻度及溶出度等的快速測(cè)定；但對(duì)有關(guān)物質(zhì)的分析，經(jīng)簡(jiǎn)單方法轉(zhuǎn)換建立的UFLC方法，雜質(zhì)分離的數(shù)目少，部分雜質(zhì)間的分離度變差，其分離特性不如常規(guī)的HPLC法。    1  儀器與試藥    島津液相色譜儀(LC?20AT泵，SIL?20AC自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD?M20A檢測(cè)器經(jīng)改裝適應(yīng)快速分離，LC So

10、lution色譜工作站)與Waters Alliance色譜分離單元(2690泵，996PDA監(jiān)測(cè)器，Millinium 2.3色譜工作站)?？肆置顾亓姿狨?duì)照品(批號(hào)130486?200502，含量79.0%)，克林霉素對(duì)照品(批號(hào)130422?200402，含量86.5%)，林可霉素對(duì)照品(批號(hào)130432?200407，含量86.2%)；克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化鈉注射液均由中國藥品生物制品檢定所提供。磷酸二氫鉀、磷酸均為分析純，水為雙蒸水，乙腈、甲醇為色譜純。    2  方法與結(jié)果    2.1

11、  供試品溶液與對(duì)照品溶液的制備    (1)供試品溶液  取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化鈉注射液用流動(dòng)相稀釋成0.3mg/ml的溶液，分別稱為溶液(A)和溶液(B)。另取上述兩供試品溶液同法稀釋成3.0mg/ml的溶液，作有關(guān)物質(zhì)分析供試液。    (2)對(duì)照品溶液  分別取克林霉素磷酸酯、克林霉素和林可霉素對(duì)照品適量，精密稱定；加流動(dòng)相溶解定量稀釋制成含上述三種對(duì)照品各約0.3mg/ml的混合溶液。    2.2  實(shí)驗(yàn)方法 

12、0;  參考文獻(xiàn)5，6。UFLC分析采用Waters XTerraTM MS C18雜化柱(50mm×4.6mm，2.5m)，常規(guī)HPLC分析采用Apollo C18(250mm×4.6mm，5m)色譜柱。流動(dòng)相為0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(85%磷酸調(diào)pH3.5)乙腈甲醇(700150150)(需用0.22m濾膜過濾)；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；流速分別為1.5ml/min(UFLC)和1.0ml/min(常規(guī)HPLC)；柱溫25；供試品濃度0.3mg/ml(含測(cè))，3.0mg/ml(有關(guān)物質(zhì))；進(jìn)樣體積分別為2l(UFLC)和10l(常規(guī)HPLC)。 

13、;   2.3  結(jié)果    (1)色譜行為  取供試品溶液(A)，分別用UFLC法和常規(guī)HPLC法進(jìn)行測(cè)定，其典型的色譜圖見圖1。    從圖1可知，克林霉素磷酸酯在UFLC測(cè)定中的保留時(shí)間(tR)約4.3min，56min即可完成分析；在常規(guī)HPLC法中，主峰的tR約14.8min。UFLC法在測(cè)定時(shí)間上較HPLC法快4倍多，且主峰峰型對(duì)稱，理論板數(shù)達(dá)7000左右，高于常規(guī)HPLC理論板數(shù)(約3000)。    (2)方法學(xué)驗(yàn)證論文參考網(wǎng)  

14、  Y=2.56908×105X-620.86    r=0.9999Y=7.0×106X    r=0.9954最低定量限(ng)60400最低檢測(cè)限(ng)20100    精密度  取對(duì)照品溶液2l注入高效相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，RSD為0.41%。    重復(fù)性和溶液穩(wěn)定性  取供試品溶液(A)2l注入高效相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，平均含量為104.5%，RSD為1.7%。另取供試品溶液(A)、(B)分別在室溫放置24h

15、后測(cè)定。24h后主峰峰面積減失百分率<2%，結(jié)果表明供試品溶液在24h內(nèi)較穩(wěn)定。    2.4  樣品測(cè)定    分別取克林霉素磷酸酯葡萄糖注射液和克林霉素磷酸酯氯化鈉注射液各8批，每批樣品平行分成2份，分別用UFLC法和常規(guī)HPLC法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)7，統(tǒng)計(jì)分析見表2。    由表2可知，兩方法測(cè)定克林霉素磷酸酯葡萄糖(氯化鈉)注射液的含量結(jié)果無顯著性差異。    2.5  有關(guān)物質(zhì)測(cè)定   

16、分別采用UFLC法和常規(guī)HPLC法測(cè)定，以主成分自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)。UFLC法與常規(guī)方法測(cè)得的有關(guān)物質(zhì)典型色譜圖見圖2。    從圖2可知，UFLC法可檢出7個(gè)雜質(zhì)峰，2號(hào)峰似融合峰，4、5、6號(hào)峰間的分離度不好；常規(guī)HPLC法表2      兩種克林霉素磷酸酯注射液的含測(cè)結(jié)果表3結(jié)果顯示，兩方法測(cè)定的結(jié)果相近。    3  討論    (1)UFLC方法的確定  本UFLC方法由標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)簡(jiǎn)單方法轉(zhuǎn)換而來。由于UFLC液相系統(tǒng)的壓

17、力界于常壓與超高壓液相系統(tǒng)之間(345485bar)，色譜柱采用短、細(xì)粒徑的ODS雜化柱，因此方法轉(zhuǎn)換中對(duì)樣品預(yù)處理方法、色譜流動(dòng)相、流速和進(jìn)樣體積需要重點(diǎn)考慮。實(shí)驗(yàn)中采用0.22m的濾膜過濾樣品及流動(dòng)相可以更有效除去雜質(zhì)對(duì)系統(tǒng)及色譜柱的污染，保持系統(tǒng)的穩(wěn)定。由于分析時(shí)間、柱分析效能及系統(tǒng)載壓三方面因素彼此相互影響且相互制約，因此尋找適合三方面要求的最佳實(shí)驗(yàn)條件是實(shí)現(xiàn)快速分析的關(guān)鍵。本文根據(jù)色譜有關(guān)理論8，對(duì)流速、進(jìn)樣體積進(jìn)行了優(yōu)化。考察流速在1.03.0ml/min范圍內(nèi)主峰的保留時(shí)間與系統(tǒng)壓力變化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為1.5ml/min時(shí)，tR已提前至4min左右，繼續(xù)增加流速雖然保留時(shí)間減

18、小，但系統(tǒng)壓力顯著上升；流速為2.0ml/min時(shí)，系統(tǒng)壓力已接近(485bar)。含量測(cè)定中，不同進(jìn)樣體積對(duì)主峰的拖尾因子(T)和理論板數(shù)(N)的影響見表4?？梢姡?、2l進(jìn)樣量測(cè)定的峰型對(duì)稱、柱效較高；但當(dāng)進(jìn)樣量減至1l，雖然峰型和柱效較高，但結(jié)果準(zhǔn)確性變差，連續(xù)進(jìn)樣的RSD>2%；增加進(jìn)樣量，色譜峰形逐漸變差，柱效下降；且過大進(jìn)樣量易造成色譜柱過載，影響分析的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。綜合上述表3      克林霉素磷酸注射液有關(guān)物質(zhì)結(jié)果分析 表4    不同進(jìn)樣體積的系統(tǒng)色譜參數(shù)分析，確定最佳流速為1.5ml/

19、min，進(jìn)樣體積為2l。    (2)UFLC分析的特點(diǎn)  比較UFLC法與常規(guī)HPLC法分析測(cè)定克林霉素磷酸酯含量及有關(guān)物質(zhì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)UFLC法測(cè)定克林霉素磷酸酯不僅準(zhǔn)確，而且比常規(guī)方法5，6更快速、靈敏，特別適合于對(duì)克林霉素磷酸酯含量的快速測(cè)定，在工作量較大的檢測(cè)項(xiàng)目如制劑含量、含量均勻度及溶出度等中應(yīng)用，能有效提高工作效率。但實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，經(jīng)簡(jiǎn)單方法轉(zhuǎn)換建立的UFLC方法的專屬性、準(zhǔn)確性均不如常規(guī)HPLC法，影響對(duì)雜質(zhì)的定性及限度控制?？焖俜治隼蒙V柱粒徑細(xì)、柱短這一特點(diǎn)爭(zhēng)取了分析時(shí)間，但同時(shí)也使得峰容量損失4。在對(duì)復(fù)雜樣品的分析中，這種分析時(shí)間與分析效果間的矛盾更加明顯。因此，如希望采用UFLC法分析復(fù)雜體系如藥品的有關(guān)物質(zhì)，一般不能通過簡(jiǎn)單的方法轉(zhuǎn)換而實(shí)現(xiàn)，而應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的特性及UFLC色譜柱的性質(zhì)，通過深入的實(shí)驗(yàn)研究建立相應(yīng)的分析方法。    本研究將UFLC新技術(shù)應(yīng)用于克林霉素磷酸酯含量及有關(guān)物質(zhì)的分析中，為藥品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室更有效地解決目前面臨的大批量樣品檢測(cè)的工作難題提供了一種思路，同時(shí)也為今后應(yīng)用UFLC技術(shù)進(jìn)行藥物分析提供了有價(jià)值的參考?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 ZK(#Nikolin B, Imamovic B, Medanhozic?vuk