慢性HBV感染者外周血單個核細(xì)胞干擾素γ的表達(dá)及其影響因素

1、慢性HBV感染者外周血單個核細(xì)胞干擾素-的表達(dá)及其影響因素 作者：陳瑞琳，藺淑梅，張樹林，葉峰，張曦，趙英仁【摘要】 目的 探討慢性乙肝病毒(HBV)感染者干擾素-(IFN-)的表達(dá)水平及其影響因素。方法 采用實時定量RT-PCR技術(shù)和ELISA法分別檢測慢性HBV感染者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中IFN- mRNA的表達(dá)和血清IFN-的分泌水平；巢式PCR技術(shù)檢測PBMCs中HBV DNA。結(jié)果 慢性HBV感染者IFN-的表達(dá)和分泌水平均明顯低于對照組(P<0.01，P<0.05)；慢性HBV攜帶者IFN-的表達(dá)和分泌水平均顯著低于HBeAg陽性組(P均<0.05)和H

2、BeAg陰性組(P均<0.01)；HBeAg陽性組IFN-的表達(dá)和分泌水平均明顯低于HBeAg陰性組(P均<0.01)；PBMCs中HBV DNA陽性組IFN-的表達(dá)和分泌水平均明顯低于HBV DNA陰性組(P均<0.01)；IFN-表達(dá)和分泌水平與血清HBV DNA水平均呈負(fù)相關(guān)(P均<0.01)。結(jié)論 慢性HBV感染者IFN-低表達(dá)；高病毒載量可抑制IFN-的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 乙型病毒性肝炎 乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA) 外周血單個核細(xì)胞 干擾素-(IFN-)ABSTRACT: Objective To study the expression of int

3、erferon- (IFN-) in peripheral blood monocytes (PBMCs) in patients with chronic HBV infection and factors that may affect its expression. Methods The expression of IFN- mRNA and secretion of IFN- in chronic HBV infectious patients were determined by real-time RT-PCR and ELISA, respectively; HBV DNA i

4、n PBMCs was detected by nested-PCR. Results The expression and secretion of IFN- were all significantly lower in chronic HBV infectious patients than in controls (P<0.01, P<0.05). The expression and secretion of IFN- were all obviously lower in chronic HBV carriers than in HBeAg positive group

5、 (P<0.05, P<0.05) and HBeAg negative group (P<0.01, P<0.01). The expression and serection of IFN- were all significantly lower in HBeAg positive group than in HBeAg negative group (P<0.01, P<0.01). The expression and secretion of IFN- showed significantly lower level in HBV DNA fro

6、m PBMCs positive group than in HBV DNA negative group (P<0.01, P<0.01); the expression and secretion of IFN- were negatively correlated with the amounts of HBV DNA in serum (P<0.01, P<0.001). Conclusion The expression of IFN- in chronic HBV infectious patients was lower; high amounts of

7、HBV DNA may inhibit the expression of IFN-.KEY WORDS: viral hepatitis B; HBV DNA; peripheral blood monocyte; interferon-(IFN-)多年來研究認(rèn)為，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染慢性化是機體免疫功能紊亂，主要是細(xì)胞免疫功能低下所致。干擾素-(IFN-)主要由活化的Th1細(xì)胞、NK細(xì)胞產(chǎn)生，是一個重要的免疫反應(yīng)調(diào)控因子，其活性水平直接反映了Th1細(xì)胞的功能，與HBV感染后的結(jié)局密切相關(guān)。以往大多研究是從慢性乙型肝炎(CHB)臨床分型角度來研究I

8、FN-的表達(dá)，未考慮病情輕重及病程長短對檢測結(jié)果的影響1-4，因而檢測結(jié)果不一。此外，我們在臨床上經(jīng)常觀察到免疫刺激治療對高病毒載量CHB患者療效甚差，而IFN-又與乙肝病毒(HBV)清除關(guān)系密切，故我們從乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)的角度來研究IFN-，探討相同臨床分型和相近病程的90例慢性HBV感染者IFN-的表達(dá)。1 材料與方法1.1 研究對象選取2007年1月至2007年7月在本院感染科門診就診和住院的慢性HBV感染者共90例，診斷符合2000年中華醫(yī)學(xué)會西安會議修訂的病毒性肝炎防治方案標(biāo)準(zhǔn)5。90例慢性HBV感染者包括：30例HBeAg陽性CHB患者，30例HBeAg陰性CHB

9、患者，30例慢性HBV攜帶者。CHB患者臨床分型均為慢性中度，病程3-5年。所有患者均排除甲肝病毒、丙肝病毒、丁肝病毒、戊肝病毒、柯薩奇病毒等感染和藥物、酒精等其他原因造成的肝臟損害。健康對照者30例，均來自西安市健康獻(xiàn)血員。所有入組成員血清HBV DNA定量已在本院生化室檢測。兩組臨床資料見表1。表1 慢性HBV感染者及對照組的臨床資料（略）1.2 標(biāo)本采集與處理無菌采集未抗凝靜脈血2 mL及肝素抗凝靜脈血10 mL。未抗凝靜脈血-4 離心后立即分離血清，-20 凍存；肝素抗凝靜脈血常規(guī)密度梯度法分離淋巴細(xì)胞后，洗滌細(xì)胞5次，以盡可能去除殘留的血漿HBV DNA，分別收集第5次洗液(500

10、L)和細(xì)胞。將細(xì)胞分兩份，一份-70 保存，用于檢測外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中乙肝病毒核酸；另一份按1107個細(xì)胞/mL加入1 mL TRIzol Reagent(美國invitrogen公司)，-70 凍存，用于提總RNA。同時收集健康對照組未抗凝及抗凝血作為對照。1.3 巢式PCR檢測PBMCs中的HBV DNA引物設(shè)計在HBV的S基因保守序列，外側(cè)上游引物序列：5-CATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG-3，下游引物序列：5-TTAGGGTTTAAATGTATACCC-3；內(nèi)側(cè)上游引物序列：5-TCTATGTTTCCCTCTTGTTGC-3，下游引物序列：5-TACCACAT

11、CATCCATATAACTG-3。PCR體系與反應(yīng)條件：總體積25 L，包括2.5 L 10緩沖液(Buffer 含20 mmol/L Mg2+)，1 L 100 mol/L dNTPs，外側(cè)引物各1 L(終濃度為0.2 mol/L)，待測模板5 L，Taq DNA 聚合酶0.2 L(1 u)，純水補足至25 L。次輪PCR體系：取首輪PCR產(chǎn)物1 L作為待測模板，余與首輪PCR體系相同。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性94 300 s、94 60 s、58 50 s、72 60 s，30個循環(huán)，72 延伸10 min。擴增產(chǎn)物長度分別為416 bp、206 bp。每次實驗均設(shè)陽性、陰性及空白對照。陽性

12、對照為已知CHB患者的血清，陰性對照為正常人PBMCs中DNA，空白對照為不加模板的PCR反應(yīng)體系。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。1.4 PBMCs中總RNA的提取常溫解凍TRIzol Reagent保存的PBMCs，按TRIzol試劑說明書提取總RNA。用比色法(紫外線下吸收峰值)測定RNA濃度A260/A280比值，比值在1.8-2.0者用于后續(xù)實驗。1.5 cDNA合成及實時定量RT-PCR用Re-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(立陶宛Fermentas公司)將上述方法提取的總RNA 2 g分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。IFN-及

13、內(nèi)對照-actin擴增引物均由大連TaKaRa公司設(shè)計和合成。IFN-上游引物：5-GCAGCCAACCTAAGCAAG-3(nt893-911)，下游引物：5-TCACCTGACACATTCAAGTTC-3(nt 1 042-1 063)。內(nèi)對照-actin 上游引物：5-GAACGGTGAAGGTGACAGCAG-3(nt1 351-1 372)，下游引物：5-GTGGACTTGGGAGAGGACTGG-3(nt1 529-1 550)。按SYBR Premix EX Taq(perfect real time)試劑盒(大連TaKaRa公司)說明書操作，用熒光染料嵌合法(SYBR Gree

14、n )同時檢測IFN-和-actin的表達(dá)，以IFN-/-actin比值反映IFN- mRNA的表達(dá)水平。反應(yīng)在MJ Research DNA Engine OPTICONTM實時熒光PCR儀上進(jìn)行。每份樣本均復(fù)設(shè)3孔。1.6 血清IFN-水平檢測采用Human IFN- ELISA Kit(美國Bender公司)檢測血清IFN-水平，試劑盒靈敏度為0.06 pg/mL。依標(biāo)準(zhǔn)品D()值作標(biāo)準(zhǔn)曲線，再計算待測樣品中細(xì)胞因子含量，每份樣本均設(shè)2復(fù)孔。每次均設(shè)陽性、空白對照。1.7 統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用(s)表示，組間比較采用t檢驗，兩率的比較用2檢驗。所有統(tǒng)計均通過SPSS 13.0軟件進(jìn)行。

15、P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 慢性HBV感染者PBMCs中IFN- mRNA的表達(dá)慢性HBV感染者PBMCs中IFN- mRNA表達(dá)水平明顯低于健康對照組(P<0.01)；慢性HBV攜帶者PBMCs中IFN- mRNA的表達(dá)顯著低于HBeAg陽性組和HBeAg陰性組(P<0.05，P<0.01)；HBeAg陽性組IFN- mRNA的表達(dá)明顯低于HBeAg陰性組(P<0.01)。PBMCs中IFN- mRNA表達(dá)與血清HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.827, P<0.01)。不同組間結(jié)果見表2。2.2 慢性HBV感染者血清中IFN-水

16、平慢性HBV感染者血清IFN-水平顯著低于健康對照組(P<0.05)；慢性HBV攜帶者血清IFN-水平顯著低于HBeAg陽性組和HBeAg陰性組(P<0.05，P<0.01)；HBeAg陽性組血清IFN-水平明顯低于HBeAg陰性組(P<0.01)。PBMCs中IFN- mRNA表達(dá)與血清IFN-分泌水平呈正相關(guān)(r=0.898, P<0.01)；血清IFN-分泌水平與血清HBV DNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.822, P<0.01)。不同組間結(jié)果見表2。表2 慢性HBV感染者IFN-表達(dá)和分泌水平（略）2.3 慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA的檢

17、測結(jié)果慢性HBV感染者PBMCs中HBV DNA總陽性檢出率為68.88%；慢性HBV攜帶者(83.33%)、HBeAg陽性組(80.00%)PBMCs中HBV DNA陽性檢出率明顯高于HBeAg陰性組(43.33%)(P均<0.01)，但慢性HBV攜帶者和HBeAg陽性組之間陽性檢出率無明顯差異(P>0.05)。HBV DNA陽性組和HBV DNA陰性組IFN- mRNA表達(dá)分別為0.5460.515、0.9861.272，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；HBV DNA陽性組和HBV DNA陰性組IFN-分泌水平分別為(2.9822.434)pg/mL、(5.7684.

18、365)pg/mL，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。HBV DNA 陽性組血清HBV DNA 載量高于HBV DNA陰性組(P<0.01)。PCR擴增后PBMCs中HBV DNA電泳結(jié)果見圖1。3 討 論乙型肝炎慢性化會導(dǎo)致嚴(yán)重不良后果，而其慢性化主要與免疫功能紊亂有關(guān)。IFN-不僅可直接抗病毒，而且具有免疫調(diào)節(jié)功能，可增加細(xì)胞表面主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC-)和主要組織相容性抗原復(fù)合物(MHC-)的表達(dá)，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞Fc受體、白介素2受體(IL-2R)、腫瘤壞死因子受體(TNF-R)的表達(dá)；激活巨噬細(xì)胞抗原處理功能，聚集特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的應(yīng)答，增強NK細(xì)胞

19、活性；下調(diào)Th2細(xì)胞產(chǎn)量等6-7。此外，越來越多證據(jù)表明Th1細(xì)胞通過IFN-非溶細(xì)胞機制在抑制病毒復(fù)制中起著越來越重要的作用8。這些功能中任何一個方面的下降都將導(dǎo)致HBV感染的慢性化。已有的研究表明，急性自限性肝炎產(chǎn)生的IFN-顯著高于健康對照及慢性肝炎9；而慢性HBV感染者外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)不論用特異性抗原(HBeAg、HBcAg、HBsAg)還是非特異抗原(PHA)刺激，IFN-表達(dá)和分泌水平均較健康對照明顯減低9-11。亦有研究發(fā)現(xiàn)慢性HBV感染者PBMCs產(chǎn)生IFN-水平高于健康對照，但低于急性肝炎者12，并且臨床分型之間IFN-水平有差異，但無統(tǒng)計學(xué)意義。以上檢測結(jié)果的

20、差異與未考慮病情輕重及病程長短對檢測結(jié)果影響有關(guān)1-4。我們的實驗結(jié)果顯示，慢性HBV感染者IFN-表達(dá)水平降低，以炎癥反應(yīng)輕的慢性HBV攜帶者最低，HBeAg陽性組次之，轉(zhuǎn)氨酶水平相對較高的HBeAg陰性組最高，表明在排除病程及病情的影響因素后，慢性HBV感染者存在著IFN-表達(dá)的異常，且IFN-水平的增高伴隨著炎性反應(yīng)的加重，提示IFN-水平對不同疾病狀態(tài)及預(yù)后有較好指導(dǎo)意義。而IFN-表達(dá)和分泌水平下降將導(dǎo)致Th1細(xì)胞分化減少，對Th2細(xì)胞下調(diào)減弱，Th1/Th2細(xì)胞比例失調(diào)，導(dǎo)致Th2細(xì)胞占優(yōu)而抑制細(xì)胞免疫；單核細(xì)胞分泌IL-12減少，減弱Th1細(xì)胞應(yīng)答?？赡苷沁@種不充分的細(xì)胞免疫應(yīng)

21、答不能完全清除病毒而引起肝臟持續(xù)性損傷導(dǎo)致慢性化形成。我們進(jìn)一步研究了影響IFN-表達(dá)的因素，不同組之間IFN-的表達(dá)以及IFN-表達(dá)與血清HBV DNA載量之間的關(guān)系均表明HBV感染可抑制IFN-水平，且HBV DNA負(fù)荷越高，對IFN-抑制越明顯。Schlaak等13研究亦發(fā)現(xiàn)血清中高HBV DNA載量可抑制IL-12對HBV抗原誘導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答的促進(jìn)作用，而IL-12抗病毒效應(yīng)主要是誘導(dǎo)Th細(xì)胞產(chǎn)生IFN-。慢性HBV感染者低IFN-表達(dá)可能是乙肝病毒免疫逃逸、機體產(chǎn)生免疫耐受狀態(tài)導(dǎo)致慢性化的重要原因。目前仍無有效辦法打破機體免疫耐受狀態(tài)，免疫刺激治療療效不一，徹底清除HBV難度較大

22、。而高病毒載量對IFN-抑制作用為臨床治療慢性HBV感染提供了另一種思路，即先用核苷類似物降低HBV DNA載量，減輕對IFN-抑制作用，再用免疫刺激治療，目前已應(yīng)用于臨床，療效正在觀察中。我們從mRNA和蛋白質(zhì)水平證實機體感染HBV后IFN-的表達(dá)和分泌異常，又從多個角度表明高載量HBV可抑制IFN-表達(dá)，但其分子機制尚不明確。有資料顯示IFN-表達(dá)異?？赡芘cHBV感染致IFN-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)障礙(包括轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、染色體結(jié)構(gòu)重塑、啟動子甲基化)有關(guān)14-15。探討HBV感染時IFN-基因表達(dá)異常的分子機制將有助于我們更進(jìn)一步理解乙型肝炎的發(fā)病機理。目前有關(guān)這方面研究甚少。【參考

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