熒光光譜在蛋白質(zhì)研究中實際應(yīng)用

1、熒光光譜在蛋白質(zhì)研究中實際應(yīng)用一、基本原理一、基本原理 1 1、熒光的產(chǎn)生、熒光的產(chǎn)生2 2、熒光的壽命：、熒光的壽命：1010-8-81010-4 -4 s s3 3、磷光的壽命：、磷光的壽命： 1010-4-410102 2 s s4 4、紫外的壽命：、紫外的壽命： 1010-15 -15 s s 紫外觀察不到的過程，其它兩種光譜可以觀察到，如紫外觀察不到的過程，其它兩種光譜可以觀察到，如生色團(tuán)及其環(huán)境的變化。生色團(tuán)及其環(huán)境的變化。5 5、由于它是發(fā)射光譜，所以靈敏度很高。、由于它是發(fā)射光譜，所以靈敏度很高。6 6、磷光、磷光 二、儀器結(jié)構(gòu)與主要光譜參量二、儀器結(jié)構(gòu)與主要光譜參量1 1、儀

2、器結(jié)構(gòu)、儀器結(jié)構(gòu)2 2、主要光譜參量、主要光譜參量（1 1）吸收譜、熒光激）吸收譜、熒光激發(fā)光譜、及熒光發(fā)射發(fā)光譜、及熒光發(fā)射光譜光譜 N-N-甲基咔唑在環(huán)己烷甲基咔唑在環(huán)己烷（2 2）熒光壽命）熒光壽命 去掉激發(fā)光后，分子的熒光強度去掉激發(fā)光后，分子的熒光強度(I(I0 0) )將到將到1/e 1/e I I0 0所需要的時間，用所需要的時間，用 表示，表示， = 1/k= 1/k。如。如果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，熒果激發(fā)態(tài)分子只以發(fā)射熒光的方式丟失能量，熒光壽命稱為光壽命稱為 F F, , 它與它與k kF F（熒光發(fā)射速率常數(shù)）成（熒光發(fā)射速率常數(shù)）成反比，反比， F F可

3、以給出有關(guān)分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面的可以給出有關(guān)分子結(jié)構(gòu)和動力學(xué)方面的信息。信息。（3 3）量子產(chǎn)率）量子產(chǎn)率 表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率，用表示物質(zhì)發(fā)射熒光的效率，用 表示。發(fā)射表示。發(fā)射熒光分子在全部退激分子中所占比例。熒光分子在全部退激分子中所占比例。（4 4）熒光強度）熒光強度 F (I) = k PF (I) = k P0 0 C C三、影響熒光的因素三、影響熒光的因素1 1、熒光與化合物的結(jié)構(gòu)、熒光與化合物的結(jié)構(gòu)（1 1）躍遷類型）躍遷類型 * * 能發(fā)出較強的熒光，所以能發(fā)出較強的熒光，所以 * * 是產(chǎn)生熒光的主是產(chǎn)生熒光的主要類型，主要是由于？。要類型，主要是由于？。（2 2）共軛效

4、應(yīng)）共軛效應(yīng) 增大熒光物質(zhì)的增大熒光物質(zhì)的 ，從而使更多分子處于激發(fā)態(tài)，有利于熒，從而使更多分子處于激發(fā)態(tài)，有利于熒光的發(fā)射。光的發(fā)射。（3 3）剛性結(jié)構(gòu)與共平面效應(yīng)）剛性結(jié)構(gòu)與共平面效應(yīng)（4 4）取代基效應(yīng)）取代基效應(yīng) 給電子基團(tuán)如：給電子基團(tuán)如：-OH, -NH-OH, -NH2 2, -OCH, -OCH3 3, , 通過通過p- p- 共軛，增強熒共軛，增強熒光光. . 吸電子基團(tuán)如：吸電子基團(tuán)如：-NO-NO2 2, -COOH, , -COOH, 降低熒光降低熒光. .（5 5）溶劑的影響）溶劑的影響 極性增加，極性增加，發(fā)生紅移。（發(fā)生紅移。（1-1-氨基氨基-8-8-萘磺酸萘磺

5、酸酯），從辛醇酯），從辛醇乙二醇，紅移且乙二醇，紅移且強度降低。強度降低。（6 6）熒光淬滅因素）熒光淬滅因素 a. a. 碰撞淬滅碰撞淬滅 b. b. 能量轉(zhuǎn)移能量轉(zhuǎn)移 c. c. 氧的淬滅作用氧的淬滅作用 d. d. 自淬滅自淬滅 e. e. 光照光照四、熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用四、熒光在蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用1 1、蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光、蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光 主要來自主要來自Trp, Tyr, Phe, Trp, Tyr, Phe, 相對強度比為相對強度比為100 : 9 : 0.5.100 : 9 : 0.5.對于含有對于含有Trp, Trp, 蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)TrpTrp的特征的特征

6、, , 最最大發(fā)射在大發(fā)射在320-350 nm320-350 nm之間之間. .如果只有如果只有TyrTyr和和Phe,Phe,蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)蛋白質(zhì)主要表現(xiàn)TyrTyr的特征的特征, , 最大發(fā)射波長在最大發(fā)射波長在304 nm304 nm之間之間. .(1)(1) 應(yīng)用應(yīng)用: :反應(yīng)計量比的測定反應(yīng)計量比的測定020406080120140160180200220240280320360400440050100150200250Fluorescence Intensity (a. u.)Wavelength (nm)Fluorescence Intensity (a. u.)Fe(II)/

7、Protein24 Fe(II)/PA反應(yīng)動力學(xué)反應(yīng)動力學(xué)0123405101520253035404550 Fluorescence Intensity (a.u.)k2 k1 A BCTime (s)2. Ca2. Ca2+2+對對phospho-phospho-calsequestricalsequestrin n蛋白的影響蛋白的影響 熒光增強熒光增強且藍(lán)移表且藍(lán)移表明明:Trp:Trp的微環(huán)的微環(huán)境從極性表面境從極性表面轉(zhuǎn)移到疏水內(nèi)轉(zhuǎn)移到疏水內(nèi)部部. .Appl. Phys. 2000, B71, 755-763Appl. Phys. 2000, B71, 755-7633. Zn3.

8、 Zn2+2+對氨基?；笇Π被；傅挠绊懙挠绊? : 熒光降低且紅移熒光降低且紅移, , TrpTrp從疏水內(nèi)部向從疏水內(nèi)部向外部移動外部移動. .4. 4. 外源熒光的應(yīng)用外源熒光的應(yīng)用5 5、共振能量轉(zhuǎn)移、共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量（熒光共振能量（FRETFRET）轉(zhuǎn)移及應(yīng)用）轉(zhuǎn)移及應(yīng)用輻射能量轉(zhuǎn)移輻射能量轉(zhuǎn)移 熒光分子發(fā)射的熒光為某一物質(zhì)分子吸收，熒光分子發(fā)射的熒光為某一物質(zhì)分子吸收，前者（能量給予體前者（能量給予體,D,D）的熒光減弱或猝滅，后者）的熒光減弱或猝滅，后者（能量接受體（能量接受體, A, A）被激發(fā)：）被激發(fā)： D D* * D + D + A + A + A A* *

9、 非輻射能量轉(zhuǎn)移非輻射能量轉(zhuǎn)移 根據(jù)作用機理的不同，非輻射能量轉(zhuǎn)根據(jù)作用機理的不同，非輻射能量轉(zhuǎn)移分為共振能量轉(zhuǎn)移和交換能量轉(zhuǎn)移移分為共振能量轉(zhuǎn)移和交換能量轉(zhuǎn)移. . 共振能量轉(zhuǎn)移即熒光共振能量轉(zhuǎn)移，共振能量轉(zhuǎn)移即熒光共振能量轉(zhuǎn)移，機理是通過分子的偶極偶極耦合作用進(jìn)機理是通過分子的偶極偶極耦合作用進(jìn)行能量轉(zhuǎn)移，分子間有一定的距離。能量行能量轉(zhuǎn)移，分子間有一定的距離。能量傳遞距離甚至可達(dá)傳遞距離甚至可達(dá)10.0nm,10.0nm,也稱為長距也稱為長距離能量轉(zhuǎn)移離能量轉(zhuǎn)移. .給予體和接受體的共振能量轉(zhuǎn)移能級圖給予體和接受體的共振能量轉(zhuǎn)移能級圖能量轉(zhuǎn)移效率能量轉(zhuǎn)移效率 R RO O又叫又叫FrFr

10、sterster半徑（單位半徑（單位），在給予體和接），在給予體和接受體分子間的距離等于受體分子間的距離等于R RO O時，能量轉(zhuǎn)移和給予體的衰時，能量轉(zhuǎn)移和給予體的衰變幾率相等變幾率相等. .F FDADA為受體存在時供體的熒光強度為受體存在時供體的熒光強度; ; F FD D供體單獨存在時的熒光強度供體單獨存在時的熒光強度R RO O值的計算值的計算 A A1/21/2表示當(dāng)有表示當(dāng)有5050的能量轉(zhuǎn)移效率（即激的能量轉(zhuǎn)移效率（即激發(fā)態(tài)給予體的發(fā)態(tài)給予體的5050由熒光共振能量轉(zhuǎn)移去活由熒光共振能量轉(zhuǎn)移去活化）化）. .熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基本條件熒光共振能量轉(zhuǎn)移的基本條件 給予體和接受體分

11、子必須靠近（一般是給予體和接受體分子必須靠近（一般是1-10 nm1-10 nm），即在遠(yuǎn)大），即在遠(yuǎn)大于碰撞半徑（于碰撞半徑（r r）的距離上發(fā)生。）的距離上發(fā)生。 接受體的吸收光譜必須與給予體的熒光發(fā)射光譜重疊。接受體的吸收光譜必須與給予體的熒光發(fā)射光譜重疊。 給予體和接受體分子的偶極轉(zhuǎn)移空間定向必須近似平行。給予體和接受體分子的偶極轉(zhuǎn)移空間定向必須近似平行。 能量轉(zhuǎn)移效率與介質(zhì)的粘度變化無關(guān)。能量轉(zhuǎn)移效率與介質(zhì)的粘度變化無關(guān)。 最可能的熒光共振能量轉(zhuǎn)移是單重態(tài)最可能的熒光共振能量轉(zhuǎn)移是單重態(tài)- -單重態(tài)和三重態(tài)單重態(tài)和三重態(tài)- -單重態(tài)單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移過程能量轉(zhuǎn)移過程給予體和接受體對給予體

12、和接受體對給予體給予體接受體接受體Ro(Ro() )熒光素?zé)晒馑厮募谆_丹明四甲基羅丹明5555IAEDANSIAEDANS1 1熒光素?zé)晒馑?646EDANSEDANS2 2DABCYLDABCYL3 33333熒光素?zé)晒馑責(zé)晒馑責(zé)晒馑?444BODIPY FLBODIPY FL4 4BODIPY FLBODIPY FL5757BODIPY FLBODIPY FL四甲基羅丹明四甲基羅丹明四甲基羅丹明四甲基羅丹明CY5CY553531-1-氯蒽氯蒽苝苝41411-1-氯蒽氯蒽紅熒烯紅熒烯38381-1-氰蒽氰蒽紅熒烯紅熒烯8484菲菲熒光素?zé)晒馑?535* *三苯胺三苯胺葉綠素葉綠素5454*

13、 *N,N-N,N-二甲胺二甲胺9-9-甲蒽甲蒽2424* * *三重態(tài)三重態(tài)- -單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移；單重態(tài)能量轉(zhuǎn)移；1.5-(1.5-(碘乙酰碘乙酰) )氨基氨基 乙基乙基 氨基氨基 萘萘1-1-磺酸磺酸; ;四甲基羅丹明碘乙酰胺四甲基羅丹明碘乙酰胺菁染料菁染料Cy5Cy55-(2-IODOACETYL)AMINO)ETHYL)AMINO)NAPHTHALENE-1-SULFONICACID,IAEDANS5-(5-(碘乙酰碘乙酰) )氨基氨基 乙基乙基 氨基氨基 萘萘1-1-磺酸磺酸Msx(Msx-homeodomain) The msx homeodomain protein is a d

14、ownstream transcription factor of the bone morphogenetic protein (BMP)-4 signal and a key regulator for neural tissue differentiation. 接受體分子是接受體分子是, ,標(biāo)記蛋白質(zhì)中標(biāo)記蛋白質(zhì)中6 6，1010，2727位置位置的半胱氨酸；給予的半胱氨酸；給予5-(5-(碘乙酰碘乙酰) )氨基氨基 乙基乙基 氨基氨基 萘萘1-1-磺酸（磺酸（IAEDANSIAEDANS）體是蛋白質(zhì)分子中）體是蛋白質(zhì)分子中4848位置位置的色氨酸（的色氨酸（Trp-48Trp-48）

15、, ,能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在能量轉(zhuǎn)移發(fā)生在AEDANSAEDANS和和Trp-48Trp-48之間，據(jù)此計算在蛋白質(zhì)中之間，據(jù)此計算在蛋白質(zhì)中6 6，1010，2727位置位置到到4848位置的距離分別約是，和位置的距離分別約是，和1.6 nm.1.6 nm.研究研究型和突變體型和突變體型胞漿型胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別 通過用通過用1-1-苯胺基苯胺基8 8萘磺酸（萘磺酸（ANSANS）為接受體標(biāo)記）為接受體標(biāo)記胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的非催化位點，以胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的非催化位點，以胞漿谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶中的催化位點色氨酸（酶中的催化位點色氨酸（TrpTrp）殘基為給予體，

16、利用）殘基為給予體，利用FRETFRET研究人類研究人類型和突變體型和突變體型胞漿谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別。型胞漿谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶的區(qū)別。發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)，型中給予體型中給予體- -接受體間距離接受體間距離2.2 nm, 2.2 nm, 型中距離型中距離1.82 nm1.82 nm。ApplicationofFRETtotheGroELGroESChaperoninReaction, GroEL (EL315C + IAEDANS) EL513-D, GroES(ES98C + F5M) ES98-AMETHODS 24, 278288 (2001)6 6、綠色熒光蛋白、綠色熒光蛋白 綠色熒光蛋白空間結(jié)構(gòu)

17、綠色熒光蛋白空間結(jié)構(gòu) (Green Fluorescence Protein): 1962(Green Fluorescence Protein): 1962年年在水母中分離得到。它由在水母中分離得到。它由1111個個 - -折疊圍繞成一個折疊圍繞成一個 - -折疊桶，結(jié)構(gòu)中唯一折疊桶，結(jié)構(gòu)中唯一的一個的一個 - -螺旋在桶的中間。螺旋在桶的中間。 The mature protein resists many proteases and is stable up to 65 C and pH 5 to 11, in 1% sodium dodecyl sulfate or 6M guanid

18、iniam chloride. Fluorescent is optimal at pH 7.2 to 8.0. It requires only UV or blue light and oxygen for fluorescence without any cofactors or substrates. - -螺旋包括一個氨基酸三聯(lián)體：螺旋包括一個氨基酸三聯(lián)體：residues 65-67, Thr-Tyr-Glyresidues 65-67, Thr-Tyr-Gly，被埋在疏水的蛋白質(zhì)中間可以防止氧以及溶劑對熒光的淬滅被埋在疏水的蛋白質(zhì)中間可以防止氧以及溶劑對熒光的淬滅 。a a圖為圖

19、為GFP; GFP; b b是一種從珊瑚中發(fā)現(xiàn)的紅色熒光蛋白是一種從珊瑚中發(fā)現(xiàn)的紅色熒光蛋白 DsRed DsRed 。 GFP has a number of amazing properties that enable its use for in vivo imaging. Firstly, GFP can be expressed in a variety of cells, where it becomes spontaneously fluorescent without the aid of a cofactor. Secondly, GFP can be fused to a

20、host protein to create a fusion protein that usually retains both the fluorescence of the GFP and the biochemical function of the original host. Thirdly, fusion proteins can be targeted to specific organelles, such as the nucleus or endoplasmic reticulum, by adding an appropriate signaling peptide.

21、Finally, and most importantly, mutagenesis of GFP has produced many mutants with varying spectral properties that can be used as donors and acceptors of FRET.Activation of intracellular proteases such as caspase is an important event in programmed cell death. It has been demonstrated that tumor necr

22、osis factor (TNF), Fas ligand and chemotherapeutic drugs, are able to induce apoptosis by activating caspase.Caspase activation and proteolytic cleavage of specific target proteins represents an integral step in the pathway leading to theapoptotic death of cells. Analysis of caspase activity in intact cells, however, has been generally limited to the measurement of end-point biochemical and morphological markers of apoptosis.Substrates of group II caspase share a consensus recognition and cleavage amino acid sequence: DXXD.