骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損的實驗研究

1、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損的實驗研究    【摘要】  探尋體外誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞的最佳細(xì)胞因子，尋求體內(nèi)修復(fù)家兔軟骨缺損的最為有效方案。方法rhFGF1、rhTGF-1、rhIGF-I單獨或聯(lián)合應(yīng)用對骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，應(yīng)用常規(guī)染色、MTT、免疫組織化學(xué)染色的方法篩選誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成軟骨細(xì)胞的最佳細(xì)胞因子，并將其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合于纖維蛋白凝膠制成凝膠復(fù)合物，直接種植到兔膝關(guān)節(jié)實驗性關(guān)節(jié)軟骨缺損處，并與對照組相比較，觀察軟骨修復(fù)效果。結(jié)果常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，rhTGF-1和rhIGF-I聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)的細(xì)胞在形態(tài)上類似于

2、軟骨細(xì)胞，免疫組化染色提示誘導(dǎo)細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞表型。凝膠復(fù)合物直接種植在體內(nèi)能誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化，修復(fù)缺損的軟骨，缺少細(xì)胞因子的對照組軟骨缺損修復(fù)效果差。結(jié)論rhTGF-1和rhIGF-I聯(lián)合應(yīng)用可作為誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的最佳組合，骨髓基質(zhì)干細(xì)胞凝膠復(fù)合物能修復(fù)軟骨缺損。 【關(guān)鍵詞】  細(xì)胞因子 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞 軟骨細(xì)胞 軟骨缺損    Abstract：ObjectiveTo retrieval a best cell factor which can induce bone marrow stromal cells (bM

3、SCs) into chondrocyte in vitro and to explore an effective plan to repair rabbit#39;s chondrocyte defect.MethodIsolated bMSCs were cultured in vitro. rh Fibroblast Growth Factor 1(rhFGF-1)、rh Transforming Growth Factor-1(rhTGF-1)、rh Insulinlike Growth Factor-(rhTGF-) were utilizated. The proliferati

4、on of  cells was detected by MTT assay, and the macroscopic histology , HE staining and immunohistochemical examinations were performed  to seek the best cell factor. In vivo , to investigate the repair of the articular cartilage, bMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-1、rhIGF-I was com

5、pared with control group.ResultThe cells induced by rhTGF-1 and rhIGF-I were similar to chondrocytes in morphology, and immunohistochemical examinations showed the cells possessed phenotype of chondrocytes. RhTGF-1 and rhIGF-I could differentiate bone marrow stromal cells into cartilage cells in viv

6、o, and repair the articular cartilage defect. The control group could not repair the articular cartilage defect efficiently.ConclusionrhTGF-1 and rhIGF-I are best group which stimulate bMSCs to differenate into cartilage cells. BMSCs combined with fibrin glue and rhTGF-1、rhIGF-I can repair the artic

7、ular cartilage defect.    Key words：cell factor;  bone marrow stromal cells;  chondrocyte;  cartilage defect         作者簡介：童培建(1961-)，男，杭州人，教授，主任醫(yī)師，在讀博士研究生，研究方向：關(guān)節(jié)外科，(電話#160;   骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中含有少量的多功能基質(zhì)干細(xì)胞，能向成骨系

8、細(xì)胞、成軟骨系細(xì)胞分化1，為骨、軟骨組織的損傷提供了潛在的修復(fù)可能。臨床軟骨缺損自行修復(fù)的效果較差，可能跟軟骨損傷局部BMSCs的含量少有關(guān)。因此作者通過對BMSCs在體外擴(kuò)增培養(yǎng)、應(yīng)用不同的細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)，從中尋找體外促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的最佳條件，并將細(xì)胞因子與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合于纖維蛋白凝膠制成凝膠復(fù)合物，植入缺損處，探討體內(nèi)修復(fù)家兔軟骨缺損的效果。    1  材料與方法    1.1  骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的取材與培養(yǎng)    取新生紅皮胎兔只（24 h內(nèi)），置入濃度為75的

9、酒精中浸泡消毒5 min，在超凈工作臺中，無菌分離四肢長骨骨干，剔除軟組織，在10的DMEM培養(yǎng)液中剖開骨干，反復(fù)吹打髓腔。將細(xì)胞懸液移入離心管中，加入Hank#39;s液至10 ml，平衡，1 500 rmin離心10 min，棄上清，加入10 DMEM，反復(fù)抽吸吹打均勻，計數(shù)，按1×10接種于 ml培養(yǎng)瓶中，37 5飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。5 d后首次全量換液，以后每3 d換液1次，待細(xì)胞融合至80時，0.25胰蛋白酶常規(guī)消化，按:比例傳代培養(yǎng)。逐日倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長情況。    1.2  體外實驗分組  &

10、#160;  實驗分組如下：rhFGF-1組（簡稱F組）；rhIGF-組（簡稱I組）；rhTGF-1組（簡稱T組）；rhFGF-1+ rhIGF-I組（簡稱F+I組）；rhFGF-1+ rhTGF-1組（簡稱F+T組）；rhIGF-I+rhTGF-1組（簡稱I+T組）；rhFGF-1+rhIGF-I+rhTGF-1組（簡稱F+I+T組）；對照組（不加任何試劑）。其中rhFGF-1濃度為10 g/L; rhIGF-I濃度為10 g/L; rhTGF-1 I濃度為5 g/L。    1.3  MTT比色法測定   &#

11、160; 取第2代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以1×104/ml接種到96孔培養(yǎng)板上，共4塊，常規(guī)培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，棄上清液，將每塊孔板隨機(jī)分組，每組8孔，按實驗分組添加相應(yīng)的細(xì)胞因子，分別于第1、3、6、9 d各取孔板1塊，進(jìn)行MTT檢測：即每孔加50 mg/ml的MTT液20 l,常規(guī)培養(yǎng)4 h，棄廢液，0.1%PBS液清洗1次，加入二甲亞砜，每孔150 l，靜置20 min后，用酶標(biāo)儀測定波長為490 nm的吸光度值。    1.4  體外細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    將細(xì)胞進(jìn)行HE、膠原免疫組化測定（ABC法），倒

12、置顯微鏡下觀察。    1.5  纖維蛋白凝膠復(fù)合體的制備     傳代培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)0.1%胰蛋白酶0.02%EDTA消化后，1000 r/min離心10 min濃集，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。制成單細(xì)胞懸液，與纖維蛋白原溶液混勻。使纖維蛋白原和骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的終濃度分別為2.5 g/L和5×106/ml，每毫升再加入rhTGF- 15 ng/5 l和rhIGF-I50 ng/50 l。然后加入凝血酶20 U/ml。制成凝膠備用（2 h內(nèi)使用）。    1.6  體內(nèi)

13、實驗分組    32只家兔，雌雄不限，隨機(jī)分為4組。無菌條件下后肢右股骨髁滑車關(guān)節(jié)面鉆孔，直徑3.5 mm、深3.0 mm，達(dá)軟骨下骨。干細(xì)胞復(fù)合體組：缺損中直接種植纖維蛋白凝膠復(fù)合體；單純凝膠復(fù)合體組：缺損植入未加細(xì)胞因子的凝膠復(fù)合體；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注射組：缺損單純注射濃度為5×106/ml骨髓基質(zhì)干細(xì)胞懸液0.5 ml；空白組：缺損不作處理。不固定術(shù)肢，自由活動。分別于4、8、12周處死取材。標(biāo)本10福爾馬林固定。行HE、     Masson三色、甲苯胺藍(lán)染色檢查。第12周標(biāo)本行透射電鏡檢查。 &#

14、160;  1.7  體內(nèi)組織形態(tài)學(xué)評分     參照O#39;Driscoll，Keeley and Salter組織形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。對實驗組和對照組修復(fù)組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行半定量評分（表2）。    1.8  統(tǒng)計學(xué)處理     實驗數(shù)據(jù)用±s表示，顯著性檢驗采用t檢驗。P0.05為差異有顯著性。使用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。    2  結(jié)  果   

15、; 2.1  體外細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察    貼壁細(xì)胞呈梭形、紡錘形、多角形等，有不規(guī)則的生長突生出，細(xì)胞基質(zhì)折光性強(qiáng)；45 d后細(xì)胞形成集落狀，形態(tài)比較單一，基本上呈梭形或多角形；78 d后形成單層。    首次傳代的細(xì)胞呈圓形，24 h后恢復(fù)梭形，折光性好，細(xì)胞呈均勻生長，形態(tài)更加單一，基本呈梭形。8 d后可鋪滿瓶底，形成單層結(jié)構(gòu)，排列呈有規(guī)律的方向性（圖1）。經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的細(xì)胞，對照組、T組生長速度有所減慢，10 d左右形成單層結(jié)構(gòu)；I+T組形態(tài)由梭形變?yōu)橐陨蓉愋位蚨嘟切螢橹?，?xì)胞核深染（圖2）；F組生長加快，在5 d形成

16、單層，形態(tài)以長梭形為主（圖3）。免疫組化染色顯示：細(xì)胞基質(zhì)呈棕黃色，染色較均勻，證明膠原存在2，部分細(xì)胞不著色(圖4)。細(xì)胞經(jīng)蘇木素復(fù)染后可見細(xì)胞核深染，免疫組化染色后的細(xì)胞形態(tài)在鏡下成圓形、橢圓形或多角形，不同于前2代的細(xì)胞形態(tài)(圖5)。免疫組化染色（隨機(jī)鏡野）陽性率面積接近50%（圖4、6）。圖1  p1代 4×10  圖2  HE（I+T組）10×40  圖3  HE（F組）10×20  圖4  免疫組化（I+T組）10×20  圖5  免疫組化（I+T組）1

17、0×40  圖6  免疫組化（I+T組）10×20論文出處(作者):    2.2  誘導(dǎo)細(xì)胞增殖測定(MTT)     第1、3 d MSCs細(xì)胞處于增殖靜止期；細(xì)胞在第3 d開始進(jìn)入對數(shù)增殖期，細(xì)胞增殖迅速，以F組增殖最為顯著，第6 d達(dá)到高峰；第9 d多數(shù)實驗組進(jìn)入增殖平臺期，增殖速度相對減緩，而I+T組仍保持增殖的趨勢（見表1）。MTT測定3 d時各組細(xì)胞均有不同程度的增殖；6 d時F組、I組、F+I組、F+T組細(xì)胞增殖較快，與對照組相比，P<0.01，其它組細(xì)

18、胞增殖速度不明顯；9 d時，F(xiàn)組、F+T組、F+I+T組與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；F+I組P<0.05。表1  生長因子在不同時間對MSCs的增殖活性的影響注：*與對照組比較P0.05；*與對照組比較P<0.01；    2.3  修復(fù)軟骨的大體觀察     術(shù)后4周，干細(xì)胞復(fù)合體實驗組標(biāo)本可見缺損處由白色、半透明類軟骨樣組織所填充，與正常軟骨組織界限清楚，表面不光滑。術(shù)后8周，缺損處修復(fù)組織變成乳白色，半透明光滑組織，與周圍軟骨組織邊界開始變模糊。術(shù)后12周，缺損修復(fù)組

19、織與周圍正常軟骨組織已基本難區(qū)分，表面平坦（圖7）。單純凝膠復(fù)合體組12周缺損呈乳白色，表面平坦，邊界模糊。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注射組12周缺損處凹陷，肉芽組織生長（圖8）。空白組12周缺損處肉芽組織填充表面仍稍凹陷，與周圍正常軟骨組織界限仍清楚。    2.4  修復(fù)軟骨HE染色    第12周干細(xì)胞復(fù)合體實驗組的修復(fù)軟骨與正常軟骨整合良好，各層結(jié)構(gòu)清晰，新生軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，排列已經(jīng)類似正常軟骨，潮線明顯，表面未見裂縫（圖9）?？瞻捉M修復(fù)組織內(nèi)見少量的細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)異常，纖維組織填充。單純復(fù)合體組見細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)正常，

20、與周圍組織整合良好。    2.5  修     復(fù)軟骨Masson三色    干細(xì)胞復(fù)合體實驗組12周，軟骨細(xì)胞數(shù)量多，排列較前規(guī)則，軟骨表面光滑，與周圍組織整合良好，可見亮綠色膠原纖維，修復(fù)的軟骨與軟骨下骨質(zhì)緊密結(jié)合。    2.6  修復(fù)軟骨甲苯胺藍(lán)染色    干細(xì)胞復(fù)合體實驗組12周時，甲苯胺藍(lán)染色與正常軟骨接近，修復(fù)的組織呈現(xiàn)出均勻的異染性著色，軟骨深層染色濃，細(xì)胞形態(tài)大。單純凝膠復(fù)合體組，基質(zhì)染色淺，細(xì)胞

21、陷凹少。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注射組，細(xì)胞較少，基質(zhì)呈淺藍(lán)色（圖10）?？瞻捉M，細(xì)胞少，基質(zhì)染色顏色淺藍(lán)色。    2.7  修復(fù)軟骨電鏡檢查    干細(xì)胞復(fù)合體實驗組軟骨細(xì)胞具有典型的褶皺狀小突起，細(xì)胞周圍還可見到許多長纖毛，并延伸到細(xì)胞外基質(zhì)中。高倍電鏡顯示干細(xì)胞復(fù)合體實驗組的修復(fù)軟骨細(xì)胞細(xì)胞核增大，核內(nèi)常染色體增多。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊、緊密，膜表面附有大量的核糖體顆粒。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器數(shù)量增加。軟骨細(xì)胞周圍的外基質(zhì)中可見膠原纖維成束狀緊密排列，可見到周期性橫紋（圖11）。單純凝膠復(fù)合體組修復(fù)的軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，但細(xì)胞表

22、面未見纖毛。高倍鏡下軟骨細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量少，排列較稀疏，高爾基體數(shù)量也減少。細(xì)胞核較干細(xì)胞復(fù)合體實驗組明顯小。細(xì)胞周圍膠原纖維排列紊亂，稀疏。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞注射組電鏡下觀察基本類似于空白組。大多為凋亡軟骨細(xì)胞，細(xì)胞水腫脹大，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)見不到細(xì)胞器（圖12）。偶爾可見未壞死的軟骨細(xì)胞，但細(xì)胞形態(tài)小，成梭形。細(xì)胞周圍纖維束排列稀疏。    2.8  修復(fù)軟骨的組織形態(tài)學(xué)評分及統(tǒng)計分析(表2)表2  修復(fù)后軟骨組織形態(tài)學(xué)分值注：*與干細(xì)胞復(fù)合體實驗組比較P0.05，與空白組比較P0.05，與空白組比較P0.05圖7  術(shù)后

23、12周，干細(xì)胞復(fù)合體組缺損修復(fù)組織大體照片  圖8  術(shù)后12周，單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組缺損修復(fù)組織大體照片  圖9  第12周干細(xì)胞復(fù)合體實驗組的修復(fù)軟骨與正常軟骨整合良好，新生軟骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，排列已經(jīng)類似正常軟骨。HE 100×  圖10  第12周單純骨髓基質(zhì)干細(xì)胞組的修復(fù)軟骨細(xì)胞較少，基質(zhì)呈淺藍(lán)色。甲苯胺藍(lán)100×  圖11  干細(xì)胞復(fù)合實驗組12周，軟骨細(xì)胞周圍的外基質(zhì)中可見膠原纖維成束狀緊密排列。12 500×  圖12  空白組12周，大多為凋亡軟

24、骨細(xì)胞，細(xì)胞水腫脹大，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器很少。1 650×    3  討  論    許多證據(jù)表明3，MSCs可以在不同理化環(huán)境的細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，定向的向成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞系方向分化，并最終形成骨或軟骨組織。在細(xì)胞生存微環(huán)境中，生長因子對細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和成熟過程起重要的調(diào)控作用。    bFGF對MSCs的作用還不是很明確，但主要認(rèn)為促增殖作用。另外，bFGF能促進(jìn)軟骨細(xì)胞合成型膠原，對維持軟骨細(xì)胞正常表型的表達(dá)具有重要的作用。IGF1能刺激細(xì)胞分裂增殖，

25、而且增強(qiáng)細(xì)胞蛋白多糖(PG)及型膠原的合成4。TGF是一種多功能性的細(xì)胞因子,可以顯著提高軟骨細(xì)胞表型的表達(dá),促進(jìn)軟骨細(xì)胞型膠原和蛋白多糖的合成與分泌。TGF-誘導(dǎo)MSCs后經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)，可以在體外形成軟骨結(jié)節(jié)，經(jīng)證明具有軟骨的組織結(jié)構(gòu)5。    本實驗中作者發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子單獨應(yīng)用時，bFGF-1的促增殖作用最顯著，倍增時間最短；其次分別是IGF1和TGF，這與以往的實驗研究相符6。然而，當(dāng)聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子時，發(fā)現(xiàn)bFGF1與其它因子組合的增殖作用部分受到抑制，不如單獨應(yīng)用bFGF-1作用顯著。同時作者發(fā)現(xiàn)，IGF1和TGF聯(lián)合應(yīng)用時，細(xì)胞的對數(shù)增殖期最長，誘導(dǎo)細(xì)胞

26、呈持續(xù)的增殖狀態(tài)，這可能是IGF1和TGF聯(lián)合應(yīng)用，使各自的半衰期延長，能夠更持久的調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，使之保持生物學(xué)活性。IGF1和TGF聯(lián)合應(yīng)用時，部分集落的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈大而圓形或多角形，通常認(rèn)為，圓形、多角形的細(xì)胞體外能夠保持合成軟骨特異性型膠原及蛋白多糖的功能。免疫組化染色陽性面積較其它組大；     而對照組與其它實驗組細(xì)胞集落多數(shù)呈長梭形，以往認(rèn)為這是軟骨細(xì)胞去分化的表現(xiàn)（dedifferentiation）。型膠原蛋白是軟骨細(xì)胞所特有的膠原類型，是軟骨細(xì)胞重要的表型蛋白，免疫組化結(jié)果揭示MSCs經(jīng)IGF1和TGF聯(lián)合誘導(dǎo)可以向軟骨細(xì)胞方向增殖分化。實驗研究結(jié)果表明，IGF1和TGF聯(lián)合應(yīng)用是誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化的最佳組合，能促進(jìn)型膠原合成和表達(dá)。在體內(nèi)作者采用TGF及IGF作為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)因子，以纖維蛋白凝膠作為前者的載體。纖維蛋白凝膠可通過釋放轉(zhuǎn)化因子和血小板衍生生長因子等來促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖并分泌基質(zhì)，起到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的支架作用，能很好地包埋骨髓基質(zhì)干細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。此外，IGF在體內(nèi)可以通過與軟骨細(xì)胞膜上的受體結(jié)合以旁分泌和自分泌的方式起作用。因此IGF可以不進(jìn)