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文檔簡介
1、氨基酸的紙層析法一目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法,稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機溶劑組成。展層時,水為靜止相,他與濾紙纖維親和力強;有機溶劑為流動相,它與濾紙纖維親和力弱。有機溶劑在濾紙上又下向上移動的,稱為上行法;有上向下移動的,稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點處展層,由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進行分配,且他們的分離系數(shù)各不相同,所以不同的氨基酸隨流動相移動的速率也不相同,于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來,形成距原點不等的層析點。在一定條件下(室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變),不同的氨基酸有固定的移動速率(R
2、f值)Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時,如果只用一種溶劑展層,由于某些氨基酸的移動速率相同或相近,就不能將它們分開,為此,當用一種溶劑展層后,可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度,以第一次所的層析點為原點,在用另一溶劑展層,從而達到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試驗主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實驗儀器 1、新華濾紙 2、層析缸 3、細線 4、點樣管 5、橡皮筋 6、電吹風 7、噴霧器四、實驗試劑1、混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸)2、展層劑:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸餾水=13:3:3:1(v:v)3、0
3、.5%茚三酮無水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮,貯于棕色瓶中 五、實驗步驟 1、取濾紙剪成2010厘米的濾紙條一張,在一端打孔,系一根細線,在另一端23cm處用鉛筆畫一橫線,中間畫一圓點(原點)。 2、取毛細管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原點處點樣,樣點直徑不宜超過5mm,每點一次用吹風機吹干,點23次為佳。 3、點樣后將濾紙放入層析缸中展層,注意點樣線要高于層析液面,濾紙不要貼在層析缸璧上,當展層至另一端12cm處時,停止展層(大約23小時)。 4、取出濾紙,用鉛筆記下溶劑前沿,然后用熱風吹干(或烘箱60)烘干。 5、均勻噴上茚三酮無水丙酮液,注意使溶液不倒流,不間斷。
4、 6、用吹風機吹干,觀察層析點,確定其幾何中心。 7、量取數(shù)值,計算各自的Rf值,與表中標準氨基酸Rf值比較,確定樣品氨基酸種類。(書上圖譜橫著看)六實驗結(jié)果從左到右依次為H、H1、H2、H3、H4。H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461據(jù)此可知,混合氨基酸是由甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phy)組成。七實驗分析實驗中出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。拖尾現(xiàn)象是指展層,顯色后在層析分配圖上,所看到的某一種氨基酸的分子位移,不是如標準圖譜所示的那樣,完整地顯示在某一
5、位置上,而是形成象笤帚似的那樣,前端粗圓而逐漸細小下來,宛如拖著一個尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現(xiàn),是在實驗中對影響Rf值的主要因素要求,掌握不夠所致。諸如,物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性對Rf值的影響,層析溶劑對Rf值的影響,PH對Rf值的影響(溶劑、濾紙和樣品的PH值),溫度對Rf值的影響,濾紙的質(zhì)地是否均勻,薄厚是否適當,纖維的松緊度是否適中等對Rf值的影響,展層的方式(上行、下行)對Rf值的影響。然而在多次實驗過程中無論怎佯嚴格遵循其影響Rf值的主要因素的要求,都仍不可避免地要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。此時,這就需要從具體操作規(guī)范方面,諸如樣品的處理,點樣、展層、顯色等幾個操作程序去考慮思索,經(jīng)仔細分
6、析,樣品的處理是為除去雜質(zhì)純化樣品,達到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像;展層過程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進行,使樣品達到一個適當?shù)奈灰?,便于在顯色后從圖象上,區(qū)分不同樣品的氨基酸;顯色是在用配制好的,與水不相混合,并揮發(fā)性較快噴霧后迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低,不會影響洋品的斑點擴散,那么問題就集中在點樣這個操作程序上了。點樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液,和為了對照實驗結(jié)果,而分別配制的幾種氨基酸的溶液,用微量點樣管或毛細管,或血球計數(shù)器將5一j5微升的樣品,點在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設(shè)計好的多點位置中去。點樣后要自然風干,或冷風吹干。最好不要用加熱裝置,如吹風機
7、,燈泡之類的熱源將其樣品點加速干燥。因為加熱裝置在學生操作時,一但注意不夠,掌握不好,則溫度升高勢必要使樣品破壞,更會使佯品點干的太燥。正是由于這樣,樣品點太干燥,使其樣品物的分子,牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過程中,樣品點的每個物質(zhì)分子,不能在層析紙上同時起步,而是形成了有先有后,魚貫而上行或下行的狀況,最終使洋品物質(zhì)的分子,不能同時都集中到達一個位置。致使在顯色后,實驗結(jié)果的圖象上,觀察到的不是一個完整的斑點,而是一個拖著尾巴的斑點。這就是上述所說的拖尾現(xiàn)象。 紙上分配層析所出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象,究其原因很簡單,就是在點樣品后,樣品點吹的太干燥所致。樣品點不要吹的太干燥,否則,樣品物質(zhì)
8、的分子,會牢吸在層析紙的纖維上,出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象”。 影響 Rf值的主要因素 1.物質(zhì)結(jié)構(gòu)對于Rf值的影響:“物以類聚”,極性物質(zhì)易溶于極性溶劑(水)中,非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑(有機溶劑)中。所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配較多,因此Rf值低于后者。 2.溶質(zhì)與溶劑間的相互作用對Rf值的影響:這種影響是由溶質(zhì)與溶劑間的相互作用與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。溶質(zhì)與溶劑之間若能形成氫鍵,對分配系數(shù)的影響就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地與溶質(zhì)形成氫鍵。某些溶劑(例如酚,正丁醇等)是質(zhì)子的供給
9、體,而水既是質(zhì)子的供給體又是質(zhì)子的接受體。當溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加能接受質(zhì)子的基團(例如NH )時,因酚與水都能給 NH 基提供質(zhì)子,所以酚和水兩相對接受質(zhì)子的基團的引力,基本上是一致的,因此當溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加氨基時,該物質(zhì)與酚和水的作用對其在酚和水兩相間的分配影響不大,對Rf值影響較小。又例如當有機溶劑是質(zhì)子的接受體(如三甲基吡啶,NH 3 等),而溶質(zhì)也是質(zhì)子的接受體(如-NH 基),這時有機溶劑對-NH 沒有引力,而水卻有引力,于是水的引力就大于有機溶劑,因此溶質(zhì)就被水拉向水相,對Rf值的影響就大。 3.pH對Rf值的影響:這種影響主要是由pH與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響
10、很大,解離度越大,極性越強,極性強的物質(zhì)在兩相溶劑中分配時,偏向于極性強的一相,這樣,改變pH就會同時改變分配系數(shù),從而使Rf也會相應變化。在氨基酸的層析法中,改變?nèi)軇┑膒H,使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動較大,而中性氨基酸的Rf值變動較小。在正丁醇中加甲酸,可使酸性氨基酸的極性降低,從而使Rf值變大,而使堿性氨基酸的Rf變小。反之,如在正丁醇中加氨,可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值變小,而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。 4. 濾紙對Rf值的影響:濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大,所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力的大小而異,
11、質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴展不一致,隨著纖維的紋理流動紊亂,另一方面紙的含水量不均一,也不能得到理想的分離效果。 5.溫度對 Rf值的影響: Rf值的重現(xiàn)性與恒溫情況的好壞有密切關(guān)系。溫度對Rf 值的影響主要是因為溶質(zhì)在固體相與流動相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發(fā)能力也不同,因此有些溶劑系統(tǒng)對溫度的敏感程度強些,有些則差些。敏感程度強的對溫度的要求就嚴格,敏感程度差的對溫度的要求就不太嚴格。溫度改變使溶劑系統(tǒng)中的溶解度改變,所以 Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進行的,室溫可在20至40,溫度改變不超過0.5。 無色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類物質(zhì)用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、pH,時間影響較大。如果要使結(jié)果重復,必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時顯色點上會出現(xiàn)白
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