實驗六氨基酸的紙層析法

1、氨基酸的紙層析法一目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機溶劑組成。展層時，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強；有機溶劑為流動相，它與濾紙纖維親和力弱。有機溶劑在濾紙上又下向上移動的，稱為上行法；有上向下移動的，稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進行分配，且他們的分離系數各不相同，所以不同的氨基酸隨流動相移動的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來，形成距原點不等的層析點。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動速率（R

2、f值）Rf=原點到層析點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動速率相同或相近，就不能將它們分開，為此，當用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉90度，以第一次所的層析點為原點，在用另一溶劑展層，從而達到分離的目的。這種方法稱為雙向層析法。本試驗主要介紹的是單向層析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實驗儀器 1、新華濾紙 2、層析缸 3、細線 4、點樣管 5、橡皮筋 6、電吹風 7、噴霧器四、實驗試劑1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、0

3、.5%茚三酮無水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無水丙酮，貯于棕色瓶中 五、實驗步驟 1、取濾紙剪成2010厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細線，在另一端23cm處用鉛筆畫一橫線，中間畫一圓點（原點）。 2、取毛細管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原點處點樣，樣點直徑不宜超過5mm,每點一次用吹風機吹干，點23次為佳。 3、點樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，當展層至另一端12cm處時，停止展層（大約23小時）。 4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風吹干（或烘箱60）烘干。 5、均勻噴上茚三酮無水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。

4、 6、用吹風機吹干，觀察層析點，確定其幾何中心。 7、量取數值，計算各自的Rf值，與表中標準氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類。（書上圖譜橫著看）六實驗結果從左到右依次為H、H1、H2、H3、H4。H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461據此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）組成。七實驗分析實驗中出現了拖尾的現象。拖尾現象是指展層，顯色后在層析分配圖上，所看到的某一種氨基酸的分子位移，不是如標準圖譜所示的那樣，完整地顯示在某一

5、位置上，而是形成象笤帚似的那樣，前端粗圓而逐漸細小下來，宛如拖著一個尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現，是在實驗中對影響Rf值的主要因素要求，掌握不夠所致。諸如，物質結構與極性對Rf值的影響，層析溶劑對Rf值的影響，PH對Rf值的影響(溶劑、濾紙和樣品的PH值)，溫度對Rf值的影響，濾紙的質地是否均勻，薄厚是否適當，纖維的松緊度是否適中等對Rf值的影響，展層的方式(上行、下行)對Rf值的影響。然而在多次實驗過程中無論怎佯嚴格遵循其影響Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出現拖尾現象。此時，這就需要從具體操作規(guī)范方面，諸如樣品的處理，點樣、展層、顯色等幾個操作程序去考慮思索，經仔細分

6、析，樣品的處理是為除去雜質純化樣品，達到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像；展層過程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進行，使樣品達到一個適當的位移，便于在顯色后從圖象上，區(qū)分不同樣品的氨基酸；顯色是在用配制好的，與水不相混合，并揮發(fā)性較快噴霧后迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低，不會影響洋品的斑點擴散，那么問題就集中在點樣這個操作程序上了。點樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液，和為了對照實驗結果，而分別配制的幾種氨基酸的溶液，用微量點樣管或毛細管，或血球計數器將5一j5微升的樣品，點在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設計好的多點位置中去。點樣后要自然風干，或冷風吹干。最好不要用加熱裝置，如吹風機

7、，燈泡之類的熱源將其樣品點加速干燥。因為加熱裝置在學生操作時，一但注意不夠，掌握不好，則溫度升高勢必要使樣品破壞，更會使佯品點干的太燥。正是由于這樣，樣品點太干燥，使其樣品物的分子，牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過程中，樣品點的每個物質分子，不能在層析紙上同時起步，而是形成了有先有后，魚貫而上行或下行的狀況，最終使洋品物質的分子，不能同時都集中到達一個位置。致使在顯色后，實驗結果的圖象上，觀察到的不是一個完整的斑點，而是一個拖著尾巴的斑點。這就是上述所說的拖尾現象。 紙上分配層析所出現的拖尾現象，究其原因很簡單，就是在點樣品后，樣品點吹的太干燥所致。樣品點不要吹的太干燥，否則，樣品物質

8、的分子，會牢吸在層析紙的纖維上，出現拖尾現象”。 影響 Rf值的主要因素 1.物質結構對于Rf值的影響：“物以類聚”，極性物質易溶于極性溶劑(水)中，非極性物質易溶于非極性溶劑(有機溶劑)中。所以物質的極性大小決定了物質在水和有機溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配較多，因此Rf值低于后者。 2.溶質與溶劑間的相互作用對Rf值的影響：這種影響是由溶質與溶劑間的相互作用與分配系數的關系所決定的。溶質與溶劑之間若能形成氫鍵，對分配系數的影響就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地與溶質形成氫鍵。某些溶劑(例如酚，正丁醇等)是質子的供給

9、體，而水既是質子的供給體又是質子的接受體。當溶質結構中增加能接受質子的基團(例如NH )時，因酚與水都能給 NH 基提供質子，所以酚和水兩相對接受質子的基團的引力，基本上是一致的，因此當溶質結構中增加氨基時，該物質與酚和水的作用對其在酚和水兩相間的分配影響不大，對Rf值影響較小。又例如當有機溶劑是質子的接受體(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶質也是質子的接受體(如-NH 基)，這時有機溶劑對-NH 沒有引力，而水卻有引力，于是水的引力就大于有機溶劑，因此溶質就被水拉向水相，對Rf值的影響就大。 3.pH對Rf值的影響：這種影響主要是由pH與分配系數的關系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響

10、很大，解離度越大，極性越強，極性強的物質在兩相溶劑中分配時，偏向于極性強的一相，這樣，改變pH就會同時改變分配系數，從而使Rf也會相應變化。在氨基酸的層析法中，改變溶劑的pH，使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動較大，而中性氨基酸的Rf值變動較小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的極性降低，從而使Rf值變大，而使堿性氨基酸的Rf變小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值變小，而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。 4. 濾紙對Rf值的影響：濾紙本身的pH及含水量對Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對水的親和力的大小而異，

11、質地不均一的濾紙常使溶劑擴展不一致，隨著纖維的紋理流動紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。 5.溫度對 Rf值的影響： Rf值的重現性與恒溫情況的好壞有密切關系。溫度對Rf 值的影響主要是因為溶質在固體相與流動相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發(fā)能力也不同，因此有些溶劑系統(tǒng)對溫度的敏感程度強些，有些則差些。敏感程度強的對溫度的要求就嚴格，敏感程度差的對溫度的要求就不太嚴格。溫度改變使溶劑系統(tǒng)中的溶解度改變，所以 Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進行的，室溫可在20至40，溫度改變不超過0.5。 無色物質的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類物質用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實驗采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應受溫度、pH，時間影響較大。如果要使結果重復，必須嚴格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時顯色點上會出現白