實(shí)驗(yàn)六氨基酸的紙層析法

1、氨基酸的紙層析法一目的了解并掌握氨基酸紙層析的原理和方法。二、原理以濾紙為支持物的層析法，稱為紙層析法。紙層析所用展層劑大多由水和有機(jī)溶劑組成。展層時(shí)，水為靜止相，他與濾紙纖維親和力強(qiáng)；有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，它與濾紙纖維親和力弱。有機(jī)溶劑在濾紙上又下向上移動(dòng)的，稱為上行法；有上向下移動(dòng)的，稱為下行法。 將樣品在濾紙上確定的原點(diǎn)處展層，由于樣品中各種氨基酸在兩相中不斷進(jìn)行分配，且他們的分離系數(shù)各不相同，所以不同的氨基酸隨流動(dòng)相移動(dòng)的速率也不相同，于是各種氨基酸在濾紙上就相互分離出來(lái)，形成距原點(diǎn)不等的層析點(diǎn)。在一定條件下（室溫、展層劑的組成、濾紙的質(zhì)量、PH值等不變），不同的氨基酸有固定的移動(dòng)速率（R

2、f值）Rf=原點(diǎn)到層析點(diǎn)中心的距離/原點(diǎn)到溶劑前沿的距離。用混合氨基酸做樣品時(shí)，如果只用一種溶劑展層，由于某些氨基酸的移動(dòng)速率相同或相近，就不能將它們分開(kāi)，為此，當(dāng)用一種溶劑展層后，可將濾紙旋轉(zhuǎn)90度，以第一次所的層析點(diǎn)為原點(diǎn)，在用另一溶劑展層，從而達(dá)到分離的目的。這種方法稱為雙向?qū)游龇?。本試?yàn)主要介紹的是單向?qū)游龇?。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸組成。三、實(shí)驗(yàn)儀器 1、新華濾紙 2、層析缸 3、細(xì)線 4、點(diǎn)樣管 5、橡皮筋 6、電吹風(fēng) 7、噴霧器四、實(shí)驗(yàn)試劑1、混合氨基酸（精氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）2、展層劑：正丁醇：12%氨水：95%乙醇：蒸餾水=13：3：3：1（v:v）3、0

3、.5%茚三酮無(wú)水丙酮溶液：0.5g茚三酮溶于100ml無(wú)水丙酮，貯于棕色瓶中 五、實(shí)驗(yàn)步驟 1、取濾紙剪成2010厘米的濾紙條一張，在一端打孔，系一根細(xì)線，在另一端23cm處用鉛筆畫(huà)一橫線，中間畫(huà)一圓點(diǎn)（原點(diǎn)）。 2、取毛細(xì)管一支(回收)，吸取氨基酸混合液，在原點(diǎn)處點(diǎn)樣，樣點(diǎn)直徑不宜超過(guò)5mm,每點(diǎn)一次用吹風(fēng)機(jī)吹干，點(diǎn)23次為佳。 3、點(diǎn)樣后將濾紙放入層析缸中展層，注意點(diǎn)樣線要高于層析液面，濾紙不要貼在層析缸璧上，當(dāng)展層至另一端12cm處時(shí)，停止展層（大約23小時(shí)）。 4、取出濾紙，用鉛筆記下溶劑前沿，然后用熱風(fēng)吹干（或烘箱60）烘干。 5、均勻噴上茚三酮無(wú)水丙酮液，注意使溶液不倒流，不間斷。

4、 6、用吹風(fēng)機(jī)吹干，觀察層析點(diǎn)，確定其幾何中心。 7、量取數(shù)值，計(jì)算各自的Rf值，與表中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸Rf值比較，確定樣品氨基酸種類(lèi)。（書(shū)上圖譜橫著看）六實(shí)驗(yàn)結(jié)果從左到右依次為H、H1、H2、H3、H4。H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm由此可得Rf1=0.08547Rf2=0.37607Rf3=0.42735Rf4=0.08461據(jù)此可知，混合氨基酸是由甘氨酸（Gly）和苯丙氨酸（Phy）組成。七實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了拖尾的現(xiàn)象。拖尾現(xiàn)象是指展層，顯色后在層析分配圖上，所看到的某一種氨基酸的分子位移，不是如標(biāo)準(zhǔn)圖譜所示的那樣，完整地顯示在某一

5、位置上，而是形成象笤帚似的那樣，前端粗圓而逐漸細(xì)小下來(lái)，宛如拖著一個(gè)尾巴。其圖所呈顏色也是由濃漸淡。圖象的出現(xiàn)，是在實(shí)驗(yàn)中對(duì)影響Rf值的主要因素要求，掌握不夠所致。諸如，物質(zhì)結(jié)構(gòu)與極性對(duì)Rf值的影響，層析溶劑對(duì)Rf值的影響，PH對(duì)Rf值的影響(溶劑、濾紙和樣品的PH值)，溫度對(duì)Rf值的影響，濾紙的質(zhì)地是否均勻，薄厚是否適當(dāng)，纖維的松緊度是否適中等對(duì)Rf值的影響，展層的方式(上行、下行)對(duì)Rf值的影響。然而在多次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)論怎佯嚴(yán)格遵循其影響Rf值的主要因素的要求，都仍不可避免地要出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。此時(shí)，這就需要從具體操作規(guī)范方面，諸如樣品的處理，點(diǎn)樣、展層、顯色等幾個(gè)操作程序去考慮思索，經(jīng)仔細(xì)分

6、析，樣品的處理是為除去雜質(zhì)純化樣品，達(dá)到層析分配某氨基酸的情晰顯色圖像；展層過(guò)程是在上述影響Rf值的主要因素要求下進(jìn)行，使樣品達(dá)到一個(gè)適當(dāng)?shù)奈灰?，便于在顯色后從圖象上，區(qū)分不同樣品的氨基酸；顯色是在用配制好的，與水不相混合，并揮發(fā)性較快噴霧后迅速吹干的。更何況顯色劑又是含水量極低，不會(huì)影響洋品的斑點(diǎn)擴(kuò)散，那么問(wèn)題就集中在點(diǎn)樣這個(gè)操作程序上了。點(diǎn)樣是將被層析分配的幾種氨基酸混合液，和為了對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果，而分別配制的幾種氨基酸的溶液，用微量點(diǎn)樣管或毛細(xì)管，或血球計(jì)數(shù)器將5一j5微升的樣品，點(diǎn)在以濾紙為惰性支持物的層析紙上設(shè)計(jì)好的多點(diǎn)位置中去。點(diǎn)樣后要自然風(fēng)干，或冷風(fēng)吹干。最好不要用加熱裝置，如吹風(fēng)機(jī)

7、，燈泡之類(lèi)的熱源將其樣品點(diǎn)加速干燥。因?yàn)榧訜嵫b置在學(xué)生操作時(shí)，一但注意不夠，掌握不好，則溫度升高勢(shì)必要使樣品破壞，更會(huì)使佯品點(diǎn)干的太燥。正是由于這樣，樣品點(diǎn)太干燥，使其樣品物的分子，牢固地吸牢在層析紙的纖維上。所以在展層過(guò)程中，樣品點(diǎn)的每個(gè)物質(zhì)分子，不能在層析紙上同時(shí)起步，而是形成了有先有后，魚(yú)貫而上行或下行的狀況，最終使洋品物質(zhì)的分子，不能同時(shí)都集中到達(dá)一個(gè)位置。致使在顯色后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖象上，觀察到的不是一個(gè)完整的斑點(diǎn)，而是一個(gè)拖著尾巴的斑點(diǎn)。這就是上述所說(shuō)的拖尾現(xiàn)象。 紙上分配層析所出現(xiàn)的拖尾現(xiàn)象，究其原因很簡(jiǎn)單，就是在點(diǎn)樣品后，樣品點(diǎn)吹的太干燥所致。樣品點(diǎn)不要吹的太干燥，否則，樣品物質(zhì)

8、的分子，會(huì)牢吸在層析紙的纖維上，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象”。 影響 Rf值的主要因素 1.物質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)于Rf值的影響：“物以類(lèi)聚”，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑(水)中，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑(有機(jī)溶劑)中。所以物質(zhì)的極性大小決定了物質(zhì)在水和有機(jī)溶劑之間的分配情況。例如酸性和堿性氨基酸極性大于中性氨基酸。所以前者在水(固定相)中分配較多，因此Rf值低于后者。 2.溶質(zhì)與溶劑間的相互作用對(duì)Rf值的影響：這種影響是由溶質(zhì)與溶劑間的相互作用與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。溶質(zhì)與溶劑之間若能形成氫鍵，對(duì)分配系數(shù)的影響就很大。例如酚、三甲基吡啶、氨等和水混合后都能很好地與溶質(zhì)形成氫鍵。某些溶劑(例如酚，正丁醇等)是質(zhì)子的供給

9、體，而水既是質(zhì)子的供給體又是質(zhì)子的接受體。當(dāng)溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加能接受質(zhì)子的基團(tuán)(例如NH )時(shí)，因酚與水都能給 NH 基提供質(zhì)子，所以酚和水兩相對(duì)接受質(zhì)子的基團(tuán)的引力，基本上是一致的，因此當(dāng)溶質(zhì)結(jié)構(gòu)中增加氨基時(shí)，該物質(zhì)與酚和水的作用對(duì)其在酚和水兩相間的分配影響不大，對(duì)Rf值影響較小。又例如當(dāng)有機(jī)溶劑是質(zhì)子的接受體(如三甲基吡啶，NH 3 等)，而溶質(zhì)也是質(zhì)子的接受體(如-NH 基)，這時(shí)有機(jī)溶劑對(duì)-NH 沒(méi)有引力，而水卻有引力，于是水的引力就大于有機(jī)溶劑，因此溶質(zhì)就被水拉向水相，對(duì)Rf值的影響就大。 3.pH對(duì)Rf值的影響：這種影響主要是由pH與分配系數(shù)的關(guān)系所決定的。弱酸與弱堿的解離度受pH影響

10、很大，解離度越大，極性越強(qiáng)，極性強(qiáng)的物質(zhì)在兩相溶劑中分配時(shí)，偏向于極性強(qiáng)的一相，這樣，改變pH就會(huì)同時(shí)改變分配系數(shù)，從而使Rf也會(huì)相應(yīng)變化。在氨基酸的層析法中，改變?nèi)軇┑膒H，使酸性和堿性氨基酸的Rf值變動(dòng)較大，而中性氨基酸的Rf值變動(dòng)較小。在正丁醇中加甲酸，可使酸性氨基酸的極性降低，從而使Rf值變大，而使堿性氨基酸的Rf變小。反之，如在正丁醇中加氨，可使天冬氨酸和谷氨酸的Rf值變小，而使賴氨酸、精氨酸等堿性氨基酸的Rf值變大。 4. 濾紙對(duì)Rf值的影響：濾紙本身的pH及含水量對(duì)Rf值的影響很大，所以不同的濾紙得到不同的Rf值及不同的斑點(diǎn)形狀。紙上含水量的多少隨溶劑與紙對(duì)水的親和力的大小而異，

11、質(zhì)地不均一的濾紙常使溶劑擴(kuò)展不一致，隨著纖維的紋理流動(dòng)紊亂，另一方面紙的含水量不均一，也不能得到理想的分離效果。 5.溫度對(duì) Rf值的影響： Rf值的重現(xiàn)性與恒溫情況的好壞有密切關(guān)系。溫度對(duì)Rf 值的影響主要是因?yàn)槿苜|(zhì)在固體相與流動(dòng)相之間的分配隨溫度的變化而不同。隨各溶劑組分的粘度和表面張力的不同其蒸發(fā)能力也不同，因此有些溶劑系統(tǒng)對(duì)溫度的敏感程度強(qiáng)些，有些則差些。敏感程度強(qiáng)的對(duì)溫度的要求就嚴(yán)格，敏感程度差的對(duì)溫度的要求就不太嚴(yán)格。溫度改變使溶劑系統(tǒng)中的溶解度改變，所以 Rf值也改變。一般層析展層是在恒溫室中進(jìn)行的，室溫可在20至40，溫度改變不超過(guò)0.5。 無(wú)色物質(zhì)的層析圖譜可用光譜法 (如核苷酸類(lèi)物質(zhì)用紫外光照射)或顯色法鑒定。氨基酸紙上層析圖譜常用的顯色劑有茚三酮、吲哚醌。本實(shí)驗(yàn)采用茚三酮為顯色劑。茚三酮顯色反應(yīng)受溫度、pH，時(shí)間影響較大。如果要使結(jié)果重復(fù)，必須嚴(yán)格控制上述條件。樣品中如含有大量鹽酸會(huì)使氨基酸不顯出顏色。樣品中含大量鹽時(shí)顯色點(diǎn)上會(huì)出現(xiàn)白