用正交法測定幾種因素對酶活力的影響實驗報告

1、用正交法測定幾種因素對酶活力的影響一、前言正交實驗法正交實驗法就是利用排列整齊的表-正交表來對試驗進行整體設(shè)計、綜合比較、統(tǒng)計分析，實現(xiàn)通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，以達到最高生產(chǎn)工藝效果。正交表能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，由于正交表具備均衡分散的特點，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的達到實驗的目的。正交實驗設(shè)計包括兩部分內(nèi)容:第一，是怎樣安排實驗;第二，是怎樣分析實驗結(jié)果。酶活力酶活力（enzyme activity）也稱為酶活性，是指酶催化一定化學(xué)反應(yīng)的能力。酶活力的大小可用在一定條件下，酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速度來表示，酶催化反

2、應(yīng)速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。測定酶活力實際就是測定酶促反應(yīng)的速度。酶促反應(yīng)速度可用單位時間內(nèi)、單位體積中底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在一般的酶促反應(yīng)體系中，底物往往是過量的，測定初速度時，底物減少量占總量的極少部分，不易準(zhǔn)確檢測，而產(chǎn)物則是從無到有，只要測定方法靈敏，就可準(zhǔn)確測定。二、實驗?zāi)康?.學(xué)習(xí)并掌握正交法應(yīng)用原理。2.采用正交法測定多種因素對酶活力的影響。三、實驗原理酶促反應(yīng)常常同時受到多種因素(包括激活劑和抑制劑等)的交互影響，可采用正交法進行綜合研究，即通過少量試驗收到更好的效果：多快好省。本實驗以正交法同時測定S、E、溫度和pH值對trypsin活性的影響，以求得

3、酶活最大時相應(yīng)影響因素的最佳值(水平)，并借此初步掌握正交法的使用。四、實驗器材和試劑實驗器材：試管漏斗溫度計吸管恒溫水浴鍋分光光度計實驗試劑：2%血紅蛋白液(Hb)15%三氯醋酸液(TCA)trypsin酶液0.04mol/L巴比妥緩沖液(pH 7, 8, 9)考馬斯亮藍染液 五、實驗操作1.實驗設(shè)計本實驗為四因素三水平(總試驗次數(shù)34=81)，可選用L9正交表（僅需9次試驗)，展開后其特性為均衡搭配（1）每列中水平數(shù)1、2、3出現(xiàn)次數(shù)相同，均為3次；（2）每兩列的橫行數(shù)對(1-1/1-2/3-2/3-3)各出現(xiàn)一次。列號試驗號12341111121222313334212352231623

4、127313283213933212.將各因素及其相應(yīng)水平參數(shù)依次填入得到實驗安排表 試驗號試劑/ml1682493572%血紅蛋白液0.20.50.80.20.50.80.20.50.8緩沖溶液pH72.6pH81.7pH91.7pH82.3pH92.3pH72.0pH92.0pH72.0pH82.037預(yù)溫5min50預(yù)溫5min60預(yù)溫5min酶液0.20.80.50.50.20.80.80.50.237反應(yīng)10min50反應(yīng)10min60反應(yīng)10min（1）各試管編號，分別加入對應(yīng)容量的底物(2% Hb)和相應(yīng)pH值的緩沖液，混勻；（2）同溫處理的3支試管同時預(yù)溫5min；（3）各試管

5、依序分別加入對應(yīng)容量的trypsin酶液(統(tǒng)一加樣時間間隔)，混勻；（4）同溫處理的3支試管置對應(yīng)恒溫水浴中反應(yīng)10min；（5）各試管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混勻以終止反應(yīng)；（6）非酶促對照：另取一試管，先加入2%血紅蛋白液0.5ml及pH8緩沖液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混勻靜置10min后再加入酶液0.5ml；（7）上述各管反應(yīng)液室溫靜置15min后過濾，取濾液待測酶活；（8）酶活測定(考馬斯亮藍法，標(biāo)準(zhǔn)曲線制備略)：取試管若干支編號，分別加入對應(yīng)的樣品濾液1.0ml及考馬斯亮藍液4.0ml，混勻，室溫靜置3min，以非酶促對照管為空白，于波長595nm比色測定

6、。3.數(shù)據(jù)記錄及分析將各管測定所得光密度值對應(yīng)填入表格，分別算出各因素一、二及三水平的試驗結(jié)果總和、和，并分別取其平均值計算相應(yīng)的極差(各列中最大與最小值之差)；比較各因素極差的大小以評估各因素對酶活的影響，并對酶活最高時的各因素水平作一直觀分析。六、實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)處理1.實驗數(shù)據(jù)： pH值溫度pH7pH8pH9測量值平均值測量值平均值測量值平均值370.0030.00230.0680.06670.1850.18400.0020.0660.1850.0020.0660.182500.0590.05600.0960.09670.0790.08100.0580.0970.0820.0510.097

7、0.082600.1400.14170.1630.16100.0650.06600.1410.1590.0640.1440.1610.0692.實驗數(shù)據(jù)處理分析：列號試驗號1S/ml2E/ml3溫度/（）4pH試驗結(jié)果A680nm1234567891 0.21 0.21 0.22 0.52 0.52 0.53 0.83 0.83 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 0.22 0.53 0.81 372 503 602 503 601 373 601 372 501 72 83 93 91 72 82 83 91 70.00230.05600.14170.096

8、70.16100.06670.06600.18400.0810（一水平試驗結(jié)果總和）（二水平試驗結(jié)果總和）（三水平試驗結(jié)果總和）0.20000.92470.33100.16500.40100.28940.25300.23370.36870.24430.18870.4224/3/3/30.06670.30820.11030.05500.13370.09650.08430.07790.12290.08140.06290.1408極差0.24150.07870.04500.0779由上述表格各因素極差大小可看出，底物濃度對于酶活力影響最大，其次是酶濃度，再次是pH，最后是溫度。根據(jù)上表數(shù)據(jù)，以吸光度

9、值（/3、/3、/3）為縱坐標(biāo)，因素的水平數(shù)為橫坐標(biāo)作圖圖一 底物濃度對酶活力的影響從圖一可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著底物濃度的增大，酶活力是逐漸降低的，約在底物濃度為0.5mol/ml時酶活力達到最低。圖二 酶濃度對酶活力的影響從圖二可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著酶濃度升高，酶活力是逐漸降低的，約在酶濃度為0.55mol/ml時酶活力達到最低。圖三 溫度對酶活力的影響從圖三可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，反應(yīng)速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在溫度為50時酶活力達到最高。圖四 pH對酶活力的影響從圖四可看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著pH升高，反應(yīng)速率是逐漸升高的，即酶活力是逐漸升高的，約在pH為8時酶活力達到最高。七、實驗注意事項1.每加入一種試劑都需要充分混勻。2.應(yīng)確保酶促反應(yīng)的溫度及反應(yīng)時間的準(zhǔn)確性。八、思考題1.正交法有何優(yōu)點？答：通過少數(shù)的實驗次數(shù)找到較好的生產(chǎn)條件，能夠在因素變化范圍內(nèi)均衡抽樣，使每次試驗都具有較強的代表性，保證了全面實驗的某些要求，這些試驗往往能夠較好或更好的達到實驗的