UCSC操作步驟

1、啟動(dòng)子區(qū)含有豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcriptionfactorbindingsites,TFBS）,啟動(dòng)子序列基本上是由這些短序列組合而成，主要在TSS上游1kb的范圍內(nèi)。在TSS附近-60bp到+40bp是核心啟動(dòng)子區(qū)，它對(duì)于精確轉(zhuǎn)錄是必須的最小單元。對(duì)于一個(gè)已知基因的啟動(dòng)子可以在NCBI上查到其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并通過網(wǎng)上軟件初步分析該基因啟動(dòng)子的大致序列及一些順式調(diào)控元件（分析時(shí)應(yīng)把包括整個(gè)基因包括在內(nèi)）.常見的在線預(yù)測(cè)工具有：軟件神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)器（NNPP,）,網(wǎng)上還提供了一些常見基因的數(shù)據(jù)庫：真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫第85版（TheEukaryoticPromoterDataba

2、seCurrentRelease85,EPD,）轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫：該數(shù)據(jù)庫主要包括人，小鼠等常見生物的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及該基因啟動(dòng)子的可能情況。通過初步分析后，還應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)的方法加以確認(rèn).包括PCR步查法（對(duì)于一些短的啟動(dòng)子來說）.如果預(yù)測(cè)目的啟動(dòng)子為長(zhǎng)啟動(dòng)子，PCR步查較難時(shí)，也可采用篩選基因組文庫的方法，篩選陽性克隆子并送長(zhǎng)的克隆去測(cè)序。對(duì)一些關(guān)鍵的順式調(diào)空元件可以通過凝膠阻滯試驗(yàn)（蛋白基因作用）來加以確認(rèn)。查詢啟動(dòng)子的更多方法:1. UCSC(1)網(wǎng)址:2. 在Genome里選擇物種，比如human,search里輸入你的基因名3. PTEN,點(diǎn)擊Go(2)出現(xiàn)新的頁面，看至U&quo

3、t;KnownGeneNameSK面的PTEN了4. 吧，點(diǎn)它(3)又回到了和(1)類似的頁面，此時(shí)，點(diǎn)擊sequence(4)出現(xiàn)一個(gè)新的頁面，選中promoter,同時(shí)可以輸入數(shù)值修改具體的序列區(qū)域，比如Promoterincluding2000basesupstreamand100downstream,即表示啟動(dòng)子-2000+100區(qū)域(5)點(diǎn)擊“getsequence出現(xiàn)頁面中最上面的序列“>uc001kfb.1(promoter2000100)PTEN-phosphataseandtensinhomolog就是“你要的人PTEN啟動(dòng)子-2000+100區(qū)域的序列了？8.9. 2

4、、Ensembl(1)網(wǎng)址:10. 在“SearchEnsem嘛題下search后的下拉框中選中物種名homo11. sapiens(人)，for框中輸入基因名PTEN，點(diǎn)擊Go(2)出現(xiàn)的新頁面中比較亂，但不要管它，直接尋找“Ensembl12. proteincodinggene字樣的，對(duì)，也就是第二個(gè)，點(diǎn)擊它(3)新出現(xiàn)的頁面也很亂，不過依然不用管它，看到左側(cè)有點(diǎn)肉色(實(shí)在不知道怎么描述了)的那些選項(xiàng)了嗎，對(duì)，就是“YourEnsembl下面那一堆，在里面找“Genomicsequence點(diǎn)它(4)現(xiàn)在的界面就一目了然了，在"5'Flankingsequence俞人13

5、. 數(shù)值確定啟動(dòng)子長(zhǎng)度(默認(rèn)為600),比如1000,點(diǎn)擊update；(5)出現(xiàn)的序列中，標(biāo)為紅色的就是基因的外顯子，紅色之間黑14. 色的序列就是內(nèi)含子，而第一個(gè)紅色自然就是第一外顯子了，那么從開始的堿基一直到第一個(gè)紅色的堿基間自然就是啟動(dòng)子-1000+1的序列啦這樣，你不僅查到了啟動(dòng)子，連它的外顯子、內(nèi)含子序列也全部搞定了？16.3、SIB-EPD17. (1)網(wǎng)址：18. (2)具體使用方法大同小異，就是輸入物種名、基因名，限定啟動(dòng)子序列區(qū)域不過有了前兩個(gè)，我想已經(jīng)足夠用了，個(gè)人感覺SIB-EPD的庫容量太小，很多基因查不到？總結(jié)一下:-m©m*2，工鼻力f國(guó)門用'e

6、nsembl一般也和NCBI的一致，你的情況可能例外。這就不清楚了。ensembl有七個(gè)外顯子可能有它自己的理由。另外，NCBI的基因中g(shù)ene庫中同時(shí)有ensembl和genbank的鏈接，不如從這個(gè)鏈接看看。此外，還可以看一看這個(gè)基因在物種間的同源性，以及其它物種有幾個(gè)外顯子，做為參考。綜合考慮一下。？Aliokn-trnnCo.2Cl2BwnnnM«YlV*拄*IMiljmldZ*:"»>*：.»:口匕口icil序中/1tnmiiji口出.<WnE(i-noorrniiCVh4cb.mjf'nlamWnilannp$ltnliM

7、a=mPG&ppgtWi'|hpj|ii'Rtl4ttdiequMcm4n4*Lppriii*UiHlLlCcmwwMRnjn/*"'D*A0kflNKMetwhd*hKFe二53/0PubCheniubiFuflliritiRl”UbM9OwneiHkr.f*EL.mmI14qmfMsc.£tqyp>uXI11Hlrc«HnM>tuuwmiMj1-1-#«IH".5W3W.MflCCVM-臥aH7TBf«<KE<jG*SWBl口8G.lieMCdlKVif給你提供幾個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域

8、查找的網(wǎng)站，慢慢摸索會(huì)學(xué)到更多的?果蠅的PROMOTER2.0?通常確定啟動(dòng)子的算法可以分成兩種，一種根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)各種轉(zhuǎn)錄信號(hào)，如TATA盒、CCAAT盒，結(jié)合對(duì)這些保守信號(hào)及信號(hào)間保守的空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如PROMOTER2.0,用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法確定TATA盒、CCAAT盒、加帽位點(diǎn)(capsite)和GC盒(GCbox)的位置和距離，識(shí)別含TATA盒的啟動(dòng)子。？PROMOTERSCAN?根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位在基因組中分布的不平衡性，將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布密度與TATA盒的權(quán)重矩陣(weightmatrix)結(jié)合起來從基因組DNA中識(shí)別出啟動(dòng)子區(qū)3。但上述程序預(yù)測(cè)的假陽性率較高,PR

9、OMOTER210每23kb出現(xiàn)一個(gè)假陽性；PRO2MOTERSCAN平均每19kb出現(xiàn)一個(gè)假陽性。？Promoterinspector?另一種方法根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)序列的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。Promo2terinspector從一組訓(xùn)練序列中提取出啟動(dòng)子區(qū)的環(huán)境特征，并將外顯子、內(nèi)含子和3'端非翻譯區(qū)的特征與啟動(dòng)子區(qū)加以區(qū)分，從而在基因組中確定啟動(dòng)子位置初來乍到，發(fā)個(gè)技術(shù)貼了！1、獲取目的基因的mRNA序列，并且在NCBI的數(shù)據(jù)庫中查獲轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)2、截取轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為中心，上下約各1000bp，若在此范圍內(nèi)出現(xiàn)CDS,可到翻譯起始點(diǎn)終止3、利用在線軟件進(jìn)行分析Promoterinspector?P

10、romoterScan?Promoter2.0?NNPP?EMBOSSCpgplot?CpGislandsPrediction?本人是采取多種軟件結(jié)合的方法，由于proscan和promoter2.0的假陽性率較高，僅作為參考，而promoterinspector的特異性較高，結(jié)果比較可信。同時(shí)，利用CpG島預(yù)測(cè)，作為輔助參考4、最后，可以找到小鼠的同源區(qū)，進(jìn)行同源性比較，啟動(dòng)子區(qū)域一定是高保守區(qū)5、至恥匕，可以初步預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)域的范圍了。請(qǐng)高手多多指教！啟動(dòng)子預(yù)測(cè)：轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)：此處亦有好多，自己挑吧！以下內(nèi)容轉(zhuǎn)自啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫及預(yù)測(cè)工具PROMOTERFINDINGANDA

11、NALYSISPROGRAMSONTHEINTERNET?TRANSPLORER(TRANScriptionexPLORER)?Dnanalyze(TFmapping)?DragonPromoterFinder1.2(TSSfinderandpromoterregionanalysis)?FunSiteP2.1?HCtata(TATAsignalprediction)?McPromoterVer.3?MatInspector(SearchforTFbindingsites)?ModelGeneratorandModelInspector?NNPP2.1(TSSfinder)?PromoterI

12、nspector(Strandnon-specificpromoterregionfinder)?Promoter2.0(TSSfinder)?PromoterScanII(Promoterregionprediction)?RGSiteScan?SignalScan(SearchforEukaryoticTranscriptionalElements)?TESS(SearchforTranscriptionElements)?TFSEARCH(PredictsTFbindingsitesbasedonTRANSFACdata)?TRANSFAC(TFdatabaseandanumberofa

13、ssociatedprograms)?TSSGandTSSW?PROMOTER2.0?通常確定啟動(dòng)子的算法可以分成兩種，一種根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)各種轉(zhuǎn)錄信號(hào)，如TATA盒、CCAAT盒，結(jié)合對(duì)這些保守信號(hào)及信號(hào)間保守的空間排列順序的識(shí)別進(jìn)行預(yù)測(cè)。如PROMOTER2.0,用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法確定TATA盒、CCAAT盒、加帽位點(diǎn)(capsite)和GC盒(GCbox)的位置和距離，識(shí)別含TATA盒的啟動(dòng)子。？PROMOTERSCAN?根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位在基因組中分布的不平衡性，將轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位分布密度與TATA盒的權(quán)重矩陣(weightmatrix)結(jié)合起來從基因組DNA中識(shí)別出啟動(dòng)子區(qū)3。但上述程序預(yù)

14、測(cè)的假陽性率較高,PROMOTER210每23kb出現(xiàn)一個(gè)假陽性；PRO2MOTERSCAN平均每19kb出現(xiàn)一個(gè)假陽性。？PromoterInspector?另一種方法根據(jù)啟動(dòng)子區(qū)序列的特征進(jìn)行預(yù)測(cè)。Promo2terInspector從一組訓(xùn)練序列中提取出啟動(dòng)子區(qū)的環(huán)境特征，并將外顯子、內(nèi)含子和3'端非翻譯區(qū)的特征與啟動(dòng)子區(qū)加以區(qū)分，從而在基因組中確定啟動(dòng)子位置？FirstEF?近來還有一些程序?qū)⑸鲜龇椒ㄅcCpG島(CpGislands)信息相結(jié)合。CpG島是一段200bp或更長(zhǎng)的DNA序列,核昔酸G+C的含量較高，并且CpG雙核昔酸的出現(xiàn)頻率占G+C含量的50%以上。許多脊椎動(dòng)物

15、的啟動(dòng)子區(qū)都與CpG島的位置重合。FirstEF(http:/rulai1cshl1org/tools/FirstEF/)搜索通過5'UTR定位技術(shù)構(gòu)建的第一外顯子數(shù)據(jù)庫，識(shí)別第一剪切點(diǎn)(firstsplicingdonorsite)，結(jié)合CpG島信息，確定啟動(dòng)子區(qū)。這種方法使預(yù)測(cè)的敏感性和特異性都明顯提高。該程序預(yù)測(cè)含CpG島的啟動(dòng)子的敏感性和特異性都高于90%，預(yù)測(cè)不含CpG島的啟動(dòng)子的精確性相對(duì)略低。？TRRD數(shù)據(jù)庫？?收錄了真核基因調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)方式的信息，每個(gè)條目對(duì)應(yīng)一個(gè)基因。？應(yīng)用權(quán)重矩陣數(shù)據(jù)庫搜索轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的程序包括？SIGNALSCAN?Matinspect

16、or?轉(zhuǎn)錄因子搜索程序(transcriptionalfactorsearch,?TF2SEARCH)?等等。盡管基于PWM的搜索比較敏感，但它最大的缺點(diǎn)就是假陽性率過高，在預(yù)測(cè)的結(jié)果中有很多結(jié)合部位并不真正具有生物學(xué)功能。？COMPEL數(shù)據(jù)庫？經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的復(fù)合元件不多,COMPEL數(shù)據(jù)庫中收錄了近200條經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定的復(fù)合元件的信息。如果轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的預(yù)測(cè)結(jié)果中包含復(fù)合元件，顯然比單個(gè)元件更有可能具有生物學(xué)功能。Co-Bind程序通過建立兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位的PWM及其復(fù)合作用的模型，可以預(yù)測(cè)序列中的復(fù)合元件。還有一些程序利用COMPEL數(shù)據(jù)庫中已知的復(fù)合元件去搜索基因組序列。？Conse

17、nsus?AlignACE?等是用來搜索高含量基序(overrepresentedmotiffinding)的一些算法，可以對(duì)一組基因簇中的基因調(diào)控區(qū)進(jìn)行比較，以發(fā)現(xiàn)其中存在的高含量的基序，調(diào)控元件可能就存在于這些基序之中。在UCSC查找可能的啟動(dòng)子1、進(jìn)入網(wǎng)站？?。2、點(diǎn)擊Tables菜單，在position后面的搜索框內(nèi)寫入待查的基因名稱,點(diǎn)擊getoutputo3、出現(xiàn)一系列候選序列。當(dāng)搜索用詞不特異的時(shí)候會(huì)出來太多的結(jié)果,只顯示500條。UCSCGenomeBioinformaticsUCSCGenesCTGl坦Gj"0IC9，l)岫5533305-55M7居ataFllT-

18、厚Gtq&negXprop«p?iideOISBE-jtcriQfrljunenrassociatedpra:4CTG厘in匚OtgfEY113匚二三r£己號(hào)736QI-TW0UiQH6?*3匚tin,galena2picper匚工dwLIMprotin1i-UMprotein1ifLimprat-ein11=LIMprotein1isLIMprotein1工士AJB二工匕工，也"，芻jjypaIJ二亡二三：二二；二$二斗？二，E二二-dbean工口口i口燈招L1HA¥口口馬¥#三1上典壇事也手口二工；11口？建一工1至3W5M+E-4

19、Ctin-bindin獨(dú)工功11之亡q03qn*1）鼻JWh1總之上會(huì)手紀(jì)蘭三紅§-adin"bintling招工IH11uaODHgJj0匚£卜工102二630677£434404-Acvin-bi&dlDqABLIM1（ndQOyl.l）«tchflfis111B>9S9-1C4344O4-目一匕工立金£此中4、點(diǎn)擊自己目的基因的結(jié)果鏈接，會(huì)出現(xiàn)該基因在染色體上的位置（有時(shí)候會(huì)直接跳到選擇genome,protein,mRNA那一頁面，可能是在搜索詞比較特異的情況寫），繼續(xù)getoutput。Home8rowc

20、87;r6hiTabWtGen«ScnerPCR$«cionFAQTablrBemstrL；火隨叫0肛皿torekvtZd】尼madtiMd猛訕atrackinrextibrnufl.IocakulatrinterbcftKCntrackibyi.irwdLFccbc>iinungliiisplbctimmCairotheTab3e.Bro，-sqforadeioiCk»Ndncoobob&distonemlpit呈旨exandtheQpdMtlixT曲必皂sMt空巴回修ananatedjwesaiLaiiMcfthesoftware«:t

21、mavwAftftouwGikji-rwow口的Vy&QLsjtv*Kefor2theSdiKpag*fcftbekslofccntribut&nw»duwtgwtfhd*：jVertebfalp3.0.n.KfHtfrin*1工”。畤:I20M*|Tro叩Gme?andGenfrPredtliofiTracks'!tnck:fieCSwfGenas:|c»rrela1»i."1n|vuipalMem；secnwnce-"#r：。regtons:；r$aHi仍G麗¥(leaxTblanklaJtfepoutpu

22、tiabraw：if>p*reNnitd："phb<oilrgdpcotnprc&Kd5、選擇genome這一項(xiàng)。6、promoter/upstream前面的框中打勾，一般的啟動(dòng)子長(zhǎng)度大約為2kb左右，這個(gè)數(shù)字可以修改。為便于觀察，可繼續(xù)修改下面的幾個(gè)選項(xiàng)。這里選擇CDS大寫。HomeGenomesGenomeBrowserBlatTablesGeneSortRefSeqGenesGenomicSequenceSequenceRetrievalRegionOptions*basesCDSExons守31LTREstonsLIntronsb05C5OneFASTAr

23、ecordpergeneextrabaserecordperregionFSplitVTR.andCDSpartsofanexoatntoseparateFASIArecojSiNotf：Ceandupstreamextendingpasttheedgeofthechromos-omeSequenceFormattingOptions:51月耳Q3iqupper）羽*gvcp出口目inlower二弟已jjC15shuppercase.L7TRcnlowry-TAllUpi山已加由“AHlowercase.Maskrepeats;廣tolowercase?toNgetsequenceIcance

24、l7、點(diǎn)擊getsequence即可得到結(jié)果。UTR和upstream是分開的，CDS是大寫的，可以看到起始碼。copyATG以前的序列進(jìn)行啟動(dòng)子分析。PCR以genome為模板。teniblAboutEntemtF胤七"dLeamlSearch*AMeaB«gypttAropeJnambdeBn-CaunnCwWKaMt：!«i»Qv4FitKKTuid即ExttHi£u*laReffistiX"morelSvAH日knowngnyiHJVBlLH-lkUUB.OnMeMafMLnojjast*Gctvcpiidw50AHc

25、1;nAu&nBC«MMTXUhJBFu*fHtUfl&AjtgArtHomujDtmImiOvm&ew*e*Mi*i<4HartOTtain-enxmnMonoetwdornedxzaKamMcduaICtltuofepulq377,mfaaaeaayuqU731年工中亡qgccgiqayccaBtcag工er二qczijuc。亡tccugaagttgcctcttitogctc?a白口qqcQ'-cg'gcQgcqgccCat4«««ecc量gaqoiQbconeg1egccjiccj>hgIB_re

26、ffteae_!frtflDl1D1_1E*agechri&(SCCB-IMf7M5'j1j*d*5iit.ra&d«-ix.ieRb.*4nq,ao3.夕山直>hg：e_«Ci>e3T.r_li>l_0011C1_：rHflt*chsrT?5535S12-SS5S55Saf-ai3-0，,工事用?庭匚口ueq1s'Esatd"-repeaMasklDa-nesne4MgqII89/彳三8fEKM曹8KT£f98”tecoeefleeeiteeeaee-seegeawfl了廣收：巳t我2E3D11!1L_

27、3ae-CE-t55339-5555B14b二;"GCiCTCGlrCiUU：GGCFCOGGC>rtSrOCAA：Sli3r1mlnnhBU3EE：SE醛UELIBtCTUHeccccrmccccgggcaacckga&iagatsacccaeqe.q>!Tigl2_£rEG*nt_liX_：O：1L1_5th二口心亡&工一：±425+3占-5E3，B?&+*tau*：?i-j*i*3?l;and-iei.e4ra5JtJJ3g*H&seTeAfrrtGiCCTfuicjicEcexjeceATEJkecrT5mtfe

28、wcc7STKTAI：C<T9TA；KCTCTSKS;再匚KM；，力T二耳，LA；二心二CCaGTMCSMOTCXCCCA?ACTGTGCCfJkTCTJLCGXMOSTATMCCTCCCCCATSCATCTGCffTCTMACCTjKTKCGGGMCTtACTGACTfiCZT二二T1KA±1mtZJimiifiQCGCCiGCT二1Rkri匚UCCJUjCACEOCCG在Ensembl查找可能的啟動(dòng)子1、進(jìn)入網(wǎng)站，選擇物種，填入搜索的基因名稱。dQaacrcajgcrtTQ5racecjTflragareecgrrrflercacrtgqcgvr>caqcqccu*中

29、馬。*su*wwe。工uecge444quqq卬gqy3BiWMQ加2孑西大-2M卡”昨壞S2Wg-mccqw«c-t0cccavgt7cctc9g'cacgccccccaPuWth”q二g4sqmjc：gg*，Gq-aqqKQqq*Awq-0*avqg-qwe«ieatmem&l5T二geeetefLetExccietEtLij&oajMonioln-TCnCKKCFCGCCXCASGCACCASqta5hglBr«£&entJM301101=口t！55口占31£-h£*££5，S

30、fp«d-0際厘31gt取在ccTAifirCQA幅gcCZft7gHi13n用Tipc/TCCTTRUCER=czt二lll二tlmrgt二CISGCm1'jidLfirasd-Eepc-tKamka廠q*non陽心.現(xiàn)加幻QDKV«Ensembltor*I.700M.OfhlMVMftpmeBRCA?PopiJiirOtJWTiesLoaIn加cu34MlinefnsM"nt)l50pWftminiorHrlamurileUfYlgHeEnsemMEnte-mblheadlintiiR«1fjse30(July200；Huma/»B

31、CBIM|¥tMousercumiTtaiAllgnoni”0thpr曰bM'。，ij4$*(J4VMaH電*>E»*Rm41Pfu2、出來2個(gè)結(jié)果。本例中貌似是同一個(gè)。點(diǎn)擊相應(yīng)鏈接進(jìn)入新頁面EnsembltextsearchYOufQu過可entriesnWie$3rcriIrt&rProdornamIPR002440Glucos.«trHim口。曲r,&p2(JGLIH31!h5s1asioaaiedexternaldatabaseicenifbersPSoivceSp»a»sHomains;DomainFed

32、tur#typEXminHtunerBnsEnsmtMW仇電mfgixiG:EH5GEnsemwproiemcodingf)eineEhSGOOOOOwinafuaaiotsEnsmoco3H25iENSTQOQOQJSzeoaassENSP0&00O323&a.EMSP0CH)00372258and112eiOnsEHSEOOOOI0761EtJSEOOO0107t201ENSED0DD1O76eMSE0O0OlO762O9,EhSEOMOlOTGII,6SEOOQfl1；D4HQ,EMSE0000120413C.EHSE0D001204132,ErJSEOOCENSEaiK

33、J0l42Q023EhS£0(M015l2644Solulecarrierfamihiladilutedglucosetrartsportermembei2Glucosehar?portertype2liver”GLUTqj.住&U3U樣WWSWlSSPRQT:MePl11悶TtieflfenehaslfielolIoirigexternasidenDfiefsm3pp«<itoit引muMiuomm*Focus.205535_aiAJTymnMius”七HuGeneFLJ03SH)waliMicroaf-HumanEion1.0STv22652162.265

34、2160.26W1ES.26521鴕WTnUMi口口占口點(diǎn),U133216535_5t,O557J05O_34)_alMje#曲口的口和U353823S_al"RjatAQiientProtwA_34_P4M705.乳尸1及5&9CCDSCCDS3.2157CCD33215EM£LAK2S0846BGO«OT41CH4n052.<292741JO3310EMf打GEMSLC2A2S514叵西CEHearthcsreAmershamCad«tirikWGAGE532MGOGORO幀02a0000(96810.GO005則5.8:0005郵8：

35、。網(wǎng)5瀝工GOD005351.GOJ015758.GOOOOaMlCO0005975.G。0005624<5005335,GOOM521GOOQ22891HCMC(autowatJCkSLC2A2-201SLC5A2-202.SLC2A2,GUH7HGNCS?m5or11006SLC2A23、貌似有2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本。點(diǎn)擊ExonInfoSEnsemblGeneReportforENSGOOOOD1&3581Ceas5LC2A2出6C口ugmitK期SjmnfvniLGLUT看*"1<nfcwtj(1«imi.51g當(dāng)fmMib&efoftMHum

36、GB等，畫仁G。:；IriHmtilGentf«36goWis即IDTH片第vwrand?loundonCftrertnosome3dtlDOian1T?.才-i漢227452tuhsuit0fmu帕1才兇Huh白。in©mn41HE足即工汨口S?lu；Ec»DErtarru1r2SanlitatE-15HjegseTransponerrerrDtf21-GlutosatansOftrlefMta2rIrrer-GlUT-2f7i*御自u(píng)noulKld，也*Ens«mtMJt/lomai亡ma啊吸(wo-uung*im«ra/niocitrn&

37、#187;moOlirotnj松RtuE*n3ofaltgntdtollfftMTdtrinWFprttJicbvnCvn中的4n4rgmwJ限jrfb4WFtxmbIfrrtWith暫制：W*kQW瞥5n也315R4，F(xiàn)WEN*:n零“VQX*MMit.G«HOCQtRt?2C04M942-50)_SLC2A22»1EHagKKS31g"ISIC3A5303EWMOG392806TTW3口ISlEOl*l*i'nf!Of3lAptn國(guó)即"叩同m幻kit1ft-21kk>和8K*,l>JIt4、新頁面中即可看到5'upstre

38、amsequence可以在Flankingsequenceateitherendoftranscript后面的框中修改期望顯示的序列長(zhǎng)度。一般啟動(dòng)子最好選2kb。然后copy所顯示的上游序列進(jìn)行分析。r“nwr啾ThHBwiSiCnpt閉.mMftefMF»KjmmCTftSyit卬.3野3«ara<iBf>l如修EirtlEni1|5|：討1麗虹附Ihb/R:營(yíng)&投附TFttf*!岫Xift42AWMUHF*iErs*k“MX.Lk濫19假品SMTtafirwixenpion6#hund：on-OtrarnasocH*Ildlocsbcn!工"

39、;抬.品LMR:”'41Fl.1«imnwn£惘g»m£a：nftMSaJE；'.!ZJ1HDvMJlfrtlftn4Mtecmitamh1tKiwjiMqIlmmliiraM44rrfwrwb*<圭cdumwkwn«oriMtrw£.hwn<flLUl-2i.IliiHlwriinfli14tZMQ1”則SftMfQni<rh隨著基因工程的發(fā)展，常常需要構(gòu)建一種能高水平表達(dá)異源蛋白質(zhì)的表達(dá)載體。啟動(dòng)子對(duì)外源基因的表達(dá)水平影響很大，是基因工程表達(dá)載體的重要元件。因此研究啟動(dòng)子的克隆方法，對(duì)研究基因表達(dá)

40、調(diào)控和構(gòu)建表達(dá)載體至關(guān)重要。？迄今為止，國(guó)外尚未見到有關(guān)啟動(dòng)子克隆方法的綜述性報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅孫曉紅等曾就啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、分類、克隆方法和食用菌中已經(jīng)分離到的啟動(dòng)子作過綜述。而近年來又有許多改進(jìn)的克隆啟動(dòng)子的方法獲得了多方面的成功，本文就近年來改進(jìn)的啟動(dòng)子克隆方法作一綜述，以期促進(jìn)對(duì)啟動(dòng)子分離技術(shù)的應(yīng)用。？1啟動(dòng)子克隆的幾種方法？1.1 利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子？啟動(dòng)子探針型載體是一種有效、經(jīng)濟(jì)、快速分離基因啟動(dòng)子的工具型載體，包含2個(gè)基本部分：轉(zhuǎn)化單元和檢測(cè)單元。其中，轉(zhuǎn)化單元含復(fù)制起點(diǎn)和抗生素抗性基因，用于選擇被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；檢測(cè)單元?jiǎng)t包括1個(gè)已失去轉(zhuǎn)錄功能且易于檢測(cè)的遺傳標(biāo)記基因以及克隆位點(diǎn)

41、。？利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子的過程為，先選用1種適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶消化切割染色體DNA,然后將切割產(chǎn)生的DNA限制片段群體與無啟動(dòng)子的探針質(zhì)粒載體重組，并按照設(shè)計(jì)的要求使克隆的片段恰好插在緊鄰報(bào)告基因的上游位置；隨后再把重組混合物轉(zhuǎn)化給寄主細(xì)胞，構(gòu)建質(zhì)粒載體基因文庫，并檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)活性。？當(dāng)插入段同時(shí)滿足（1）具有基因啟動(dòng)子序列；（2）具有翻譯啟始區(qū)；（3）具有啟始MM子；（4）插入方向正確；（5）插入片段3'端編碼區(qū)序列抗性基因編碼區(qū)讀碼框一致，則有可能形成有功能的抗性融合基因，從而啟動(dòng)抗性基因的表達(dá)。？最早由Rachael等在大腸桿菌中以四環(huán)素抗性基因作為報(bào)告基因構(gòu)建

42、了啟動(dòng)子探針質(zhì)粒pBRH3B,并克隆了一些原核和真核啟動(dòng)子片段。其后Donna等以氯霉素抗性基因作為報(bào)告基因，F(xiàn)odor等以大腸桿菌LacZ為報(bào)告基因，構(gòu)建了酵母啟動(dòng)子探針質(zhì)粒并克隆了一些啟動(dòng)子片段。構(gòu)建啟動(dòng)子探針型載體，較為常見的檢測(cè)標(biāo)記基因有&半乳糖甘酶基因（lacZ）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）、四環(huán)素抗性基因（Tet'）和卡那霉素抗性基因（Kan'）。近年來，人們漸漸較多地使用潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（hph）基因作為檢測(cè)標(biāo)記基因。李維等曾構(gòu)建了含有hph抗性基因的啟動(dòng)子探針型載體pSUPV8,直接在大腸桿菌中分離黃狗原毛平革菌基因的啟動(dòng)子。先用Sau3AI酶切黃

43、狗原毛平革菌基因總DNA,再與用BamHI酶切后的pSUPV8相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用間接篩選法從氨葦青霉素和潮霉素抗性平板上篩選重組子，得到6個(gè)雙抗重組子（pCH1pCH6）,電泳檢測(cè)插入片段分別命名為CHlCH6;再用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將重組子分別轉(zhuǎn)化黃狗原毛平革菌，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行復(fù)篩，僅pCH6的轉(zhuǎn)化平板上有穩(wěn)定生長(zhǎng)的菌落，說明了CH6片段在黃狗原毛平革菌中具有啟動(dòng)基因表達(dá)的功能。該方法不需要知道具體基因的序列，可隨機(jī)篩選啟動(dòng)子，避免了引物設(shè)計(jì)，能獲得大量的啟動(dòng)子片段。？1.2 利用PCR技術(shù)克隆啟動(dòng)子？即根據(jù)發(fā)表的基因序列，設(shè)計(jì)引物，克隆基因的啟動(dòng)子，由于PCR法簡(jiǎn)便快捷，近年來人們較多

44、采用此方法克隆基因啟動(dòng)子。？蘇寧等根據(jù)已報(bào)道的水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子基因序列設(shè)計(jì)5啟動(dòng)子序列的引物，以水稻葉綠體DNA為模板，PCR擴(kuò)增出16SrRNA基因5啟動(dòng)子區(qū)的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位點(diǎn)，構(gòu)建測(cè)序載體質(zhì)粒pZ16S,進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明所克隆的片段長(zhǎng)為144bp,含有SD序列。同源比較結(jié)果表明，所克隆的片段與水稻葉綠體16SrRNA啟動(dòng)子序列具有100%的同源性。？上述的PCR方法簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單，是人們較為廣泛使用的技術(shù)。？1.3 環(huán)狀PCR?環(huán)狀PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)這2種PCR都是

45、根據(jù)一端已知序列設(shè)計(jì)的嵌套式引物進(jìn)行PCR。?I-PCRI-PCR是1988年由Triglia最早提出的一種基于PCR的改進(jìn)的染色體步行方法。I-PCR的實(shí)驗(yàn)程序包括，基因組DNA經(jīng)酶切后用T4DNA連接酶進(jìn)行自連接，產(chǎn)生環(huán)狀DNA片段；以環(huán)化產(chǎn)物為底物，用根據(jù)已知片段設(shè)計(jì)的反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而得到含有未知片段的擴(kuò)增產(chǎn)物(流程如圖1所示)。?韓志勇等以I-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)克隆了轉(zhuǎn)基因水稻的外源基因旁側(cè)序列。先用小量法提取轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA,總DNA用10倍過量的限制內(nèi)切酶進(jìn)行過夜酶切，酶切片段進(jìn)行自連接，然后根據(jù)工程質(zhì)粒的T-DNA區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)反向引物，進(jìn)行套式PCR擴(kuò)增旁側(cè)序列。建立

46、了適合于處理大量材料的克隆轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因旁側(cè)序列的技術(shù)體系。在1周內(nèi)克隆了35個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻株系中外源基因的旁側(cè)序列，長(zhǎng)度在300750bp之間。I-PCR法快速、高效、穩(wěn)定，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，花費(fèi)少，PCR引物設(shè)計(jì)比較方便。？P-PCRP-PCR是由Jones等提出的利用末端反向重復(fù)序列與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成環(huán)狀單鏈模板，有效增強(qiáng)了引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)需要3個(gè)根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)的引物，3個(gè)引物在已知序列內(nèi)呈線性排列，其中第3個(gè)引物可作為接頭使用，可與已知序列互補(bǔ)配對(duì)形成鍋柄狀單鏈模板。其過程為，首先酶切基因組DNA,產(chǎn)生5'或3'粘末端，然后連接上合適的接頭（prime

47、r3）,連接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接頭，由于連接上的接頭與已知序列是反向重復(fù)序列，變性后的DNA單鏈可退火形成鍋柄狀單鏈模板，之后分別用3個(gè)單引物進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，能有效地?cái)U(kuò)增29kbp的大片段未知序列（流程如圖2所示）。?黃君健等成功地應(yīng)用P-PCR技術(shù)從正常的人外周血單核細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增端粒催化亞基hTERT基因5端上游旁側(cè)序列，獲得了hTERT基因翻譯啟始位點(diǎn)上游2090bp的基因組DNA序列。首先用酶切消化基因組DNA,得到帶有GATC的5'突出端的DNA片段。然后利用已知的hTERTcDNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，用常規(guī)的PCR方法擴(kuò)增出1條大約900bp的基因

48、組特異片段，序列分析為hTERT的基因組DNA片段。根據(jù)得到的基因組DNA序列的信息，確定P-PCR的引物退火區(qū)，并合成了5'磷酸化的連接寡核甘酸和4條基因特異性引物，其中連接寡核甘酸5'端的4個(gè)堿基CTAG與上述核酸內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的5突出端GATC互補(bǔ)，然后將連接寡核甘酸與基因組酶切產(chǎn)物連接，以連接產(chǎn)物為反應(yīng)模板，進(jìn)行PCR,使模板自身進(jìn)行退火-延伸反應(yīng)，以形成Panhandle結(jié)構(gòu)。最后以單鏈Panhandle為模板，4條基因特異序列為引物進(jìn)行嵌套式PCR,最終獲得了1條約2kb的含hTERT基因啟動(dòng)子的DNA片段。Jones等利用改進(jìn)的P-PCR,在形成panhandle

49、結(jié)構(gòu)之前3末端連上ddCTP,使引物錯(cuò)配的機(jī)率減少，特異性增加。他們從人類基因組DNA已知位點(diǎn)側(cè)翼擴(kuò)增了49kb的大片段未知序列。P-PCR是目前能夠擴(kuò)增距已知序列最遠(yuǎn)的未知DNA序列的方法，有很高的特異性。？1.4 利用載體或接頭的染色體步行技術(shù)克隆基因啟動(dòng)子？這類方法的第一步都是酶切基因組DNA,連接載體或接頭，既可以用pUCl8等質(zhì)粒載體，也可以使用入DNA等噬菌體載體，只要選用的載體帶有合適的酶切位點(diǎn)；同樣根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，接頭既可以是雙鏈也可以是單鏈，然后根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物或接頭序列進(jìn)行擴(kuò)增。？利用載體的PCRShyamala等利用的單特異性引物PCR(S

50、SP-PCR)對(duì)以小鼠傷寒桿菌組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)操縱子為起點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)步行。以M13mpl8RFDNA為載體。用PstI和Aral酶切基因組DNA,PstI和XmaI酶切載體DNA,然后連接基因組片段和載體片段，用根據(jù)基因組DNA序列設(shè)計(jì)的特異引物和載體的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，由于非特異片段沒有單特異引物結(jié)合的位點(diǎn)，即使有載體連到非特異片段，也無法得到大量擴(kuò)增，而使特異片段得到有效擴(kuò)增。？利用接頭的PCR王新國(guó)等利用銜接頭的方法，設(shè)計(jì)了位于單鏈DNA兩端互補(bǔ)的顛倒末端重復(fù)序列，增加了反應(yīng)的特異性，在胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子的克隆方面取得了新的進(jìn)展。首先將胡蘿卜基因組DNA分別用PvuI、SmaI、Dra

51、I、EcoRV酶切，并設(shè)計(jì)了1個(gè)銜接頭長(zhǎng)鏈序列和1個(gè)銜接頭短鏈序列，并在銜接頭短鏈的3末端帶有1個(gè)氨基的銜接頭，能夠阻止聚合酶催化的銜接頭短鏈的延伸，同時(shí)銜接頭的長(zhǎng)鏈和短鏈之間是反向重復(fù)序列。將酶切片段與此銜接頭連接，取連接產(chǎn)物做模板，以銜接頭引物和基因特異引物做PCR,在首輪PCR中只有限定的遠(yuǎn)端基因特異引物有結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)基因特異引物延伸產(chǎn)生的DNA鏈通過銜接頭時(shí)，才能產(chǎn)生銜接頭引物的結(jié)合位點(diǎn)，PCR才能以銜接頭引物和基因特異引物進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增。而另一方面，如果非特異合成產(chǎn)生了DNA兩端都有雙鏈銜接頭序列的PCR產(chǎn)物時(shí)，這種PCR產(chǎn)物在每次變性后，單鏈DNA末端的銜接頭反向重復(fù)序列將形成鍋柄結(jié)

52、構(gòu)，此結(jié)構(gòu)比引物-模板雜交更穩(wěn)定，能抑制非特異序列的指數(shù)增長(zhǎng)。最后得到主要的PCR產(chǎn)物為3.4kb、1.3kb、0.6kb和0.4kb。將EcoRV-銜接頭體系的PCR產(chǎn)物克隆、測(cè)序、同源性比較，得到1個(gè)新的胡蘿卜II型轉(zhuǎn)化酶基因啟動(dòng)子序列，它含有類似于TATAbox和CAATbox的元件，在啟動(dòng)子的遠(yuǎn)上游區(qū)域含多個(gè)AT富含區(qū)，該啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究植物中的糖代謝具有重要的意義。接頭引物的相對(duì)位置如圖3所示。？這種方法具有便于操作、實(shí)驗(yàn)線路簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，但是特異性較差，產(chǎn)物需進(jìn)一步雜交驗(yàn)證。？1.5 YADE法？Prashar等在擴(kuò)增cDNA3'端時(shí)采用"Y形接頭，以減少接頭引

53、物的單引物擴(kuò)增。其原理是接頭引物處于“Y接頭的2個(gè)分叉單鏈上，序列與接頭一樣，只有與特異引物引導(dǎo)合成了接頭的互補(bǔ)序列后，接頭引物才能退火參與擴(kuò)增，流程如圖4。?方衛(wèi)國(guó)等嘗試將YADE法引入到昆蟲病原真菌的分子生物學(xué)研究，并取得了成功，建立了適合于球狗白俯菌和金龜子綠俯菌YADE體系。在已克隆的類球狗白俗菌類枯草桿菌蛋白酶基因CDEP-1的基礎(chǔ)上，利用YADE法，克隆到該基因的啟動(dòng)子CDEPPo?先酶切球狗白俗菌基因組DNA,然后與“Y形接頭相連，取連接產(chǎn)物做模板，先以基因特異引物1做線性擴(kuò)增，再以線性擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以接頭引物和基因特異引物2做指數(shù)擴(kuò)增，只有當(dāng)線性擴(kuò)增時(shí)合成了含有接頭引物的互補(bǔ)

54、單鏈，接頭引物才能與其發(fā)生退火，參與指數(shù)擴(kuò)增，從而有效防止了接頭引物的單引物擴(kuò)增。最后得PCR產(chǎn)物，進(jìn)行序列分析確定為CDEP-1的上游啟動(dòng)子序列。？在應(yīng)用YADE法時(shí)，內(nèi)切酶的選擇至關(guān)重要。好的內(nèi)切酶產(chǎn)生適合PCR擴(kuò)增的片段，太大太小都不行。為了得到合適的內(nèi)切酶，需要從眾多的內(nèi)切酶中篩選。研究表明，不同的物種有自己合適的內(nèi)切酶。YADE法延伸的起始片段可以是基因組DNA片段，也可以是cDNA片段，在延伸cDNA片段時(shí)，設(shè)計(jì)的引物需要避開內(nèi)含子和外顯子的邊界，在內(nèi)含子的位置未知的情況下，可考慮多合成12條特異引物，以提高擴(kuò)增未知片段的機(jī)率。該方法假陽性低、效率高，理論上能擴(kuò)出所有目的片段。？1

55、.6 TA1L-PCR?很早就有用隨機(jī)引物的PCR,但由于無法有效地控制由隨機(jī)引物引發(fā)的非特異產(chǎn)物的產(chǎn)生，所以一直未能廣泛應(yīng)用。近年來由IJiu等設(shè)計(jì)的TAIL-PCR（Terma1AsymmetricInterlacedPCR）又叫熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR,則解決了這個(gè)問題，后來有研究表明，經(jīng)改良過的TAIL-PCR成功地從突變體中克隆到外源插入基因的旁側(cè)序列，從而為啟動(dòng)子的克隆提供了有效的新方法。？在利用特異引物和隨機(jī)引物進(jìn)行PCR中一般有3種產(chǎn)物生成：（1）由特異性引物和簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；（2）由同一特異性弓l物擴(kuò)增出的產(chǎn)物；（3）由同一簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物。在TAIL-PCR反應(yīng)中，其中

56、后2種目標(biāo)產(chǎn)物可以通過以嵌套的特異性引物進(jìn)行的后續(xù)反應(yīng)來消除。？TAIL-PCR的基本原理是利用目標(biāo)序列旁的已知序列設(shè)計(jì)3個(gè)嵌套的特異性引物（specialprimer,簡(jiǎn)稱sp1,sp2,sp3,為:勺20bp）,用它們分別和1個(gè)具有低Tm值的短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物（Arbitrarydegenerateprime,AD,約14bp）相組合，以基因組DNA為模板.根據(jù)引物的長(zhǎng)短和特異性的差異設(shè)計(jì)不對(duì)稱的溫度循環(huán)，通過分級(jí)反應(yīng)來擴(kuò)增特異引物（流程如圖5所示）。?TAIL-PCR共分3次反應(yīng)。第一次反應(yīng)包括5次高特異性、1次低特異、10次較低特異性反應(yīng)和12個(gè)熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)。5次高特異性反應(yīng)，使s

57、p1與已知的序列退火并延伸，增加了目標(biāo)序列的濃度；1次低特異性的反應(yīng)使簡(jiǎn)并引物結(jié)合到較多的目標(biāo)序列上；10次較低特異性反應(yīng)使2種引物均與模板退火，隨后進(jìn)行12次超級(jí)循環(huán)。經(jīng)上述反應(yīng)得到了不同濃度的3種類型產(chǎn)物：特異性產(chǎn)物y型和非特異性產(chǎn)物（I型和m型）。第二次反應(yīng)則將第一級(jí)反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋1000倍作為模板，通過10次熱不對(duì)稱的超級(jí)循環(huán)，使特異性產(chǎn)物被選擇地?cái)U(kuò)增，而非特異產(chǎn)物含量極低。第三次反應(yīng)又將第二次反應(yīng)的產(chǎn)物稀釋作模板，再設(shè)置普通的PCR反應(yīng)或熱不對(duì)稱超級(jí)循環(huán)，通過上述3次PCR反應(yīng)可獲得與已知序列鄰近的目標(biāo)序列。？Gento等曾用構(gòu)建的含有潮霉素抗性基因（hph）的雙元表達(dá)載體pBIG2

58、RHPH2轉(zhuǎn)化真菌，然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌轉(zhuǎn)化子基因組DNA的T-DNA插入?yún)^(qū)的旁側(cè)序列并取得了成功。根據(jù)T-DNA區(qū)的HPH基因設(shè)計(jì)了擴(kuò)增右邊界的3個(gè)引物HS1HS3,以及擴(kuò)增左邊界的引物HAS2HAS4,另外又根據(jù)不同的轉(zhuǎn)化子分別設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物ADlAD3(引物位置如圖6所示)。?在首輪PCR中，以AD/HS1為引物擴(kuò)增右邊界(以AD/HAS2擴(kuò)增左邊界)，然后取首輪PCR產(chǎn)物為模板，以AD/HS2(AD/HAS3)進(jìn)行二次PCR,再以二次PCR產(chǎn)物為模板，AD/HS3(AD/HAS4)為模板進(jìn)行第三輪PCR,將3輪的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析結(jié)果表明，采用TAIL-PCR的

59、方法成功地從突變體中獲得了帶有T-DNA左右邊界的旁側(cè)序列，從而證明了TAIL-PCR法是有效地?cái)U(kuò)增基因旁側(cè)序列的方法，為啟動(dòng)子的克隆又增添了1種可行的方法。？TAIL-PCR不需要PCR前的任何DNA操作，避免了環(huán)化和連接，速度快，特異性強(qiáng)，效率高，靈敏，在分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。？2討論？以上介紹的幾種方法基本代表了現(xiàn)有的啟動(dòng)子克隆方法，它們分別具有不同的特點(diǎn)和適用范圍。？利用啟動(dòng)子探針載體篩選啟動(dòng)子時(shí)，不需要知道具體的基因序列，避免了引物設(shè)計(jì)，并能獲得大量的啟動(dòng)子片段；其缺點(diǎn)是需要構(gòu)建1個(gè)穿梭質(zhì)粒，建庫、轉(zhuǎn)化、篩選，工作量大，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且克隆、亞克隆的過程繁瑣。因此在基因的遺傳背景不是很清楚時(shí)，往往通過探針載體隨機(jī)篩選啟動(dòng)子。？而PCR法的主要優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便、快捷、操作簡(jiǎn)單；其缺點(diǎn)是只能擴(kuò)增兩端已知序列間的DNA區(qū)，且擴(kuò)增的特異性較低。其適用條件是建立在對(duì)基因序列十分清楚的基礎(chǔ)上，只有知道基因