抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)的檢測(cè)及臨床意義

1、抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體(ANCA)檢測(cè)及臨床意義 間接熒光免疫(IIF)方法（歐盟）一、ANCA概念及分類抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體是一種以中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞胞漿成份為靶抗原的自身抗體，對(duì)系統(tǒng)性血管炎炎癥性腸病等多種疾病的診斷和鑒別診斷具有重要的意義，已成為自身免疫性疾病的一項(xiàng)格外重要的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。目前，已經(jīng)有十余種中性粒細(xì)胞胞漿成分被證明為ANCA的靶抗原，蛋白酶3(PR3)，髓過氧化物酶(MPO)，人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)，乳鐵蛋白(LF)，組織蛋白酶G(Cath G)，殺菌/通透性增加蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2)，溶菌素(LYS)，天青殺素，防備素，烯醇化酶，

2、葡萄糖醛酸酶。依據(jù)乙醇固定的中性粒細(xì)胞基質(zhì)片中，可以區(qū)分兩種不同的熒光模型：一種胞漿型（c-ANCA），是均勻分布在整個(gè)中性粒細(xì)胞胞漿中的顆粒型熒光，細(xì)胞核無熒光。在乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片中，其熒光模型表現(xiàn)相同。其主要的靶抗原是蛋白酶3(PR3)。另一種是核周型（p-ANCA），是圍繞中性粒細(xì)胞細(xì)胞核四周的平滑帶狀熒光。由多種抗原引起，主要靶抗原是髓過氧化物酶(MPO)，人白細(xì)胞彈性蛋白酶(HEL)，乳鐵蛋白(LF)，組織蛋白酶G(Cath G)，殺菌/通透性增加蛋白(BPI)，人溶酶體相關(guān)膜蛋白2 (H-LAMP2)，溶菌素(LYS)等。不同抗體在乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片中，其熒光

3、模型表現(xiàn)有所不同。抗MPO抗體產(chǎn)生的p-ANCA因耐甲醛，其熒光模型與在乙醇固定的中性粒細(xì)胞中消滅的c-ANCA類似故叫甲醛抗性的p-ANCA。而其他非MPO抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞反應(yīng)，無熒光表現(xiàn)，這種類型又稱為甲醛敏感的p-ANCA。故依據(jù)乙醇和甲醛固定的中性粒細(xì)胞片表現(xiàn)，可初步判定ANCA的靶抗原PR3，MPO，非MPO三類。二、ANCA的檢測(cè)間接熒光免疫方法是檢測(cè)ANCA的參考方法或者標(biāo)準(zhǔn)方法，至今也是最常用的經(jīng)典方法。IIF是區(qū)分c-ANCA和p-ANCA的基礎(chǔ)，有較高敏感性，可半定量，但I(xiàn)IF測(cè)定的是總ANCA，不能精確區(qū)分靶抗原，需特異性的檢測(cè)方法作為補(bǔ)充。由于多種免疫性疾病

4、患者存在ANA，用IIF法檢測(cè)ANCA時(shí)，會(huì)產(chǎn)生干擾試驗(yàn)結(jié)果的推斷。為避開干擾現(xiàn)象，接受了四基質(zhì)聯(lián)合的檢測(cè)即：乙醇固定的粒細(xì)胞；甲醛固定的粒細(xì)胞；Hep-2（人喉癌細(xì)胞）細(xì)胞；猴肝細(xì)胞?；|(zhì)片各細(xì)胞分布及意義如表一所述。ANCA熒光模型及表現(xiàn)如表二所述。表一：四聯(lián)基質(zhì)片分布及意義區(qū)分ANA的干擾：Hep-2細(xì)胞有典型熒光表現(xiàn)，Hep-2細(xì)胞甲醛固定粒細(xì)胞1：推斷c-ANCA，2：區(qū)分p-ANCA對(duì)甲醛敏感還是耐受甲醛抗性p-ANCA：抗MPO抗體耐甲醛，其熒光與在乙醇固定的中性粒細(xì)胞中的c-ANCA類似甲醛敏感p-ANCA：其他非MPO抗體不與甲醛固定的中性粒細(xì)胞反應(yīng)，無熒光表現(xiàn)區(qū)分ANA與A

5、NCA：借助猴肝細(xì)胞和其中的肝血竇粒細(xì)胞。ANCA陽性，只有肝血竇粒細(xì)胞消滅熒光，。假如兩者同時(shí)陽性，全部肝細(xì)胞核都有熒光。猴肝細(xì)胞乙醇固定粒細(xì)胞是標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)基質(zhì)。區(qū)分兩種熒光模型：c-ANCA；p-ANCA。表二：ANCA熒光模型及表現(xiàn)熒光模型熒 光 表 現(xiàn)乙醇固定粒細(xì)胞甲醛固定粒細(xì)胞Hep-2細(xì)胞猴肝細(xì)胞ANA陰性c-ANCA陽性胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆粒熒光，胞質(zhì)熒光清楚勾畫出核的輪廓，分頁核之間熒光增加。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆粒熒光，胞質(zhì)熒光清楚勾畫出核的輪廓，分頁核之間熒光增加。陰性肝細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞消滅熒光。p-ANCA陽性甲醛耐受p-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲狀帶熒光。熒光陽性

6、的胞質(zhì)主要集中在分頁核四周，形成環(huán)狀或不規(guī)章的塊狀。胞質(zhì)呈現(xiàn)彌散的細(xì)顆粒熒光，胞質(zhì)熒光清楚勾畫出核的輪廓，分頁核之間熒光增加。陰性肝臟細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞消滅熒光。甲醛敏感p-ANCA呈現(xiàn)核周胞質(zhì)平滑絲狀帶熒光。熒光陽性的胞質(zhì)主要集中在分頁核四周，形成環(huán)狀或不規(guī)章的塊狀。陰性陰性肝臟細(xì)胞本身無熒光。僅肝血竇粒細(xì)胞消滅熒光。ANA陽性ANCA陰性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng)度增加陰性細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光表現(xiàn)，如ANA所述肝細(xì)胞核陽性。肝血竇粒細(xì)胞未見熒光。甲醛耐受p-ANCA陽性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng)度增加熒光表現(xiàn)如c-ANCA陽性，乙醇，甲醛固定粒細(xì)胞所述細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇

7、粒細(xì)胞都有熒光。甲醛敏感p-ANCA陽性細(xì)胞核陽性，熒光強(qiáng)度增加陰性細(xì)胞核呈現(xiàn)熒光表現(xiàn)，如ANA所述。肝細(xì)胞和肝血竇粒細(xì)胞都有熒光。三、留意事項(xiàng)為提高對(duì)疾病診斷的特異性，檢測(cè)時(shí)應(yīng)留意以下問題1、檢測(cè)ANCA，一般建議同時(shí)做IIF初篩和確認(rèn)試驗(yàn)，以提高ANCA的臨床應(yīng)用價(jià)值，不做單獨(dú)初篩或單獨(dú)確認(rèn)試驗(yàn)，以免降低對(duì)疾病診斷的特異性。2、不能僅檢測(cè)抗PR3和MPO兩種特異性抗體，而不檢測(cè)，這樣簡(jiǎn)潔限制ANCA對(duì)疾病診斷的特異性。3、用IIF檢測(cè)時(shí)，僅使用乙醇固定的粒細(xì)胞片，這樣不能嚴(yán)格排解ANA的干擾，簡(jiǎn)潔消滅假陽性。四、臨床意義（一）ANCA與原發(fā)性小血管炎韋格納肉芽腫(WG)，顯微多動(dòng)脈炎(MP

8、A)，壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN)和變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(CSS)等等原發(fā)性系統(tǒng)性小血管炎的發(fā)病與ANCA親密相關(guān)，臨床上已將上述疾病統(tǒng)稱為ANCA相關(guān)小血管炎。ANCA,特異性PR3抗體和抗MPO抗體的檢測(cè)已成為原發(fā)性小血管炎的敏感特異的血清學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。1、抗PR3抗體特異性PR3抗體為WG的標(biāo)志性抗體，抗PR3抗體熒光模型以c-ANCA為主。但以c-ANCA診斷WG特異性為90，而以抗PR3抗體的特異性可超過95?？筆R3抗體在其他的原發(fā)性血管炎中業(yè)可以檢測(cè)出來，但陽性率較低。抗PR3抗體敏感度與疾病的活動(dòng)性及病程有關(guān)，在疾病的早期癥狀不明顯時(shí)，就可消滅陽性。因而抗PR3抗體常作為

9、WG的早期診斷、療效推斷、復(fù)發(fā)估量的指標(biāo)，對(duì)臨床治療有重要的參考價(jià)值。2、抗MPO抗體抗MPO抗體熒光模型以p-ANCA為主，主要與MPA、NCGN、CSS相關(guān)。還可見于其他疾病，如節(jié)結(jié)性多動(dòng)脈炎，抗腎小球基底膜腎病，WG，SLE，RA，藥物誘導(dǎo)的狼瘡，F(xiàn)elty綜合癥等。抗體滴度與疾病活動(dòng)性相關(guān)，可用于早期診斷、療效推斷、復(fù)發(fā)估量的指標(biāo)，對(duì)臨床治療有重要的參考價(jià)值?？筂PO抗體陽性高度提示壞死性血管炎或特發(fā)性NCGN，對(duì)診斷原發(fā)性小血管炎的特異性達(dá)到99。因而每一個(gè)不明緣由的血管炎或腎小球腎炎的患者，都應(yīng)當(dāng)檢測(cè)ANCA。表三：ANCA與原發(fā)性小血管炎相關(guān)疾病熒光模型靶抗原（）韋格納肉芽腫(W

10、G)C ，P（少見）PR3（85），MPO（10）顯微多動(dòng)脈炎(MPA)C ，PPR3（45），MPO（45）壞死性新月體性腎小球腎炎(NCGN)C ，P（少見）PR3（25），MPO（65）變應(yīng)性肉芽腫性血管炎(CSS)C ，P（少見）PR3（10），MPO（60）結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎（PAN）少見PR3（5），MPO（15）抗腎小球基底膜病（抗GBN）PMPO（二）ANCA與藥物誘導(dǎo)性血管炎近年來不斷有藥物治療引起的ANCA陽性的病例報(bào)道，如丙基硫氧嘧啶，肼苯噠嗪，普魯卡因酰胺，青酶胺，美滿霉素，他巴唑/甲巰咪唑等。其中報(bào)道比較多的是長(zhǎng)期使用丙基硫氧嘧啶引起的ANCA，其特點(diǎn)是滴度高，抗體譜廣（

11、抗原主要是MPO，也可同時(shí)伴有或單獨(dú)消滅其他靶抗原，如PR3，LF，Cath G，BPI，LYS等）。藥物誘導(dǎo)性血管炎患者臨床表現(xiàn)與原發(fā)性血管炎類似，停止丙基硫氧嘧啶用藥后，臨床癥狀好轉(zhuǎn)，ANCA可轉(zhuǎn)陰。因此，長(zhǎng)期使用丙基硫氧嘧啶治療過程中，應(yīng)定期檢測(cè)ANCA，及早發(fā)覺藥物誘導(dǎo)性血管炎。（三）ANCA與其他疾病除原發(fā)性血管炎外，其他一些疾病中也可消滅ANCA，主要為p-ANCA，其靶抗原并非PR，MPO，而是LF，Cath G，BPI，LYS等 1、慢性炎癥性腸病(CIBD)CIBD是一種消化系統(tǒng)的自身免疫性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC），克羅恩?。–D）兩種。以往的CIBD診斷依靠X線檢查，內(nèi)窺鏡及組織學(xué)診斷，缺乏有效的試驗(yàn)室指標(biāo)。近年來爭(zhēng)辯發(fā)覺UC病人血清中ANCA陽性率為60-80，而CD患者的陽性率為10-20，多為p-ANCA，相關(guān)靶抗原有BPI等。滴度與疾病的活動(dòng)度和病程無關(guān)。由于p-ANCA在UC陽性率高，CD陽性率低，故可作為兩者的鑒別診斷及UC早期診斷指標(biāo)。2、結(jié)締組織病在結(jié)締組織病中，ANCA陽性主要見于SLE和RA，其他結(jié)締組織病中少見。但文獻(xiàn)報(bào)道在SLE和RA陽性率差異特殊大（16-69），這可能與使用方法，抗原基質(zhì)片及工作人員水平有很大關(guān)系。SLE中ANCA陽性可能與慢性