HCV檢測現(xiàn)狀及新進(jìn)展

1、HCV檢測現(xiàn)狀及新進(jìn)展【摘要】丙肝是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一，主要通過血液傳染。我國平均感染率為3.2%。北方稍高，約為4.6%，南方為2.6%2.9%，感染人數(shù)估計(jì)有3700萬。受感染的母親傳播給嬰兒的發(fā)生率為5%?；技毙愿窝缀蠹s有50%70%的感染者有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的傾向，重者2025年后可轉(zhuǎn)化為肝硬化，肝硬化患者10年內(nèi)有大約30%的為終末期肝病1-2，并且HCV感染與原發(fā)性肝細(xì)胞癌有較密切的關(guān)系。對(duì)于HCV感染者，第3、5、7、10年的肝癌累積發(fā)生率達(dá)11%、18.1%、29%、45.6%3。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的迅猛發(fā)展，HCV檢測技術(shù)也不斷提高但與檢測乙型肝炎病毒（HBV）相比，HCV的

2、檢測還有許多難題有待解決。 【關(guān)鍵詞】HCV抗HCVRNAELISART-PCR HCV檢測目前存在的主要問題有：1.由于HCV抗原結(jié)構(gòu)的特殊性，直接檢測血清中HCV抗原的技術(shù)問題還未徹底解決。2.抗體（抗HCV）出現(xiàn)時(shí)間晚，從HCV感染后到抗體轉(zhuǎn)陽的時(shí)間平均為5070天，有的患者可延長至69個(gè)月，檢測的“窗口期”較長。3.病毒基因型復(fù)雜而且容易變異，使基因水平的檢測質(zhì)量不夠穩(wěn)定。隨著有關(guān)人員近年來的不斷努力和相關(guān)的迅猛發(fā)展，已經(jīng)在HCV檢測技術(shù)方面有了重要進(jìn)展。 1第三代抗HCV試劑的應(yīng)用 檢測丙型肝炎病毒抗體（抗HCV）仍是目前常用手段，這方面的檢測方法主要是第三代酶免疫測定法（EIA）或

3、間接酶免疫法（ELISA），我國大多采用ELISA方法。 ELISA方法中包被抗原的組成和質(zhì)量是關(guān)鍵因素。第三代ELISA試劑比第一、第二代試劑有明顯的改進(jìn)，其包被的抗原為HCV核心抗原NS3、NS4和NS5。由于第一、第二代試劑的重組基因多肽抗原中仍有SOD多肽，所以都存在抗SOD造成的假陽性。而第三代HCV試劑，用北方地區(qū)HCV全基因序列，根據(jù)開發(fā)的預(yù)測蛋白理化性質(zhì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原決定簇的位點(diǎn)的序列軟件，完成了HCV全基因序列的親水性親近性移動(dòng)性分析，已預(yù)測到HCV抗原決定簇的位點(diǎn)。第三代試劑的特異性達(dá)到99%4。抗HCV檢測可成為丙型肝炎病毒早期感染的檢測指標(biāo)5。 HCV感染通常是持續(xù)的

4、終生感染。雖然第三代HCV抗體ELISA試劑增加了HCVNs5區(qū)表達(dá)的蛋白作為抗原，提高了試劑敏感性，HCV感染的“窗口期”通常還需要平均40多天。因此，第三代ELISA試劑仍需要提高和改進(jìn)，例如在篩查試驗(yàn)的特異性方面，仍存在假陽性結(jié)果。對(duì)強(qiáng)陽性或弱陽性樣本的檢測，國產(chǎn)試劑（主要廠家）的s/co值高于進(jìn)口試劑，但是無論對(duì)陽性及陰性樣本檢測，國產(chǎn)試劑的CV值及特異性均明顯低于進(jìn)口試劑，以致出現(xiàn)更多的假陽性結(jié)果。此外，丙肝抗體酶免試劑皆沒有灰區(qū)的設(shè)定，s/co比值較低（但大于）的結(jié)果也報(bào)告陽性，亦是假陽性比較多的原因。6 2丙型肝炎病毒抗原檢測方法的建立 多年來，專業(yè)人員一直探索能夠直接檢測HCV

5、抗原，以達(dá)到縮短窗口期的目的。但是由于HCV抗原的特殊性和相關(guān)抗體制備中存在的困難，使這方面的進(jìn)展受到阻礙。 2.1HCV核心抗原檢測 HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標(biāo)，幾乎與HCVRNA同時(shí)出現(xiàn)，核心抗原和HCVRNA的動(dòng)力學(xué)變化密切相關(guān)。 HCV核心抗原檢測用雙抗體夾心法定性或定量檢測血清樣品中的HCV核心抗原，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后獲得的純抗HCV核心抗原單克隆抗體作為固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗-HCV核心抗原單克隆抗體作為辣根過氧化物酶標(biāo)記物，與血清中的HCV核心抗原反應(yīng)，OPD顯色后進(jìn)行定性或定量測定。該方法不受被檢測樣品中抗

6、-HCV的干擾，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠?？捎糜贖CV早期急性丙型肝炎診斷，抗-HCV陽性感染者的病毒血癥分析以及HCV感染者前后病毒血癥追蹤分析7。 有報(bào)道，HCV-CAg檢測可以較HCV抗體檢出時(shí)間提早2346d8，且EIA法較PCR法簡便、快速，現(xiàn)有能力開展ELISA檢測的實(shí)驗(yàn)室無需增加特殊設(shè)備，均可檢測。其結(jié)果與RT-PCR方法的復(fù)合率為85.71%。因此，在不具備RNA檢測條件的實(shí)驗(yàn)室開展HCV-CAg檢測時(shí)很好的篩查方法。有報(bào)道，在對(duì)180例抗-HCV陰性患者的篩查中，檢出HCVCAg陽性2例，表明僅用抗HCV檢測將有可能存在0.55%感染者漏診的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)手術(shù)前丙肝病毒篩查的病例，它

7、涉及到術(shù)中感染責(zé)任和用血安全等問題。丙肝核心抗原檢測在一定程度上降低了這些風(fēng)險(xiǎn)。因此,丙肝核心抗原檢測可作為HCV抗體檢測的補(bǔ)充試劑。 1 2.2HCV抗原檢測 十幾年來，一些學(xué)者曾經(jīng)試圖建立血清中各種HCV抗原的檢測方法，但由于血液中HCV抗原含量太低，用常規(guī)方法無法檢測出。近年來，由于HCV單克隆抗體的研究成功，已有國內(nèi)外學(xué)者發(fā)表了肝組織及人體分泌物中HCV抗原檢測成功的報(bào)導(dǎo)。如果能加強(qiáng)對(duì)HCV中和抗體Wv、抗-HCV-IgM、抗-HCV核心抗體的研究9，進(jìn)一步開發(fā)對(duì)血清及肝組織內(nèi)HCV抗原的測定，可能會(huì)在丙肝的實(shí)驗(yàn)診斷方面取得更大進(jìn)展。 3丙型肝炎病毒RNA的檢測 現(xiàn)在用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反

8、應(yīng)（RT-PCR）檢測血清中的HCVRNA?；驹硎鞘紫冉?jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用，在特異性引物存在下，將HCVRNA逆轉(zhuǎn)錄為單鏈的CDNA，再通過PCR將CDNA擴(kuò)增。定性PCR的靈敏度高于定量PCR。羅氏公司的定性PCR的靈敏度為50KIU/L，定量PCR為600KIU/L；拜爾公司的定性PCR的靈敏度為10KIU/L，其定量PCR為615KIU/L。定性PCR檢測主要用于急性丙型肝炎診斷，而定量PCR則用于療效監(jiān)測。 最新報(bào)導(dǎo)，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)(TMA)可以將HCVRNA的檢出率提高到510Iu/ml的水平。其原理為：目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以引物為引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性

9、將雜合鏈上的RNA降解以后，合成雙鏈的DNA，并在T7RNA多聚酶的作用下，轉(zhuǎn)錄出成千上萬個(gè)目標(biāo)RNA序列，這些RNA又可以作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)，整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自我催化過程，靈敏度高，反應(yīng)條件簡單，擴(kuò)增效率高，無需專門的擴(kuò)增儀器，整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行，減少污染。 參考文獻(xiàn) 1straderDB,wrightT,ThomasDL,Hepatology,2004,39:1147-1171. 2周永興.世界華人消化雜志,2004,12:2369-2371. 3謝立,吳曉東.世界華人消化雜志,2005,13:884-886. 4邢文革,鄭懷競.中華肝臟病毒雜志，2004，12：170-171. 5LunelF、VillonP、PayanC，Hepatology，2002，36（pt2）：353. 6王國華、張賀秋、李少波等.丙型肝炎核心抗原檢測試劑的研究及初步應(yīng)用J|輸血雜志，2004，17（5）：11-14. 7孟淑芳,李秀華,尹紅章等.丙型肝炎