DCSIGN特異性適配子的篩選及鑒定

1、DCSIGN特異性適配子的篩選及鑒定                           作者：陳芳, 曾潔, 孫平, 潘勤, 章曉聯(lián)【摘要】  目的: 篩選高特異性、 高親合力結合DCSIGN的單鏈DNA適配子, 為開發(fā)抗HIV、 HCV和結核桿菌感染的新型預防和試劑奠定基礎。 方法: 采用基于細胞表面展示的SELE

2、X技術（TECSSELEX）, 篩選出具有高親合力結合DCSIGN的單鏈DNA（ssDNA）適配子; 運用流式細胞術（FCM）檢測該適配子的親合力; 對最高親合力適配子庫進行克隆和測序; ELISA和FCM方法檢測單適配子ZD8與DCSIGN蛋白結合的劑量相關性; MTT法測定IC50觀察適配子對細胞的毒性。 結果: 第14輪篩選的適配子庫親和力最高; DCSIGN抗體能抑制適配子結合表達DCSIGN蛋白的細胞; 第14輪庫中篩選的單適配子ZD8 與DCSIGN蛋白的結合率呈劑量依賴性; 所篩選的單適配子對肝細胞幾乎無毒性。結論: 成功篩選出DCSIGN蛋白的ssDNA適配子, 為防治HIV、

3、 HCV和結核桿菌感染等DCSIGN相關性疾病, 提供新型預防和治療的候選試劑和小分子藥物。AIM: To develop the high affinity DNA aptamers which can selectively recognize DCSIGN protein as putative preventive reagents and drugs against infectious diseases. METHODS: A technique of cell surfaceSELEX (TECSSELEX) was employed to screen the DNA apta

4、mers recognizing DCSIGN displayed on the surface of NIH3T3 cells. Some aptamers from the aptamer pools with the highest affinity were cloned. The binding affinities between the aptamers and target cells were measured by flow cytometry and ELISA. The values of IC50 were determined to detect the toxic

5、ity of aptamers for cells by MTT method. RESULTS: The 14th aptamer pool had the highest affinity and the binding rates between single aptamer (ZD8) and DCSIGN protein were in a dose dependent manner. DCSIGN antibody can competitively inhibit the binding reactions between the aptamers and their targe

6、t cells. The selected aptamers have very low or no toxicity for hepatic cells. CONCLUSION: The selected DNA aptamers bound to DCSIGN protein with high affinity and specificity have been successfully selected, and they can be used both as preventive reagents and drugs against infectious diseases, suc

7、h as AIDS, hepatitis C and tuberculosis. 【關鍵詞】  DCSIGN; 適配子; TECSSELEXDCSIGN 可通過其對靶細胞的捕捉, 將病原體直接帶到靶細胞附近, 增加感染機會, 使DC成為病原體的傳播者。近來的研究證明, DCSIGN為廣譜的病原受體, 除了可與HIV1、 HCV結合外, 還可與其他多種病原體結合1。因而, 通過阻斷DCSIGN從而阻斷HIV、 HCV、 結核桿菌等病原體感染途徑有望成為預防和治療病毒性疾病的有效策略。     SELEX技術是在體外運用大容量的隨機寡核苷酸文庫與P

8、CR擴增技術相結合, 以指數(shù)富集與靶分子特異結合的寡核苷酸, 經過多輪篩選, 獲得高親合力、 特異性強的寡核苷酸適配子（aptamers）2, 3。TECSSELEX技術是將細胞作為篩選介質的SELEX篩選方法, 篩選中表面表達靶分子的細胞作為陽性正篩細胞, 沒有表達靶分子的同系細胞作為陰性反篩細胞4。我們將表達DCSIGN蛋白的NIH3T3DCSIGN細胞作為陽性正篩細胞, 運用SELEX技術對DCSIGN靶蛋白進行正向篩選, 并用不表達DCSIGN蛋白的NIH3T3細胞進行反向篩選, 最終獲得能結合DCSIGN靶蛋白, 同時可拮抗HIV、 HCV病毒顆粒結合DCSIGN蛋白的生物活性小分子

9、核苷酸適配子, 以期開發(fā)預防和治療感染性疾病的新型試劑。1  材料和方法1.1  材料  細胞、 細菌和質粒 NIH3T3細胞（不表達DCSIGN蛋白的陰性反篩細胞）, NIH3T3DCSIGN細胞(表達DCSIGN蛋白的陽性正篩細胞, 本實驗室轉染并鑒定)。大腸桿菌DH5, pUC19質粒為本實驗室保存; DMEM培養(yǎng)基以及RPMI培養(yǎng)基購自Gibco公司; DNA Taq polymerase和dNTP購自TaKaRa公司; DNA純化試劑盒購于OMEGE公司、 T4  DNA連接酶和DNA marker為MBI公司產品; DCSIGN兔抗人多克隆I

10、gG 購自Santa Cruz Biotechnology公司; HRP標記的羊抗兔IgG購自飛羿科技公司; FITC標記的引物和PE標記的羊抗兔IgG抗體購自Ebioscience 公司; HRPstreptavidin 購自ptglab公司; Gene Amp PCR System 2400 PCR儀(Foster city CA94404, USA),  DMLA (CW4000, Leica Germany), U3400（Hitachi）分光光度計, 流式細胞儀（Beckman  EPCS ALTRA , USA）。1.2  方法1  

11、0;      2  結果2.1  GSTDCSIGN蛋白的提取和純化  將DCSIGNGST蛋白提取純化后, 經SDSPAGE不連續(xù)膠電泳和Western blot, 均在預期Mr (73×106) 附近出現(xiàn)1條誘導表達的蛋白質條帶(圖1)。圖1  DCSIGNGST蛋白的SDSPAGE和Western blot鑒定（略）Fig 1  Analysis of DCSIGNGST fusion by SDSPAGE and Western blotA: SDSPAGE;

12、60; M:  Protein marker;  1:  DCSIGNGST protein;  2: GST protein. B: Western blot;  1:  DCSIGNGST protein;   2: DCSIGN protein.2.2  DNA文庫及篩選產物的PCR擴增  化學合成的起始ssDNA 隨機文庫, 經不對稱PCR擴增后, 將擴增的ssDNA 隨機文庫加入到表達DCSIGN的NIH3T3DCSIGN細胞進行正向篩選, 以獲得特異性與DCSIGN結合的ssDNA適

13、配子, 同時用不表達DCSIGN的NIH3T3細胞進行反向篩選, 用來剔除篩選的ssDNA適配子中可與細胞表面其他成分結合的ssDNA。每一輪篩選中獲得的特異性結合DCSIGN的ssDNA適配子通過PCR得到富集, 富集后的ssDNA適配子庫做為下一輪篩選的模板進入后續(xù)的篩選中。因而在后續(xù)的篩選中, 不斷有親合力相對低的ssDNA適配子被淘汰掉, 經過14輪篩選后, 最終獲得高親合力、 高特異性結合DCSIGN的ssDNA適配子。結果顯示ssDNA庫片段大小在DNA marker分子100 bp附近, 與預期片段大小（97 bp）相符(圖2)。圖2  不對稱PCR擴增的ssDNA庫1

14、 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定（略）Fig 2  Analysis of ssDNA aptamers by 1 g/L agarose gel electrophoresis1: Aptamer library pool;  2-10: 1st, 4th, 7th, 9th, 10th, 11th, 12th, 13th, 14th DCSIGN aptamer pool; M: DNA marker.2.3  ssDNA適配子庫親合力檢測  經14輪篩選之后, 運用FCM檢測各輪篩選的ssDNA適配子庫與表達DCSIGN分子的NIH3T3DCSIGN細胞

15、的結合能力（圖2）。第0、 1、 4輪ssDNA適配子庫結合NIH3T3DCSIGN細胞的能力逐漸增強, 不過由于從第4輪開始, SELEX篩選中引入了陰性反向篩選的過程, 剔除掉了一部分ssDNA, 使得第7輪ssDNA適配子庫的結合能力低于第4輪; 從第7輪開始,  10、 12、 14輪ssDNA適配子庫與NIH3T3DCSIGN細胞結合能力逐步增強, 其中第14輪ssDNA適配子庫結合NIH3T3DCSIGN細胞的結合能力最強, 其結合率達到了26.1（圖3）。第7、 10、 12、 14輪ssDNA適配子庫與NIH3T3DCSIGN細胞的解離常數(shù)（Kd值）測定也表明第14輪

16、ssDNA適配子庫與NIH3T3DCSIGN細胞的親合力（Kd值為15.16 nmol/L）高于其他的ssDNA適配子庫（圖4）。2.4  DCSIGN抗體拮抗ssDNA適配子庫結合DCSIGN的檢測  結果顯示隨著篩選過程的進行, DCSIGN抗體抑制適配子庫與NIH3T3DCSIGN細胞結合越來越明顯, 其中抗體對第14輪ssDNA適配子庫的抑制效應最為明顯（圖5）。說明隨著篩選輪數(shù)的增加, 各適配子庫對DCSIGN的親合力以及特異性越來越強, 運用SELEX篩選方法篩選DCSIGN的ssDNA適配子是有效的。2.5  測序及親合力檢測  將第14輪

17、篩選所得ssDNA庫擴增成雙鏈DNA庫（dsDNA庫）, 克隆到PUC19質粒載體中, 然后轉入DH5中, 隨機挑取30個克隆進行測序。結果發(fā)現(xiàn)有2個重復克隆序列（命名為ZD8）。應用生物素標記的引物P2將ZD8進行不對稱PCR 擴增, 擴增產物變性后通過ELISA方法檢測不同劑量的GSTDCSIGN（110 g/L）與8 g生物素標記的ZD8（BioZD8）的結合情況（圖6）, 觀察ZD8與DCSIGN 蛋白的結合的劑量依賴關系。結果顯示, BioZD8結合GSTDCSIGN與對照組比較（BioZD8結合GST蛋白）存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）。FCM分析熒光素FITC標記的ZD8與

18、DCSIGNNIH3T3細胞的結合也呈劑量依賴關系（圖7）。MTT實驗結果顯示所篩選的單適配子對肝細胞幾乎無毒性（data not shown）。這些數(shù)據(jù)表明篩選出的ZD8與DCSIGN的結合具有高親合力和特異性,  可作為進一步用于抑制HIV等感染細胞的候選藥物。圖3  DCSIGN 適配子庫與NIH3T3細胞的結合力（FCM）（略）Fig 3  Binding assay between aptamer pools and NIH3T3DCSIGN cells by FCM圖4  適配子庫的解離常數(shù)（Kd）（略）Fig  4  D

19、issociation constant of aptamer pools（Kd）圖5  DCSIGN 抗體抑制適配子庫與NIH3T3DCSIGN細胞的結合（略）Fig  5  Inhibitory effects of the binding rates between aptamers and DCSIGNexpressing cells by antiDCSIGNaP<0.05 vs  antibody group.圖6  ELISA分析單適配子ZD8與DCSIGN蛋白的結合（略）Fig 6  Binding rates between the ZD8 and DCSIGN protein by ELISAaP<0.05  vs GST+BioZD8.