酵母細胞酒精發(fā)酵固定化載體的改進_圖文

1、食品工業(yè)科技S cience and Technology of Food Industry研究與探討134 2008年第 02期酵母細胞酒精發(fā)酵固定化載體的改進宋慧一 , 趙昊璐 , 任蜀豫 , 孫軍德 3(沈陽農業(yè)大學 , 遼寧沈陽 110161摘 要 :針對海藻酸鈉載體強度低 、 易分解的缺點 , 采用添加法和置換法對載體進行改性研究 , 并確定了最佳固定化 條件 。 考察了添加物質的添加量 、 置換物質的濃度、 鈣化時間及置換時間對固定化細胞強度的影響 。制備得到的固定 化細胞采用 1%濃度的 A l (NO 3 3置換 , 置換時間 18h 時固定化細胞強度最大。 該固定化細胞可進行

2、 42d 共 14批次的 酒精發(fā)酵 。關鍵詞 :酒精發(fā)酵 , 固定化細胞載體 , 固定化條件 , 改進Modified technique of i m mobilized carrier on the yeast alcohol fer mentati onS O NG Hu i -y i , ZHAO Hao -lu, REN Shu -yu, SUN Jun -de 3(Shenyang Agricultural University, Shenyang China Ab s trac t:T w o d iffe re n t m e thod s, a d d iti on a nd

3、 d i sp la c em e n t w a d s o a s i m s ng th of c a l c i um -a l g ina te b e a d s, a nd the b e s t i m m ob ilize d c s d 1c p rop o rti ons of m od ifie rs, c onc e n tra tion of d i sp la c i ng s ub s ta e, i fic a ti a l c ti m e on the i m m ob ili ze d c e ll w e re i nsp e c te d 1The

4、s tre ng th of m d s re a xi m a l va lue a fte r the i m m ob ilize d c e ll s w a s d i sp la c e d b y m a s s fra 3 3a lc ifie d fo r 18h 1The i m m ob ilize d c e lls c ou l d b e us e d fo r the a l c oho l fe r m e n ta tion d, a he s on a ve ra g e 1Key wo rd s:a lc l r m e n ta tion; i m m

5、ob ilize d c e ll c a rrie r ; i m m ob ilize d c ond iti on; i m p rove中圖分類號 :TS26111+1 文獻標識碼 :A 文 章 編 號 :1002-0306(2008 02-0134-03收稿日期 :2007-08-06 3通訊聯系人作者簡介 :宋慧一 (1983- , 女 , 碩士研究生 , 從事微生物發(fā)酵研究。 乙醇 (酒精 是用途最廣和用量最大的有機溶劑 之一 , 發(fā)酵法生產乙醇由于原料來源廣泛 , 公認為可長期持續(xù)供應的可再生能源 1。 近年來 , 由于固定化 細胞技術的興起 , 使高細胞密度的高速率發(fā)酵成為

6、可能 。 國內外學者將該項技術用于酒精發(fā)酵已作了大量研究 , 并取得了不少有益成果 2, 有效地解決了 傳統的酒精發(fā)酵生產中存在的發(fā)酵周期長 , 發(fā)酵液 中酵母細胞密度低 , 發(fā)酵液中乙醇對酵母細胞的反 饋抑制等缺點 。做為固定化載體之一的海藻酸鈉 , 因具有制備方法簡單 、 條件溫和 、 無毒 、 不被絕大多 數微生物分解 、 成本低廉等優(yōu)點成為了較為廣泛使 用的載體材料 。 但海藻酸鈣凝膠在含多價陰離子的 溶液以及高濃度電解質溶液中不穩(wěn)定 , 鈣離子易脫 落 , 凝膠變軟 , 甚至溶解 , 又限制了它的應用 。本文 采用 2種不同的方法對海藻酸鈣凝膠進行改進 , 最 后選擇鋁離子對鈣離子置

7、換法 , 將酵母細胞固定 , 經 培養(yǎng)和連續(xù)發(fā)酵實驗 , 海藻酸鋁固定化酵母細胞使 用壽命明顯延長 。1 材料與方法111 實驗材料高活性鮮酵母 安琪牌 ; 酵母細胞培養(yǎng)基 葡 萄糖 2%, 蛋白胨 015%, 酵母膏 013%, pH510; 高密度增殖細胞培養(yǎng)基 葡萄糖 2%, 蛋白胨 015%, 酵母膏 013%, NH 4C l 0113%,M gS O 40101%, CaCl 201006%, pH 自然 ; 固 定 化 增 殖 培 養(yǎng) 基 葡 萄 糖 3%, 蛋 白 胨013%, 酵母膏 0125%, K H 2P O 40125%, M gS O 40101%, CaCl 20

8、1006%, pH510; 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 20%, 酵 母 膏 015%, 蛋 白 胨 015%, NH 4Cl 0115%, K H 2P O 40115%,M gS O 401065%, CaC l 20128%, pH 自然 , 115 滅菌 15m in 。112 固定化細胞的制備3將試管斜面菌種接入液體酵母細胞培養(yǎng)基中 , 在 28 、 100r/min 條件下活化 1d, 再接入高密度增殖細 胞培養(yǎng)基 , 在 30 、 120r/min 條件下增殖培養(yǎng) 18h 。 按 1 3的比例取菌液與海藻酸鈉溶液混合 , 用注射器(10# 逐滴注入 CaCl 2水溶液中 , 固化 46h

9、, 用無菌水 將固化后的細胞 (直徑 23mm 洗 3次 , 4 備用 。113 酵母細胞固定化條件優(yōu)化在制備固定化細胞時發(fā)現 :海藻酸鈉濃度 、 CaC l 2溶液濃度 、 鈣化時間和鈣化溫度對凝膠球的強度有 顯著影響 。 所以實驗主要考察這 4個因素 , 每個因素取三個水平 , 選擇 L 9(34四因素三水平進行正交實驗5, 以緩沖溶液中溶解時間為實驗指標 。114 固定化細胞強度的改進對于添加的物質 , 以 1%(m /V 的比例將添加劑與菌液和海藻酸鈉溶液混合均勻 ; 對于置換的物質 , 要將所得的固定化細胞再置于 1%的置換溶液中置 研究與探討食品工業(yè)科技V ol . 29, N o

10、 . 02, 2008 2008年第 02期 135 表 1 正交實驗結果分析表實驗號A 海藻酸鈉濃度 (% B CaCl 溶液濃度 (%(115 固定化細胞強度的測定4以緩沖溶液中固定化細胞溶解時間測定強度 :250mL 錐形瓶中裝 50mL 、 pH710的磷酸緩沖液 , 1g 固定化細胞 , 30 、 150r/min 部溶解時間 。2 211 見表 1, 由表 1可知 :各因素最優(yōu)水平分別是 A 3、 B 1、 C 2、 D 2, 即 :海藻酸鈉濃度是 4%, CaCl 2溶液濃度 115%, 鈣化時間 3h, 鈣化溫度 25 ; 由極差大小可 知 , 影響固定化細胞強度的各因素作用大

11、小順序是 :海藻酸鈉濃度 >鈣化溫度 >鈣化時間 >CaC l 2溶液 濃度 。 從表中還可以看出 , 3%和 4%濃度的海藻酸 鈉對固定化細胞強度影響不大 ?？紤]到成本因素 , 且海藻酸鈉濃度越大 , 制備越困難 , 所以選用 3%海 藻酸鈉濃度 , 115%CaC l 2溶液濃度 , 在 25 條件下固 化 3h 來制備固定化細胞 。212 添加不同物質對固定化細胞強度的影響在海藻酸鈉溶液中添加一定比例的 A l 2O 3、 M g O 、 CaCO 3和 Si O 2, 比較這 4種物質在緩沖液中的溶解時 間 。 圖 1表明 , 4種物質中 M g O 的效果要好于其它

12、 物質 , 這是由于 M g O 是堿性化合物和高熔點的離子 晶體 , 在中性溶液中較穩(wěn)定 , 添加到固定化細胞中 , 可以明顯增加固定化細胞強度。圖 1 添加不同物質對固定化細胞強度的影響213 M gO 劑量對固定化細胞強度的影響從圖 2中可以看出 , 隨著 M g O 質量分數的增加 , 當 M g O 質量分數 為 1%時 , 320m in; 繼續(xù)增加 M 添加量 。 M g O 與海 , 比例。圖 2 Mg O 劑量對固定化細胞強度的影響214 不同置換物質對固定化細胞強度的影響此方法是將制備好的固定化細胞再置于一定濃 度 的 置 換 劑 溶 液 中 置 換 18h 。實 驗 選

13、用 ZnS O 4、 CuS O 4、 M nS O 4、 FeS O 4、 A l (NO 3 3和 A l C l 3做為置換物 質 , 結果見圖 3。用 ZnS O 4、 CuS O 4、 M nS O 4、 FeS O 4均 可以增加固定化細胞的強度 , 但增加作用不明顯 。 而采用鋁鹽做置換劑可以大幅度的提高固定化細胞 耐緩沖液腐蝕的能力 , 尤其以 A l (NO 3 3效果最好 。 這主要是因為 A l 3+把 Ca 2+從海藻酸鈣中置換出來, 磷酸鹽對海藻酸鋁的固定化細胞破壞性減小 。圖 3 不同置換物質對固定化細胞強度的影響215 置換時間對固定化細胞強度的影響從圖 4可知

14、, 在置換溶液中置換 18h 得到的固定化細胞強度最大 , 可達 310m in 。 隨著置換時間的延 長 , 固定化細胞的強度保持恒定 ,沒有明顯增加 。 食品工業(yè)科技S cience and Technology of Food Industry研究與探討 136 2008年第 02期圖 4 置換時間對固定化細胞強度的影響216 固定化細胞發(fā)酵生產酒精為了最后確定哪種方法更適于酒精發(fā)酵 , 在正交實驗結果的基礎上 , 將兩種方法制成的固定化細 胞按 1 3的比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基 , 28 、 130r/min 進 行酒精發(fā)酵 , 以正交實驗結果制備的固定化細胞為 空白對照 。 3d 為一個批

15、次 , 發(fā)酵結束后收集發(fā)酵液 , 測定酒精體積分數 。 固定化細胞重新接入新鮮發(fā)酵 液 , 如此重復 , 直至固定化細胞破碎 。結果表明 , 采 用改進的方法后 , 固定化細胞的壽命有了顯著的提表 2 改進方法酒精發(fā)酵結果比較 空白添加 Mg OA l (NO 置換使用時間 (d 153942酒精含量 (%, v/v 1310131819殘?zhí)橇?(% 01714高 , 且產酒率提高了 018%。其中 , 置換法要好于添 加法 , 可以連續(xù)使用 42d 共 14個批次的酒精發(fā)酵 。 而對照固定化細胞 , 在使用 5個批次后便發(fā)生溶解 。3 結論311 考慮到成本和制備的難易程度 , 海藻酸鈉濃度

16、3%, CaC l 2溶液濃度 115%, 鈣化時間 3h, 鈣化溫度 25 的條件下 , 得到的固定化細胞強度最大 。312 采用添加和置換的方法均可以顯著提高固定化細胞的使用壽命 , 采用添加 1%的 A l (NO 3 3可以獲 得最長的使用壽命 , 可以連續(xù)使用 42d 以上 , 且酒精 產率增加了 019%。參考文獻 :1王健 , 袁永俊 , 等 1利用活性干酵母進行固定化酵母酒精發(fā)酵的研究 J 1四川食品與發(fā)酵 , 2006(6 :1712何秀良 , 段俊英 , 等 1固定化細胞技術發(fā)酵玉米醪生產酒 精的研究 J 1微生物學雜志 , 1998 :242613林海 , , 等 究 1

17、, 124:8014(學 福建 :, 20011, 王志和 , 等 1生物統計學 M1北京 :科學出版 社 , 200211491531(上接第 133頁 13倍的粉末狀香辛料 的賦味效果 ; 而且在相同的時間內 , 吸附型復合香辛 料較粉末狀香辛料更易入味 , 更適合不需烹調或烹 調時間短的場合 ; 此外 , 吸附型香辛料口感飽滿細 膩 、 無渣滓 , 不會對加香產品造成質地不均和麻點 。表 6 對比實驗結果指標 對比樣品吸附型香辛料制得的鹵蛋 市售五香粉制得的鹵蛋 色澤 鹵蛋特有棕色 ; 蛋殼表面 潔凈 ; 蛋黃變色 淡棕色 ; 蛋殼表面附有浮沫 ; 蛋黃未變色 氣味 五香鹵蛋特有氣味 ,

18、 濃郁 五香鹵蛋特有氣味 , 比較淡 滋味 五香鹵蛋特有滋味 , 濃郁 五香鹵蛋特有氣味 , 比較淡 口感飽滿細膩 、 無渣滓口感 渣滓口感3 結論將 “ 五香粉 ” 傳統配料桂皮 、 八角茴香 、 花椒 、 小 茴香 、 生姜的油樹脂產品吸附于載體糊精上 , 制成具 有 “ 五香粉 ” 特色的吸附型復合香辛調味料 。 通過選擇檢驗感官評定法確定了復合油樹脂在 吸附型復合香辛料中的最佳含量為 3175%, 以其作 為配方設計時感官評定的復合油樹脂含量 。 在實際 應用中 , 其適宜含量為 3%10%。采用 S A S 軟件帶約束的混合設計 , 以感官評分 為指標 , 確定出五種油樹脂占復合油樹脂的最優(yōu)配 方為 :桂皮油樹脂 23183%、 八角茴香油樹脂22167%、 花椒油樹脂 18167%、 小茴香油樹脂 1915%、 生姜油樹 脂 15133%。 此時 , 感官評分預測值 Y=31193, 即一 般略偏喜歡 。分別采用最優(yōu)配方制得的吸附型復合香辛料和市售 “ 五香粉 ” 制作五香鹵蛋 , 經簡單描述感官評定 , 結果表明少量吸附型香辛料即可達到相當于其 13倍的粉末狀香辛料的賦味效果