高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器法同時測定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量

1、高效液相色譜-光電二極管陣列檢測器法同時測定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量         【摘要】  目的采用超聲輔助提取，建立高效液相色譜-光電二極管陣列檢測法測定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸的含量。方法 色譜柱為Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 m)，流動相為甲醇水磷酸（體積比87130.1），流速0.8 ml·min-1，檢測波長210 nm，柱溫28 。結(jié)果烏索酸進樣量在0.3595.744 g時，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999），平均回收率為98.

2、3 %， RSD為2.0 %(n=6)；齊墩果酸在0.1742.784 g時，與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r=0.999），平均回收率為99.6 %，RSD為2.5 %(n=6)。結(jié)論 方法操作簡便、快速、準確，可用于柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量的測定。 【關(guān)鍵詞】  反相高效液相色譜法 柿蒂 烏索酸 齊墩果酸 光電二極管陣列檢測器Abstract：ObjectiveTo develop an HPLC method with photodiode array detector(PAD) for the determination of ursolic acid and oleanoli

3、c acid in Diospyros kaki by ultrasowithnic wave aided method. MethodsThe separation was achieved on a Kromasil C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 m) at 28 using methanol-H2O-phosphoric acid (87130.1,V/V) as the mobile phase at a flow rate of 0.8 ml·min-1,  the detection wavelength was 210 n

4、m. ResultsUrsolic acid showed good relationship at the range of 0.3595.744 g (r=0.999). The recovery was 98.3 % and RSD was 2.0 %. Oleanolic acid showed good relationship at the range of 0.1742.784 g (r=0.999). The recovery was 99.6 % and RSD  was 2.5 %.ConclusionThe proposed method is simple,

5、rapid and accurate. It can be used to determine the contents of ursolic acid and oleanolic acid in Diospyros kaki.Key words:HPLC;   Diospyros kaki;   Ursolic acid;   Oleanolic acid;   Photodiode array detector   柿蒂Diospyros kaki Thunb.，別名為柿丁，為柿科植物柿的干

6、燥花萼，主產(chǎn)于四川、廣東、廣西、福建等地。其味苦、性溫，有降氣止呃功能，常用于胃寒氣滯的呃逆。臨床治療頑固性或術(shù)后呃逆，反流性胃炎等癥1。中國藥典2005版僅有柿蒂中沒食子酸的薄層鑒別方法，而無含量測定項2。文獻報道了高效液相色譜測定柿蒂中沒食子酸3,金絲桃苷和齊墩果酸等4有效成分含量的方法，但同時測定柿蒂中烏索酸和齊墩果酸含量的文獻至今未見報道。本文采用超聲輔助提取，建立高效液相色譜法對柿蒂中的烏索酸與齊墩果酸的含量進行了測定，為柿蒂的質(zhì)量評價及其有效成分的檢測提供科學(xué)依據(jù)。1  材料與試劑   Waters高效液相色譜儀（515泵，2996光電二極管矩陣檢測器

7、，7725I 進樣閥，Empower 中文色譜工作站），RO-MB-10D高純水機(杭州永潔達膜分離設(shè)備廠)，CP225D分析天平（德國Sartorius公司），F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)，202-26A型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)，KS-1500超聲提取儀器(寧波科盛儀器廠)。   甲醇為色譜純（色譜純，上海陸忠試劑廠），水為高純水，95%乙醇（分析純，江西同盟試劑化工廠），烏索酸和齊墩果酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110742-200314，110709-200304，供含量測定用）。柿蒂購于藥材市場，經(jīng)鑒定為柿

8、科植物柿的干燥花萼Diospyros kaki Thunb.。2   方法與結(jié)果2.1   色譜條件2.2  峰純度分析從光電二極管檢測器采集的樣品三維圖譜中提取紫外光譜和不同波長的色譜進行對比，檢測波長為210 nm時色譜峰信噪比高，峰形對稱，分離度達到色譜方法的定量要求5。采用Empower色譜軟件適應(yīng)性模塊對此波長的色譜峰進行純度分析，對照品和樣品中烏索酸和齊墩果酸色譜峰的純度角值均小于閾值，純度角線均位于自動閾值線下方，證實色譜峰為單一組分吸收峰。烏索酸和齊墩果酸的色譜峰純度分析見圖2。2.3  溶液配制分別精密稱定烏索酸、齊

9、墩果酸對照品3.59 mg和1.74 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成對照品混合溶液，備用。         2.4  線性關(guān)系試驗分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液中1，4，8，12，16 l進樣分析，按色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量(g)為橫坐標，峰面積(V·s)為縱坐標，進行線性擬合，得烏索酸線性回歸方程為：Y=6.44×105X-5.83×104（r=0.999），齊墩果酸線性回歸方程為：Y=7.54×105X-3.

10、70×104(r=0.999)。表明當(dāng)烏索酸進樣量在0.3595.744 g；齊墩果酸進樣量在0.1742.784 g時，線性關(guān)系良好。2.5  精密度實驗分別精密吸取烏索酸和齊墩果酸對照品混合溶液10 l進樣，平行5次，測定峰面積。烏索酸和齊墩果酸峰面積RSD分別為0.2 %(n=5)和0.6 %(n=5)。表明進樣方法和儀器精密度良好。2.6  重現(xiàn)性實驗取同批柿蒂樣品5份，每份各約3 g，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液。精密吸取各樣品溶液10 l，進樣，測定烏索酸和齊墩果酸峰面積，外標法計算含量。烏索酸含量RSD為1.8 %（n=5），齊墩果酸含量RSD為2

11、.3 %（n=5）。樣品處理方法重現(xiàn)性良好。2.7  加樣回收率實驗精密稱取已知烏索酸和齊墩果酸含量的柿蒂葉樣品6份，每份約3 g，按高、中、低3種濃度分別加入烏索酸和齊墩果酸對照品適量，制備樣品溶液，進樣測定樣品中烏索酸和齊墩果酸的含量。烏索酸平均加樣回收率為98.3%，RSD為2.0 %（n=6）；齊墩果酸平均回收率為99.6 %，RSD為2.5 %（n=6）。2.8   樣品含量測定 精密吸取不同的柿蒂樣品溶液10 l進樣，平行3次，測定烏索酸和齊墩果酸峰面積積分值，外標法計算柿蒂樣品中烏索酸和齊墩果酸的平均含量。結(jié)果見表1。表1  柿蒂

12、不同部位中烏索酸和齊墩果酸含量測定結(jié)果（略）3  討論   測定結(jié)果表明，不同柿蒂樣品中兩種三萜酸成分的含量較高，為藥材的主要活性成分。但烏索酸和齊墩果酸含量存在差異，且烏索酸含量均明顯高于齊墩果酸，約為齊墩果酸的2.82.9倍，2組分含量的相對值基本穩(wěn)定。   考察了Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 m）、Nucleodur C18（4.6 mm×250 mm，5 m）和Nova-Pak C18（3.9 mm×300 mm，4 m）3種色譜柱對同分異構(gòu)體烏索酸和齊墩果酸的分離效果，結(jié)果顯示不同型號色譜柱對烏索酸和齊墩果酸的分離度有較大的影響，Kromasil柱的分離效果最佳，烏索酸和齊墩果酸達基線分離，分離度為1.9，符合色譜定量分析的要求。   采用反相高效液相色譜法測定柿蒂中的烏索酸和齊墩果酸的含量，樣品處理簡單，無其它雜質(zhì)的干擾，可同時檢測待測組分的峰純度和紫外吸收特征光譜，增強了色譜的定性能力，方法簡便、快速，分離效果好，數(shù)據(jù)準確可靠。【參考文獻】  1肖培根.新編中藥志（第二卷）M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2002：487.2國家藥典委員會.中國藥典，