植原體tuf基因啟動子分子特征和棗樹抗植原體物質(zhì)研究

1、植原體tuf基因啟動子分子特征和棗樹抗植原體物質(zhì)研究植原體是一類引起眾多植物病害、無細(xì)胞壁、不能分離培養(yǎng)的原核微生物,其寄主種類多,危害面積廣,對經(jīng)濟(jì)和環(huán)境等影響嚴(yán)重。由植原體引起的泡桐叢枝病、棗瘋病、苦楝叢枝病、桑萎縮病、萵苣黃化病等是我國泡桐、棗樹等植物的一類毀滅性的病害,因此,從病原微生物遺傳多樣性、系統(tǒng)進(jìn)化、關(guān)鍵基因調(diào)控、寄主抗病物質(zhì)分析等角度來研究植原體生長繁殖和遺傳變異機(jī)制及其與寄主之間的互作關(guān)系有助于解決相關(guān)病害研究的基礎(chǔ)理論問題和提高病害防治水平,對于保障農(nóng)林業(yè)的健康發(fā)展具有較為重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)價值。本研究選用植原體的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fu

2、sA,gyrB,pyrG和rpoB共10個持家基因序列，結(jié)合16SrDNAff列，以全基因組序列已完成的洋蔥黃化植原體（OY-M）、翠菊黃化叢枝植原體（AYWB）澳大利亞葡萄黃化植原體（CPA）、草莓致死黃化植原體（SLY）和蘋果簇生植原體（CPM次5種植原體株系為參照，分析來自我國10個省的苦楝叢枝、萵苣黃化、桑萎縮、泡桐叢枝和長春花綠變植原體共18個株系的遺傳變異規(guī)律和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,通過多重序列比對分析不同基因片段的序列多態(tài)性和變異程度。研究結(jié)果表明:我國18株苦楝叢枝、萵苣黃化、桑萎縮、泡桐叢枝和長春花綠變植原體株系的rp,tuf,secA,secY,ipt,dnaK,fusA,gyrB

3、,pyrG和rpoB多位點(diǎn)序列共有15種序列類型,揭示了16SrI組不同植原體株系間豐富的遺傳多樣性?；趓p等10個基因多位點(diǎn)序列分析可將16SrI-B、D亞組的不同植原體株系清晰的分開。10株苦楝叢枝植原體株系與2株桑萎縮植原體株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近，多位點(diǎn)序列分析可將這兩種基于16SrDNA序列難以區(qū)分的植原體株系加以清晰的區(qū)分。10株來自我國不同地區(qū)的苦楝叢枝植原體株系分為4個進(jìn)化枝,其多位點(diǎn)序列存在8種序列類型,這4個分枝與植原體株系的地理分布關(guān)系密切。與我國長春花綠變和泡桐叢枝植原體株系相比,福建三明2株萵苣黃化植原體株系與日本洋蔥黃化植原體株系OY-M系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近。在已檢測分析的

4、植原體不同基因序列片段中,dnaK基因序列片段的變異水平最高。利用熱不對稱交錯式PCR(thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR獷增棗瘋植原體(JWB)tuf基因上游未知序列，利用啟動子探針載體pSUPV域功構(gòu)建了泡桐叢枝植原體(pawb)和jwbtuf基因上游序列的大腸桿菌異源表達(dá)體系,分析、驗(yàn)證了pawb、苦楝叢枝(cwb)、萵苣黃化(ly)、桑萎縮(md)、長春花綠變(pev)等16sri組和jwb、櫻桃致死黃化(cly)、重陽木叢枝(biwb)、黃金槐叢枝(sowb)等16srv組株系tuf基因上游序列的遺傳變異特征和啟動子活性。研究結(jié)果表明:泡桐

5、叢枝等16sri組植原體株系tuf基因和其上游fusa基因之間的間區(qū)序列長129-130bp,預(yù)測有完整的啟動子保守結(jié)構(gòu)。pawb-sdyz、ly-fjya1、pawb-fjfz株系tuf基因上游130bp片段和cwb-hnsy1株系tuf基因上游129bp片段具有啟動子活性，此間區(qū)序列在5種35株16sri組株系中存在4種變異類型;棗瘋病植原體等16srv組株系fusa和tuf基因間區(qū)長53-54bp,未預(yù)測到完整啟動子結(jié)構(gòu)。jwb-jsnj株系tuf基因上游144和346bp片段,jwb-hnpy株系tuf基因上游145和347bp片段均未檢測到啟動子活性，fusa和tuf基因間區(qū)序列在4

6、種21株16srv組株系中存在2種變異類型。fusa-tuf基因間區(qū)序列相對保守,基于此序列構(gòu)建的進(jìn)化樹可清晰區(qū)分不同組別的植原體株系。通過設(shè)計(jì)長片段pcr引物,進(jìn)一步擴(kuò)增了我國pawb-sdyz、pawb-fjfz和ly-fjya1植原體株系tuf基因及其上游6個基因rpll、rpob、rpoc、rps12、rps7、fusa序列,統(tǒng)計(jì)分析已研究的植原體基因啟動子的保守區(qū)域序列特征。通過反轉(zhuǎn)錄pcr(reversetranscription,rt-pcr)等方法檢測了植原體tuf基因及其上游部分基因在植原體中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。研究結(jié)果表明:擴(kuò)增獲得了pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly

7、-fjya1株系tuf基因上游12745-12748bp的序列,比較分析發(fā)現(xiàn)pawb-sdyz、pawb-fjfz、ly-fjya1、oy-m、aywb、paa、sly、at植原體株系tuf與其上游6個基因的結(jié)構(gòu)順序皆為5-rpll-rpob-rpoc-rps12-rps7-fusa-tuf-3。根據(jù)研究涉及的52個可能植原體基因啟動子保守區(qū)域結(jié)構(gòu)的序列特征,推測出可能的植原體基因啟動子保守區(qū)域序歹U模式為：t90t100g92t75g67a85(-35區(qū));190a96t92a98t73t90(-10區(qū))?；?個植原體株系的rpll-tuf核苷酸序列編碼基因、基因間區(qū)非編碼序列、編碼氨基酸

8、序列的mlsa分析可將不同組別、不同亞組、不同寄主的植原體株系以較高的支持率清晰的區(qū)分,與rpll-tuf核苷酸編碼區(qū)相比,不同植原體株系rpll-tuf核苷酸非編碼區(qū)變異水平更高。通過植物化學(xué)手段抽提抗棗瘋病棗樹葉片中的活性成分,并檢測棗樹提取液對部分細(xì)菌的抑菌活性,利用高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,hplc)等技術(shù)檢測分析棗樹提取液中相關(guān)抗病物質(zhì)及其含量。通過用不同濃度棗樹提取液處理?xiàng)棷偛『团萃﹨仓Σ〗M培苗分析其對組培苗生長和癥狀的作用。研究結(jié)果表明:在已抽提的20份抗棗瘋病能力不同、嫁接傳病后的棗樹提取液中均檢測到水楊酸,且含量差異

9、顯著(P=0.000<0.05)。茉莉酸僅在表現(xiàn)嚴(yán)重叢枝癥狀(IV-V級)的中抗品系87、138號棗樹葉片提取液中檢測到,而在表現(xiàn)嚴(yán)重叢枝癥狀的感病品系,和抗病接穗嫁接到病砧木上或表現(xiàn)輕癥狀（I-III級）或恢復(fù)無癥（0級）的棗樹葉片中皆未檢測到;水楊酸甲酯和茉莉酸甲酯在20份抗病和感病棗樹提取液中均未被檢測到。不同的棗樹材料甲醇提取液對堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌等細(xì)菌的生長具有較為明顯的抑制作用,143、55、103號抗病棗樹材料提取液處理的蕈狀芽孢桿菌抑菌圈直徑在5.758.5mm之間，差異顯著（P=0.004<0.05）。棗瘋病和泡桐叢枝病組培苗外植體會因MSW養(yǎng)基中甲醇溶劑和棗樹提取液濃度過高而產(chǎn)生藥害或致死。MSS養(yǎng)基中甲醇或棗樹提取液含量變化會對棗瘋病和泡桐叢枝病組培苗外植體生長和癥狀有一定的影響。多位點(diǎn)序列分析可做為一種對植原體鑒定、區(qū)分以及株系遺傳多樣性全面檢測的有效、可靠的方法。在以后的研究中該方法可廣泛應(yīng)用于深入探討植原體不同組間或亞組間株系的遺傳變異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。關(guān)于植原體啟動子、相鄰基因結(jié)構(gòu)解析和棗樹抗病物質(zhì)研究所建立的方法和所獲得的結(jié)果有助于對植原體關(guān)鍵基因結(jié)構(gòu)、代謝調(diào)控、遺傳變異規(guī)律等的深入研究和理解,為揭示植原