磁珠分離技術(shù)

1、1磁珠分離技術(shù)摘要：主要介紹了磁珠分離技術(shù)的基本概念，基本原理還有它的特點(diǎn)。磁珠分 離技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是免疫磁珠分離技術(shù)，這里詳細(xì)說(shuō)明了免疫磁珠分離技 術(shù)的結(jié)構(gòu)以及有由它的結(jié)構(gòu)決定的它的一些重要特性，以及免疫磁珠分離技術(shù) 的制備原理和方法。并且詳細(xì)說(shuō)明了免疫磁珠分離技術(shù)的重要應(yīng)用，為幫助同 學(xué)了解記憶，例舉了一些該技術(shù)的應(yīng)用實(shí)例。基本概念：磁珠是一種包被有生物活性基團(tuán)的功能化載體，可分散于基液中形成 磁性液體材料，它兼有液體的流動(dòng)性和固體磁性顆粒材料的雙重特點(diǎn)，從而使固 一液相的分離變得十分方便快捷。磁珠法的出現(xiàn)和應(yīng)用 ，給生命科學(xué)的研究提供 了一種新式的手段和武器，也給大、中學(xué)生對(duì)的直觀認(rèn)

2、識(shí)提供了一個(gè)簡(jiǎn)捷、客觀 的實(shí)驗(yàn)途徑。其中最常用的事免疫磁珠技術(shù)。原理：利用人工合成的內(nèi)含鐵成分，可被磁鐵磁力所吸引，外有功能基團(tuán)，可結(jié) 合活性蛋白質(zhì)（抗體）的磁珠，作為抗體的載體。當(dāng)磁珠上的抗體與相應(yīng)的微生物 或特異性抗原物質(zhì)結(jié)合后，則形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，這種復(fù)合物具有 較高的磁響應(yīng)性，在磁鐵磁力的作用下定向移動(dòng)，使復(fù)合物與其他物質(zhì)分離，而 達(dá)到分離、濃縮、純化微生物或特異性抗原物質(zhì)的目的。特點(diǎn):應(yīng)用于磁分離技術(shù)的磁性載體微球應(yīng)具備以下特點(diǎn) ：粒徑比較小，比表面 積較大，具有較大的吸附容量；物理和化學(xué)性能穩(wěn)定，具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使 用壽命長(zhǎng)；具有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，以用于親和配基的

3、固定化；粒徑均一，能形成單分散體系；懸浮性好，便于反應(yīng)的有效進(jìn)行。載體微球有納米級(jí)、微粒級(jí)的， 納米級(jí)的載體微球與微粒級(jí)的載體微球相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：尺寸小，擴(kuò)散速度快, 懸浮穩(wěn)定性好；比表面積大，偶聯(lián)容量大；超順磁性，能快速實(shí)現(xiàn)磁性粒子的分 散與回收。免疫磁珠（Immonumagnetic beads, IMB簡(jiǎn)稱磁珠）,由載體微球和免疫配基結(jié)合 而成。載體微球的核心部分為金屬小顆粒（Fe304, Fe203）,是一種磁性高且較穩(wěn) 定的磁性材料，核心外包裹一層高分子材料 （如聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚乙烯亞 胺）,最外層是功能基層，如羥基（.OH）,氨基（.NH2）,醛基（-CHO）竣基（一 CO

4、OH） 由于載體微球表現(xiàn)物理性質(zhì)不同，可共價(jià)結(jié)合不同的免疫配基（如酶、細(xì)胞、抗體、抗原、DNA、RNA等生物活性物質(zhì)。理想的免疫磁珠為一般粒徑較小，均勻11的球形，具有保護(hù)性殼及超順磁性的粒子，其結(jié)構(gòu)為：核心為磁性材料，核心外層包裹高分子材料，最外層為免疫配基。形成免疫磁珠的關(guān)鍵是磁性載體，按照其結(jié)構(gòu)的不同可分為三種：(1)殼一核結(jié)構(gòu)，即將高分子材料作為核，外面包裹磁性材料。(2)殼核殼結(jié)構(gòu)，中間為磁性材料，內(nèi)層和外層為高分子材料。(3)核殼結(jié)構(gòu)，磁性材料為核外面包裹高分子材料。作為免疫磁珠載體的磁性微球主要是核殼式結(jié)構(gòu)為最多。磁性材料多為Fe，Ni, Co等過(guò)渡金屬特定晶型的氧化物。目前應(yīng)用

5、最廣泛的是鐵及其氧化物(Fe,Fe304, Fe203等)。磁性微球是內(nèi)部含有納米磁性顆粒、外部為高分子殼層作為 載體的復(fù)合材料，其廣泛應(yīng)用于生物分子固定化和有機(jī)固相合成，在生物工程和生物醫(yī)學(xué)的研究和實(shí)踐中，固定化的生物分子通常用做親和分析的配基，也可作為生物反應(yīng)的催化劑或藥物磁性微球主要有以下特性：(1)粒徑小，均一程度高，磁性微粒粒徑(直徑)范圍在30 100rim 之間，且粒徑分布單分散，使微球具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)性，又不會(huì)因粒徑太大而發(fā)生沉降，具有較大的比表面積，偶聯(lián)容量大。(2)懸浮穩(wěn)定性好，以便高效地與目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行偶聯(lián)，具有豐富的表面活性基團(tuán)，以便磁性微球與具有生物活性的物質(zhì)，如生物酶

6、，蛋白質(zhì)等，同時(shí)也可在其表面結(jié)合特異性靶向分子，如各種特異性抗體等，表面標(biāo)記生物分子進(jìn)而應(yīng)用于酶的固定化，免疫檢測(cè)，細(xì)胞分選，腫瘤的靶向治療，藥物載體及核酸的純化與分離等生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。(3)具有超順磁性：在外加磁場(chǎng)的存在下，磁性微粒有較好的響應(yīng)性，能迅速聚集， 當(dāng)撤去外加磁場(chǎng)時(shí)，磁性微粒無(wú)磁性記憶，能夠均勻分散，不出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。(4)操作簡(jiǎn)便，在外磁場(chǎng)的作用下便可進(jìn)行磁粒的反復(fù)分離，分離過(guò)程十分簡(jiǎn)單，可省去離心，過(guò)濾等繁瑣操作，節(jié)約時(shí)間，與目前已有的醫(yī)學(xué)與生物相關(guān)方法相比，具有較好的優(yōu)勢(shì)。(5)磁性微球應(yīng)用在生物工程，尤其是在生物醫(yī)學(xué)工程時(shí)，必須具有良好的生物相容性。這些生物高分子如脂類、多

7、聚糖、蛋白質(zhì)具有良好的生物相容性，它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)安全無(wú)毒，可降解，不與人體組織器官產(chǎn)生免疫抗原性。同時(shí)，磁性微?？煞奖阊杆俚赝ㄟ^(guò)機(jī)體自然排出，而不會(huì)影響機(jī)體的健康，這種性質(zhì)在靶向藥物中尤其重要。不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能。(6)磁性微粒具有一定的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解，其結(jié)構(gòu)內(nèi)的磁性物質(zhì)不易被氧化，磁性微粒的這種物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定特點(diǎn)，使其磁性能不易下降。磁性微粒的制備原理與方法： 按研究磁性微粒的學(xué)科分類，可將其分為物理、化學(xué)以及其他一些特殊的制備方法。磁性微粒的化學(xué)制備方法1 .化學(xué)共沉淀法用化學(xué)共沉淀法合成超順磁流體，該法指二價(jià)與三

8、價(jià)鐵離子在堿性條件下生成沉淀，或利用氧化.還原反應(yīng)生成 Fe304共沉淀反應(yīng)原理方程式如下： Fe2+2Fe3+80年Fe304+4H20在合成過(guò)程中，條件的選擇至關(guān)重要，物料比， 堿用量，溫度，晶化溫度，攪拌速度，反應(yīng)時(shí)間，時(shí)間等因素均會(huì)影響最終產(chǎn)物納米級(jí)Fe304的生成和性質(zhì)。共沉淀法得到的磁性微粒通常粒徑較小(10nm"-'100rim)， 因而具有較大比表面積和固載量。但由于磁響應(yīng)性較弱，含磁量低，操作時(shí)需要較強(qiáng)的外加磁場(chǎng)作用。2 .沉淀氧化法一定濃度的鐵鹽在堿性條件下生成氫氧化亞鐵沉淀，在恒溫?cái)嚢枨闆r下，向氫氧化亞鐵沉淀中加入雙氧水使其氧化成 Fe304微粒。其反應(yīng)

9、式如下：Fe2+20H =Fe(OH)2 3Fe(OH)2+O=Fe304+3H2采用沉淀氧化法合成Fe304磁性微粒， 原材料的純度，反應(yīng)的堿比，溫度，通氣量，氧化時(shí)間等各個(gè)因素都對(duì)磁粒的性能有影響。由于存在著粒度分布不均勻的問(wèn)題，還有待于進(jìn)一步研究解決3 .改進(jìn)共沉淀法改進(jìn)共沉淀法是在共沉淀法制備 Fe304納米微粒的基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，沉淀 物在洗滌、過(guò)濾、干燥時(shí)易產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，一種通過(guò)加入表面活性劑，對(duì)制得的納米Fe304微粒進(jìn)行表面改性，使其具有親水性或親油性，最后通過(guò)膠溶等方式 來(lái)獲得磁性液體，另外一種是制得納米Fe304復(fù)合粒子，這種納米Fe304復(fù)合粒 子能在更大pH范圍內(nèi)穩(wěn)

10、定分散。蔣新宇等(2003沈通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成Fe304微 粒， 充分洗滌后對(duì)其表面包覆雙層表面活性劑，得到具有磁響應(yīng)性和穩(wěn)定性強(qiáng)的納米級(jí)Fe304磁性粒子。在改性過(guò)程中，P H值、表面活性劑的成分配比和表面活性劑的用量對(duì)顆粒改性效果影響很大，王偉等（2001）通過(guò)大量的研究，強(qiáng)堿性和酸性環(huán)境不利于改性，P H 值在8"-'-12 時(shí)效果最好，通過(guò)理論計(jì)算可以得出表面活性劑用量。程海斌等（2003）采用改進(jìn)共沉淀法制得的納米級(jí) Fe304復(fù)合微 粒，在更寬的P H范圍內(nèi)能穩(wěn)定分散。研究表明，P H值、表面活性劑、茸電位 對(duì)Fe304復(fù)合微粒分散性產(chǎn)生很大的影響。另外，磁性微粒的

11、化學(xué)制備方法還有 化學(xué)還原法、電沉積法、水熱合成法等。磁性微粒的物理制備方法：1 .高能球磨法高能球磨法是一個(gè)無(wú)外部熱能供給和由大晶粒變?yōu)樾【Я５母吣芮蚰ミ^(guò)程，其原理是在高能球磨機(jī)中將金屬粉末長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)轉(zhuǎn)，金屬粉末在接受回轉(zhuǎn)機(jī)械能傳遞后，在冷態(tài)下反復(fù)擠壓和破碎作用下，成為彌散分布的超細(xì)微粒粒。氣流磨作為常用的納米粉碎技術(shù)，其通過(guò)熱蒸汽能量或者高速氣流產(chǎn)生的粒度微細(xì)，粒度分布窄、粒子表面光滑、分散性好、活性大、形狀規(guī)則、純度高等優(yōu)點(diǎn)。2 .物理氣相沉積法物理氣相沉積法是利用真空蒸發(fā)、激光加熱蒸發(fā)、濺射、 電子束照射等方法使原料氣化或形成等離子體，接著在介質(zhì)中急劇冷凝。雖然制得的納米微粒純度高，結(jié)晶

12、組織好，易于粒度的控制，但是技術(shù)設(shè)備相對(duì)要求高。根據(jù)加熱源的不同，目前用于制備納米鐵微粒的方法可以分為：1、熱等離子體法，該法是將金屬粉末用等離子體熔融、蒸發(fā)和冷凝以制得納米微粒。所制得的微粒粒度均勻、純度高。郝春成等（2000）采用心+H2電弧等離子體方法制備出平均粒徑為 40rim的球形超鐵超微粒子。2、濺射法，濺射法是替代蒸發(fā)利用濺射現(xiàn)象制得的納米級(jí)微粒。該法不僅可以制備納米級(jí)金屬微粒，而且可用于制備納米金屬薄膜。3、惰性氣體冷凝法，是將純度高的惰性氣體和蒸發(fā)物質(zhì)引入到真空加熱蒸發(fā)裝置內(nèi)，經(jīng)過(guò)一系列能量反應(yīng)，最后通過(guò)凝聚作用形成納米級(jí)簇團(tuán)。刮下聚集在液氮冷卻棒上的粉狀微粒，在真空高壓裝置

13、中制備成厚度為10微米1毫米、直徑為幾毫米的圓片。3 .真空冷凍干燥法先將濕物料在冷凍劑作用下降溫凍結(jié)成凝膠或固體，然后將凝膠或固體在低溫低壓下真空干燥，使凝膠或固體中的溶劑成分升華除去，從而得到干燥的納米粒子。這種方法結(jié)合了真空技術(shù)和低溫技術(shù)。采用真空冷凍干燥法制備納米粒子，具有微粒形狀規(guī)則、粒徑小且均勻、粒子間無(wú)硬團(tuán)聚、化學(xué)純度高、分散性好、比表面積高等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)方法在大規(guī)模生產(chǎn)微細(xì)粉末時(shí)，不僅成本較低，而且操作簡(jiǎn)便、 可靠， 具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。另外， 磁性微粒的物理制備方法還有聚合法、鹽析法、深度塑性變形法、分子自組裝法(SA> LB膜法等。應(yīng)用范圍：磁珠分離技術(shù)在生物學(xué)方面的

14、應(yīng)用始于20 世紀(jì)70 年代后期, 目前已經(jīng)在分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)等領(lǐng)域取得一些令人矚目的研究成果。免疫磁性珠( Immonumagnet ic beads, IMB )是免疫微球的一種。免疫微球是于70 年代中期發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)免疫學(xué)技術(shù), 它具備了固相化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)以及免疫學(xué)反應(yīng)的高度專一性, 所以它在免疫檢測(cè)、免疫吸附、細(xì)胞分離和培養(yǎng)等領(lǐng)域中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用1 、用于細(xì)胞分離和提純使用 IMB 進(jìn)行分離細(xì)胞有兩種方式；直接從細(xì)胞混合液中分離出靶細(xì)胞的方法， 稱為陽(yáng)性分離；用免疫磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使靶細(xì)胞得以純化的方法稱為陰性分離。免疫磁珠技術(shù)可用來(lái)分離人類各

15、種細(xì)胞如紅細(xì)胞、外周血嗜酸/堿性粒細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞、造血細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、T 6淋巴細(xì)胞，人類關(guān)節(jié)滑膜細(xì) 胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞、及多種腫瘤細(xì)胞等。2、體外細(xì)胞擴(kuò)增樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendriticcells, DC造血干、祖細(xì)胞等細(xì)胞在科研及臨床上都具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，但是在體內(nèi)含量較少而且分布廣泛，難以獲得大量高純度的細(xì)胞，限制了該領(lǐng)域的發(fā)展。體外擴(kuò)增輔以免疫磁珠技術(shù)有望解決這一難題。在這一過(guò)程中，用免疫磁性微球分離純化出待擴(kuò)增的細(xì)胞，用特定的因子組合培養(yǎng)，許多研究者用這樣的方法尋找擴(kuò)增的最佳細(xì)胞因子組合和移植的最佳時(shí)機(jī)。3、免疫檢測(cè)免疫磁性微球可以簡(jiǎn)單快速地從血液或者骨髓中富集、清除癌細(xì)胞

16、，廣泛地應(yīng)用于疾病檢測(cè)、癌癥治療和自身骨髓移植中，還被用于從母體外周血中分離胎兒細(xì)胞進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷。免疫磁珠分離技術(shù)用在微生物檢測(cè)方面能準(zhǔn)確快速地檢測(cè)出樣品中的Coli O 157，這對(duì)于食品衛(wèi)生和預(yù)防疾病的傳播具有重要的意義。PC叱術(shù)與免疫磁珠技術(shù)結(jié)合在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷學(xué)等方面有非常重要的作用， 這方面的研究在醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面的應(yīng)用，可以簡(jiǎn)便快速地診斷膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、腹膜胃癌、上皮腫瘤細(xì)胞等，使免疫磁性分離技術(shù)的應(yīng)用更加廣泛。4、在核酸與基因工程上的應(yīng)用免疫磁球可以看作是親合層析技術(shù)中的微型配基裁體，借助親合素-生物素(Biotin-Avidin)系統(tǒng)免疫磁球可與非蛋白質(zhì)結(jié)合，

17、生物素和親合素間有著高度的親和力，兩者的結(jié)合迅速、專一、穩(wěn)定，在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、免疫組織化學(xué)等領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，與生物磁珠技術(shù)結(jié)合后，更是產(chǎn)生了誘人的發(fā)展前景，并廣泛地應(yīng)用于分離純化 RNA mRNA核酸片段等及相關(guān)研究。河南惠爾納米科技有限公司很早就在從事該方面的研究，并且已經(jīng)研發(fā)出多款磁珠法核酸提取試劑盒，性能相當(dāng)穩(wěn)定。下面是核酸提取的一般流程：5、用于分型免疫磁珠法可被應(yīng)用于臨床器官移植供受者的快速選配。在高梯度磁場(chǎng)下,用免疫磁珠法分離靜脈或腹腔血中T、 B 淋巴細(xì)胞，并利用分離的淋巴細(xì)胞進(jìn)行HLA-I II類抗原分型。如采用磁珠技術(shù)和單抗試劑建立起可在1.5h完成HLA-I

18、H類抗原一類分型的新方法，還可應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)進(jìn)行腎移植供受體的HLA分型、探討血液病患者反復(fù)血小板輸注的治療效果與HLA之間的相關(guān)性。6、用作靶向釋藥系統(tǒng)的載體免疫磁性微球作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體可使免疫磁性微球上的抗癌藥物更易與癌細(xì)胞接觸，服用這種制劑后，在體外適當(dāng)部位用一適宜強(qiáng)度的磁鐵，將磁性微球引導(dǎo)到體內(nèi)特定靶區(qū)，提高了殺傷癌細(xì)胞的效果。很多研究者使用不同的方法制成了針對(duì)不同癌細(xì)胞的免疫磁性微球，作為靶向釋藥系統(tǒng)的載體并在實(shí)驗(yàn)中證實(shí)這種釋藥載體具有良好的功效。應(yīng)用實(shí)例1 . 成人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離與純化【摘要】 目的： 利用免疫磁珠分離成人骨髓神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(nerve grow

19、th factorreceptor, NGFR)日性細(xì)胞，獲得同質(zhì)性骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)方法采用Percoll密度梯度離心法分離成人骨髓中單個(gè)核細(xì)胞(瑚nnonuclear cells, MNCs)。Xt MNCs進(jìn)行常規(guī)貼壁培養(yǎng)或應(yīng)用磁分離技術(shù)分離NGFR+田胞。分別檢測(cè)NGFR+田胞和常規(guī)貼壁培養(yǎng)所獲BMSC咻外擴(kuò)增和集落形成能力，分析其細(xì)胞表 型和細(xì)胞周期，并進(jìn)行成骨、成脂肪誘導(dǎo)。結(jié)果免疫磁珠分離獲得NGFR+田胞的 純度為(90. 4±4 7)%, NGFR+ffl胞較貼壁培養(yǎng)獲得BMSCsM備更強(qiáng)增殖能力和 成骨及

20、成脂肪分化潛能。結(jié)論：利用免疫磁珠分離骨髓 NGFR+田胞可以獲得同質(zhì)性原始BMSCs2 .用于溶藻弧菌快速檢測(cè)的免疫磁珠技術(shù)摘 要：近年來(lái)，我國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，特別是高密度養(yǎng)殖模式的推廣，造成養(yǎng)殖生物細(xì)菌性疾病發(fā)生的頻率和范圍逐漸擴(kuò)大。由于溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)是海洋優(yōu)勢(shì)弧菌之一，故由溶藻弧菌引起的養(yǎng)殖品種的病害也占有 很高比例。由溶藻弧菌引起的魚(yú)、蝦、貝類等養(yǎng)殖品種致病，對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)造成很大損失。目前我國(guó)對(duì)于養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種溶藻弧菌等的細(xì)菌性疾病的治療，主要依靠投放大量的抗生素，長(zhǎng)此以往不僅使病原菌產(chǎn)生了耐藥性，而且由于藥物的殘留同時(shí)也對(duì)人類的健康造成重大威脅

21、。因此建立溶藻弧菌的快速、準(zhǔn)確、 敏感檢測(cè)方法是十分重要的。即能夠在早期診斷出溶藻弧菌潛在的致病威脅，還可以在早期進(jìn)行治療和預(yù)防，這樣可以在一定程度上減少抗生素的使用，提高養(yǎng)殖品種的存活率。而且建立起的檢測(cè)方法還可以用于水產(chǎn)品的安全檢測(cè)，避免食物中的溶藻弧菌對(duì)人類健康造成威脅。免疫磁珠分離技術(shù)(immunomagnetic separation, MS)是以免疫磁珠為基礎(chǔ)發(fā)展起 來(lái)的免疫檢測(cè)技術(shù)，是以抗體包被的磁珠為載體，利用抗原抗體的特異性反應(yīng),在反應(yīng)體系中形成抗原-抗體磁珠復(fù)合物，該復(fù)合物在磁場(chǎng)的作用下做定向運(yùn)動(dòng)，從而達(dá)到分離抗原的作用。免疫磁珠分離技術(shù)不僅兼具固相化試劑特有的優(yōu)點(diǎn)和免疫學(xué)

22、反應(yīng)的高度專一性等特點(diǎn)，而且分離時(shí)間短、速度快、分離效率高，不影響被分離生物材料的生物學(xué)性狀和功能，因此成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外比較熱門的一種新的免疫學(xué)技術(shù)，并在生物大分子與細(xì)胞的分離檢測(cè)方面表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本研究就是以該技術(shù)為基礎(chǔ)，建立快速、高效的溶藻弧菌免疫磁珠快速檢測(cè)技術(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：( 1) 通過(guò)石碳酸滅活法制備溶藻弧菌抗原，用以免疫新西蘭大白兔，頸動(dòng)脈取血法共集150mL 抗血清，其凝集效價(jià)為1:5120。通過(guò)蛋白A 柱親和層析法從10mL 抗血清純化出濃度為2.8579mg/mL 的兔抗溶藻弧菌IgG 共40mL。改良ELISA法測(cè)定IgG的效價(jià)為1:256000。（2）利用ELI

23、SA法檢測(cè)溶藻 弧菌兔抗IgG的包被效果。結(jié)果為2仙L免疫磁珠的最大結(jié)合量為0.5g/mL最 佳結(jié)合時(shí)間為5min。不同pH值，離子濃度對(duì)IgG與磁珠的結(jié)合無(wú)明顯影響。（3） 初步建立了溶藻弧菌免疫磁珠的檢測(cè)技術(shù)：用已包被兔抗溶藻弧菌IgG 的免疫磁珠檢測(cè)溶藻弧菌，結(jié)果為1mL 菌液中免疫磁珠的最佳加入量（最佳工作濃度）為204最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。免疫磁珠檢測(cè)敏感性為2.8cfu/mL3.磁珠分離DNA技術(shù)檢測(cè)HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變摘要HIV 1 逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變導(dǎo)致的耐藥性嚴(yán)重影響了藥物對(duì)病人的治療效果，耐藥性突變的檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)合理用藥具有重要意義。發(fā)展了一種檢測(cè)HIV 1

24、逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變的新方法，在兩步 MS-PCR方法的基礎(chǔ)上，引入磁珠分 離DNA技術(shù)并結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法（ELIS頤測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶基因耐藥性突變 T215F和Y181C結(jié)果顯示：MSPCR吉合磁珠分離技術(shù)和ELISAft有較高的靈 敏度和特異性，陽(yáng)性陰性比值（P N 值 ）達(dá)到要求，突變型模板檢測(cè)限為5左右，耗時(shí)短且能進(jìn)行高通量檢測(cè)。方法原理:本研究采用的MS. PCR吉合磁珠分離DNA技術(shù)檢測(cè)耐藥性突變。原理 如圖1所示。81:在第一輪PCR馬到待檢測(cè)位點(diǎn)基因后，第二輪PCR弓I入MS-PCR 檢測(cè)點(diǎn)突變技術(shù)的原理，設(shè)計(jì)了一對(duì)長(zhǎng)度一致的MSPCR引物。其中Pw和P。的3'末端

25、第一位堿基分別與野生型和突變型模板的堿基序列相對(duì)應(yīng)，P。和P。分別在3'末端24位的不同位置再引入一個(gè)突變，這樣兩個(gè)引物就有3個(gè)位點(diǎn)不匹配。兩個(gè)引物通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)，分別擴(kuò)增與自身序列更相似的模板。在PM 的 5 端標(biāo)記地高辛，BIO. RT2的5端標(biāo)記生物素，當(dāng)有突變型模板存在時(shí)，P。引物競(jìng)爭(zhēng)突變型模板能力強(qiáng)于 Pw, PCFT物為一端生物素另一端地高辛 標(biāo)記的雙鏈DNA,利用親和素包被磁珠捕獲 DNA產(chǎn)物，通過(guò)堿性磷酸酶標(biāo)記的 地高辛抗體可以利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELIS法對(duì)DNA產(chǎn)物中的地高辛進(jìn)行 檢測(cè)，從而檢測(cè)點(diǎn)突變的存在。總之，MS-PCR吉合磁珠分離DNA技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶基因

26、的耐藥性突變檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性好、無(wú)污染、能實(shí)現(xiàn)高通量等一系列優(yōu)點(diǎn)，有較好的臨床應(yīng)用前景，下一步工作將進(jìn)行較多臨床樣品實(shí)測(cè)， 并通過(guò)與國(guó)際認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)方法的平行比較，以完善該方法以求達(dá)到臨床應(yīng)用要求。4 .致病性大腸桿菌與免疫磁珠分離技術(shù)致病性大腸桿菌特別是O157： H7 已成為世界性的傳染性病原，是食品安全和公共衛(wèi)生的重要監(jiān)測(cè)對(duì)象之一。免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)新的技術(shù)，可以特異性地、有效地分離出相應(yīng)的0157 和其它微生物及生物活性組分，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和工作效率。免疫磁珠分離技術(shù)是一項(xiàng)新的技術(shù)，可以特異性地、有效地分離出相應(yīng)的 0157 和其它微生物及生物活性組分，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和工

27、作效率。免疫磁珠(Immunomagnetic Beads, IMB)就是將直徑0. 054微米具有超順磁性的微粒的表面經(jīng)化學(xué)修飾，使之與特異性抗體牢固結(jié)合，成為能與特異性抗原結(jié)合且有磁性的微珠。樣品經(jīng)618小時(shí)增菌后，分別取1 - 1. 2毫升增菌液和50微升免疫磁珠加入帶蓋塑料瓶中，在磁板背景下混合，如果有相應(yīng)抗原存在，免疫磁珠就會(huì)將其捕獲，然后利用磁性將免疫磁珠聚集，經(jīng)清洗后接種到選擇性分離平板上 .5 .磁分離技術(shù)及其在食源性致病菌監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行分離免疫磁珠分離技術(shù)的最突出的優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，可以明顯提高檢免疫磁珠分離技術(shù)在傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法中的應(yīng)用免疫磁珠分離技術(shù)可以選擇性的富集樣品溶

28、液或增菌液中的目標(biāo)致病菌, 通過(guò)洗脫可以除去檢樣中的各種雜菌和干擾物質(zhì), 因此可以顯著提高食源性致病菌的檢出率。Skjerve21等報(bào)道采用免疫磁性分離技術(shù) , 從乳及乳制品、肉類和蔬菜中分離沙門菌, 其檢測(cè)靈敏度為100 cfu / g。Chapm an 22分別用選擇性平板直接分離和免疫磁珠分離的方法從84份牛糞中分離O157: H7,分離菌株數(shù)分別為23和61,說(shuō)明免疫磁珠分離O157: H7的靈敏 度、特異性都較好。陳純23等應(yīng)用自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)系統(tǒng)(V IDAS)自動(dòng)免疫磁珠收集系統(tǒng)( AIM S)、 傳統(tǒng)的常規(guī)分離方法對(duì)腸出血性大腸桿菌O157: H 7檢測(cè)進(jìn)行了比較, 結(jié)果應(yīng)用自

29、動(dòng)免疫磁珠收集系統(tǒng)對(duì)79 份樣品檢測(cè), 檢出率為6133%,而自動(dòng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)系統(tǒng)(VIDAS和傳統(tǒng)分離方法未檢出。測(cè)靶細(xì)菌的準(zhǔn)確 性，止匕外，在有些情況下可以節(jié)約 121 8小時(shí)的時(shí)間。結(jié)論：免疫磁珠分離技術(shù)(Immunomagnetic beads separation technique，s IMB)是將免疫學(xué)反應(yīng)的高度特異性與磁珠特有的磁響應(yīng)性相結(jié)合的一種新的免疫學(xué)技術(shù)；是一種特異性強(qiáng)、靈質(zhì)純化敏度高的免疫學(xué)檢測(cè)方法和抗原純化手段。是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究較多的一種新的免疫學(xué)技術(shù)。目前該項(xiàng)技術(shù)在細(xì)胞分離、蛋白、免疫學(xué)及微生物學(xué)檢測(cè)等方面均取得了較大的進(jìn)展，是目前最有推廣價(jià)值的技術(shù)之一。參考文

30、獻(xiàn)：1. Kitano Y;Radu A;Shaaban A;Flake AWSelection, enrichment, andculture expansion of murine mesenchymal progenitor cells by retroviraltransduction of cycling adherent bone marrow cells 外文期刊 20002. Chen LT;Weiss L The development of vertebral bone marrow in the human fetuses 19763. Jones EA;Kinsey S

31、E;English A;Jones RA, Straszynski L, Meredith DM, Markham AF, Jack A, Emery P,McGonagle D Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitorcells 外文期刊 20024. Glass DJ;Nye SH;Hantzopoulos P;Macchi M J,Squinto SP,Goldfarb M,Yancopoulos GD TrkB mediatesBDNF/NT-3-depende

32、nt survival and proliferation in fibroblasts lacking the low affinity NGF-receptor 外文期刊 19915. Trim N;Morgan S;Evans M;Issa R, Fine D, Afford S, Wilkins B, IredaleJ Hepatic stellate cells express the low affinity nerve growth factorreceptor p75 and undergo apoptosis in response to nerve growth factorstimulation 外文期刊 20006. Simmons PJ;Torok-Storb B CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow 19917. Civi