材料結(jié)構(gòu)熒光分析法

1、 熒光分析法熒光分析法（fluorescence)教學(xué)目標(biāo)：教學(xué)目標(biāo)：掌握分子熒光產(chǎn)生機(jī)理掌握分子熒光產(chǎn)生機(jī)理掌握激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的產(chǎn)生以及發(fā)射光譜掌握激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的產(chǎn)生以及發(fā)射光譜特征特征掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及熒光強(qiáng)度的影掌握熒光與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系以及熒光強(qiáng)度的影 響因素響因素熟悉熒光定量分析方法及熒光分光光度計(jì)熟悉熒光定量分析方法及熒光分光光度計(jì)了解分子熒光分析法的應(yīng)用了解分子熒光分析法的應(yīng)用熒光棒發(fā)光原理熒光棒發(fā)光原理 熒光棒中的化學(xué)物質(zhì)主要由三種物質(zhì)組成：過氧熒光棒中的化學(xué)物質(zhì)主要由三種物質(zhì)組成：過氧化物、酯類化合物和熒光染料。簡(jiǎn)單地說，熒光棒發(fā)化物、酯類化合物和熒光染料。

2、簡(jiǎn)單地說，熒光棒發(fā)光的原理就是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)，將反光的原理就是過氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)，將反應(yīng)后的能量傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目應(yīng)后的能量傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目前市場(chǎng)上常見的熒光棒中通常放置了一個(gè)玻璃管夾層，前市場(chǎng)上常見的熒光棒中通常放置了一個(gè)玻璃管夾層，夾層內(nèi)外隔離了過氧化物和酯類化合物，經(jīng)過揉搓，夾層內(nèi)外隔離了過氧化物和酯類化合物，經(jīng)過揉搓，兩種化合物反應(yīng)使得熒光染料發(fā)光。兩種化合物反應(yīng)使得熒光染料發(fā)光。 熒光分析法熒光分析法熒光：熒光：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從第物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射一激

3、發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。出的光。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高；選擇性好；試樣量少；方法靈敏度高；選擇性好；試樣量少；方法簡(jiǎn)單。簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：應(yīng)用范圍小。應(yīng)用范圍小。熒光分析法：熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測(cè)定的方法。第一節(jié)第一節(jié) 熒光分析法的基本原熒光分析法的基本原理理一、分子熒光一、分子熒光（一）分子熒光的產(chǎn)生（一）分子熒光的產(chǎn)生基態(tài)基態(tài)單重態(tài)單重態(tài)S三重態(tài)三重態(tài)TE isS12 sM單重態(tài)：?jiǎn)沃貞B(tài)：s=0，M=1，分子所處的電子能態(tài)。分子所處的電子能態(tài)。分子的多重性：分子的多重性：總

4、自旋量子數(shù)：總自旋量子數(shù)：三重態(tài)：三重態(tài)：s=1，M=3，分子所處的電子能態(tài)。分子所處的電子能態(tài)。1.1.分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程分子的電子能級(jí)與激發(fā)過程電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過輻射躍遷過輻射躍遷( (發(fā)光發(fā)光) )和無輻射躍遷等方式失去能量。和無輻射躍遷等方式失去能量。2.2.熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷輻射躍遷熒光熒光振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫無輻射躍遷無輻射躍遷磷光磷光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能能量量l l

5、 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫( (vibrational relexation) )：出于激發(fā)態(tài)各振出于激發(fā)態(tài)各振動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動(dòng)能動(dòng)能級(jí)的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動(dòng)能量傳遞給溶劑分子，其電子返回到同一電子能級(jí)的最量傳遞給溶劑分子，其電子返回到同一電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)間的過程；發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間低振動(dòng)能級(jí)間的過程；發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間10 -12s s。內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換( (internal conversion) )：當(dāng)兩個(gè)電子激當(dāng)兩個(gè)電子激發(fā)態(tài)之間

6、的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子受激分子常由高電子能級(jí)以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的過程。能級(jí)的過程。S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫 外部能量轉(zhuǎn)換外部能量轉(zhuǎn)換 （external conversion)：激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而失分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而失去能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減去能量的

7、非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或弱或“猝滅猝滅”。 體系間跨越體系間跨越(intersystem crossing)：處于激發(fā)態(tài)處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程；分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)生變化的過程；分子由激發(fā)單重態(tài)跨越到激發(fā)三重態(tài)。三重態(tài)。非輻射能量傳遞過程非輻射能量傳遞過程S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫輻射能量傳遞過程輻射能量傳遞過程熒光發(fā)射：熒光發(fā)射：激發(fā)分

8、子從激發(fā)分子從第一激發(fā)單重態(tài)的最低振第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的光子輻躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為射稱為熒光熒光；熒光輻射能要比激發(fā)能量低，熒光；熒光輻射能要比激發(fā)能量低，熒光波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)；熒光發(fā)射時(shí)間為波長(zhǎng)大于激發(fā)波長(zhǎng)；熒光發(fā)射時(shí)間為10-9-10-7s。磷光發(fā)射：磷光發(fā)射：激發(fā)分子由激發(fā)分子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)能級(jí)躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱躍遷到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)時(shí)所產(chǎn)生的光子輻射稱為為磷光磷光；磷光輻射能要比熒光輻射能量低，磷光波磷光輻射能要比熒光輻射能量低，磷光波長(zhǎng)大于熒光波長(zhǎng)；磷光發(fā)射時(shí)

9、間為長(zhǎng)大于熒光波長(zhǎng)；磷光發(fā)射時(shí)間為10-4-10s。S2S1S0T1吸吸收收發(fā)發(fā)射射熒熒光光發(fā)發(fā)射射磷磷光光系間跨越系間跨越內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換l l 2T2內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)弛豫振動(dòng)弛豫熒光分光光度計(jì)的主要部件：熒光分光光度計(jì)的主要部件：光源、激發(fā)單色器、光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)。發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)。光源光源激發(fā)單色器激發(fā)單色器樣品池樣品池發(fā)射單色器發(fā)射單色器檢測(cè)器檢測(cè)器放大器放大器指示器指示器記錄器記錄器（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（二）熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜激發(fā)光譜激發(fā)光譜（excitation

10、 spectrum）：將激發(fā)光的光：將激發(fā)光的光源用激發(fā)單色器分光，使不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)源用激發(fā)單色器分光，使不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光體，然后讓所產(chǎn)生的熒光通過熒光體，然后讓所產(chǎn)生的熒光通過固定波長(zhǎng)的發(fā)固定波長(zhǎng)的發(fā)射單色器射單色器而照到檢測(cè)器上，測(cè)定不同波長(zhǎng)光照射而照到檢測(cè)器上，測(cè)定不同波長(zhǎng)光照射下熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光下熒光強(qiáng)度的變化，以激發(fā)波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，可得熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。注意：注意：激發(fā)光譜與其吸收光譜極為相似，但激發(fā)光激發(fā)光譜與其吸收光譜極為相似，但激發(fā)光譜曲線是譜曲線是熒光強(qiáng)度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線熒光強(qiáng)度與波

11、長(zhǎng)的關(guān)系曲線，吸收曲線則，吸收曲線則是是吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線吸光度與波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，兩者性質(zhì)是不同的。，兩者性質(zhì)是不同的。熒光光譜（熒光光譜（fluorecence spectrum）：）：固定激發(fā)固定激發(fā)光波長(zhǎng)為最大激發(fā)波長(zhǎng)光波長(zhǎng)為最大激發(fā)波長(zhǎng)，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的，而讓熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)不同波長(zhǎng)熒光通過發(fā)射單色器分光掃描并檢測(cè)不同波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度，以發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)下的熒光強(qiáng)度，以發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。度為縱坐標(biāo)作圖，得到物質(zhì)的熒光光譜。熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)（熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)（l lex）和最大）和最大發(fā)射波

12、長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)（l lem）是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定是鑒定物質(zhì)的根據(jù)；也是定量測(cè)定最為靈敏的條件。量測(cè)定最為靈敏的條件。熒光光譜的普遍特性熒光光譜的普遍特性1.斯托克斯位移斯托克斯位移(Stokes shift): 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值；熒光發(fā)；熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)。射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光譜波長(zhǎng)。室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜室溫下菲的乙醇溶液熒光光譜2.熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān) 電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單的能量，產(chǎn)生不同吸收

13、帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，從而熒光重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，從而熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶，而且熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。與激發(fā)波長(zhǎng)無關(guān)。3.熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系熒光光譜的普遍特性熒光光譜的普遍特性激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。激發(fā)光譜與熒光光譜成對(duì)稱鏡像關(guān)系。nm200280360440520020406080100Fab4b3b2b1b0c0c1c2c3c4蒽的激發(fā)光譜（虛線）蒽的激發(fā)光譜（虛線）熒光光譜（實(shí)線）熒光光譜（實(shí)線）二、熒光與分子結(jié)構(gòu)二、熒光與分子結(jié)構(gòu)（一

14、）熒光壽命和熒光效率（一）熒光壽命和熒光效率熒熒光光壽壽命命(fluorescence lift time)：當(dāng)當(dāng)除除去去激激發(fā)發(fā)光光源源后，后，分分子子的的熒熒光光強(qiáng)強(qiáng)度度降降低低到到最最大大熒熒光光強(qiáng)強(qiáng)度度的的1/e所所需需的的時(shí)時(shí)間，間，用用表表示。示。熒光壽命：指熒光物質(zhì)被一瞬時(shí)光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光隨時(shí)間而衰減到熒光壽命：指熒光物質(zhì)被一瞬時(shí)光脈沖激發(fā)后產(chǎn)生的熒光隨時(shí)間而衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。一定程度時(shí)所用的時(shí)間。熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收

15、的光能轉(zhuǎn)變成熒光的地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率= =發(fā)射熒光的光量發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）/ /吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度），發(fā)射熒光的吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度），發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有最大

16、吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)最接近于某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)最接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波長(zhǎng)在接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波長(zhǎng)在接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。得到的熒光強(qiáng)度也最大。吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù) f熒熒光光效效率率（fluorescence efficiency):指指激激發(fā)發(fā)態(tài)態(tài)分分子子發(fā)發(fā)射射熒熒光光的的分分子子數(shù)數(shù)與與基基態(tài)態(tài)分分子子吸吸收收激激發(fā)發(fā)光光的的光光子子數(shù)數(shù)之之比，比，常常用用表表示。示。熒光效率與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和所處的化學(xué)環(huán)境熒光效率與物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和所處的化

17、學(xué)環(huán)境條件有關(guān)。條件有關(guān)。（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系（二）有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系物質(zhì)產(chǎn)生熒光必須具備的條件：物質(zhì)產(chǎn)生熒光必須具備的條件：（1）物質(zhì)的）物質(zhì)的分子必須具有能夠吸收紫外和較短分子必須具有能夠吸收紫外和較短波長(zhǎng)可見光的結(jié)構(gòu)波長(zhǎng)可見光的結(jié)構(gòu)（2）物質(zhì)）物質(zhì)必須具有較大的熒光效率必須具有較大的熒光效率1.1.長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)（芳香族化合物）長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)（芳香族化合物） 共軛度越大，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移共軛度越大，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移205nm278nm286nm321nm356nm404nm0.110.290.362.2.分子的剛性分子的剛性分子剛性越強(qiáng)，分子振動(dòng)少

18、，與其它分子碰分子剛性越強(qiáng)，分子振動(dòng)少，與其它分子碰撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，熒撞失活的機(jī)率下降，熒光量子效率提高，熒光長(zhǎng)移。光長(zhǎng)移。3.3.取代基取代基給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)；熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。給電子基團(tuán)使熒光增強(qiáng)；熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。吸電子基團(tuán)會(huì)減弱甚至破壞熒光。吸電子基團(tuán)會(huì)減弱甚至破壞熒光。同同 電子體系相互作用小的取代基對(duì)熒光影響電子體系相互作用小的取代基對(duì)熒光影響不明顯。不明顯。（三）熒光試劑（三）熒光試劑1.1.熒光胺熒光胺nm390275、 exlnmem455 lnm340 exl2.2.鄰苯二甲醛鄰苯二甲醛( (OPA) )nmem480 lnm365 exlnmem500 l

19、3.1-3.1-二甲氨基二甲氨基5 5氯化磺酰萘氯化磺酰萘4.4.測(cè)定無機(jī)離子的熒光試劑測(cè)定無機(jī)離子的熒光試劑三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素三、影響熒光強(qiáng)度的外部因素溫度增加，熒光效率和熒光強(qiáng)度下降。溫度增加，熒光效率和熒光強(qiáng)度下降。1.溫度溫度2.溶劑溶劑*躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低。發(fā)生紅移；溶劑粘度降低，熒光強(qiáng)度降低。3.酸度酸度NH3+OH-H+NH2NH-OH-H+pH 34pH 67熒光猝滅：熒光猝滅：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)溶

20、質(zhì)分子的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象稱為熒光猝滅。象稱為熒光猝滅。熒光熄滅劑：熒光熄滅劑：能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。能引起熒光強(qiáng)度降低的物質(zhì)。4.熒光熄滅劑熒光熄滅劑碰撞猝滅碰撞猝滅 M+hvM*,M*+Q M+熱熱靜態(tài)猝滅靜態(tài)猝滅 M+Q MQ 非熒光物質(zhì)非熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅 三重態(tài)三重態(tài)熒光物質(zhì)的自猝滅熒光物質(zhì)的自猝滅 熒光物質(zhì)濃度較高熒光物質(zhì)濃度較高導(dǎo)致熒光熄滅的原因：導(dǎo)致熒光熄滅的原因：熒光熄滅法熒光熄滅法: : 熒光物質(zhì)加入某些猝滅劑后，其熒熒光物質(zhì)加入某些猝滅劑后，其熒光強(qiáng)度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，光強(qiáng)度的減少與熒光猝滅劑的濃度呈線性關(guān)系，可用于

21、測(cè)定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光熄可用于測(cè)定猝滅劑的含量，這種方法稱為熒光熄滅法。滅法。5.5.散射光散射光瑞利光：瑞利光：光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；瑞利光瑞利光入射光入射光拉曼光：拉曼光：光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)光子與物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生生能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；能量交換，運(yùn)動(dòng)方向改變；拉曼光拉曼光入射光入射光320360448激發(fā)激發(fā) 320nm硫酸奎寧硫酸奎寧350448激發(fā)激發(fā) 350nm硫酸奎寧硫酸奎寧320360激發(fā)激發(fā) 320nm0.1mol/L硫酸硫酸350400激發(fā)激發(fā)

22、 350nm0.1mol/L硫酸硫酸a.強(qiáng)度強(qiáng)度b.強(qiáng)度強(qiáng)度硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光（硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光（a）與拉曼光譜（）與拉曼光譜（b）溶劑溶劑激發(fā)光激發(fā)光(nm) 248 313 365 405 436水水乙乙 醇醇環(huán)己烷環(huán)己烷CCl4CHCl3271 350 416 469 511267 344 409 459 500267 344 408 458 499 320 375 418 450 346 410 461 502在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)在不同波長(zhǎng)激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長(zhǎng)( (nm) )第二節(jié)第二節(jié) 熒光定量分析方法熒光定量分析方法一、熒光強(qiáng)度與

23、物質(zhì)濃度的關(guān)系一、熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系I0IF)(0IIKFEClII100)1 ()101 (3 . 200EClECleIKIKF)! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(! 1)3 . 2(1 (1 320 EClEClEClIKF! 3)3 . 2(! 2)3 . 2(3 . 2320EClEClEClIKKCEClIKFECl03 . 2,05. 0時(shí)當(dāng)KCF ( (熒光定量分析法的依據(jù)熒光定量分析法的依據(jù)) )結(jié)論：結(jié)論：熒光強(qiáng)度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限熒光強(qiáng)度和溶液濃度呈線性關(guān)系，只限于極稀的溶液于極稀的溶液)。對(duì)于較濃溶液，會(huì)產(chǎn)。對(duì)于較濃溶液，會(huì)產(chǎn)生自熄滅現(xiàn)象。生自熄滅現(xiàn)

24、象。二、定量分析方法二、定量分析方法 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 1.靈敏度高靈敏度高 比紫外比紫外-可見分光光度法高可見分光光度法高24個(gè)數(shù)量級(jí)；個(gè)數(shù)量級(jí)； 檢測(cè)下限：檢測(cè)下限：0.10.001 g/mL 2.選擇性強(qiáng)選擇性強(qiáng) 既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征；既可依據(jù)發(fā)射光譜特征，又可根據(jù)激發(fā)光譜特征； 3.試樣量少和方法簡(jiǎn)單試樣量少和方法簡(jiǎn)單 缺點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用范圍小應(yīng)用范圍小1.1.校正曲線法校正曲線法步驟：步驟：1.1.配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液2.2.做做F FC C關(guān)系曲線關(guān)系曲線3.3.求得濃度求得濃度注意：固定儀器和測(cè)定條件；注意：固定儀器和測(cè)定條件； 試樣濃度在線性范圍

25、內(nèi)試樣濃度在線性范圍內(nèi)2.2.比例法比例法XSXSCCFFFF 00注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)注意：樣品與標(biāo)樣溶液濃度接近，在線性范圍內(nèi)步驟：步驟：1.1.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液2.2.測(cè)測(cè)F F3.3.求濃度求濃度3.3.聯(lián)立方程式法聯(lián)立方程式法兩組分的熒光峰相互不干擾兩組分的熒光峰相互不干擾, ,可直接測(cè)定可直接測(cè)定 分別在各自的分別在各自的l l熒熒波長(zhǎng)處測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定, ,求出它們的含量求出它們的含量?jī)山M分的熒光峰相互干擾兩組分的熒光峰相互干擾, ,但激發(fā)光譜有顯著區(qū)但激發(fā)光譜有顯著區(qū) 別別, ,在某一激發(fā)光下一個(gè)組分產(chǎn)生熒光峰在某一激發(fā)光下一個(gè)組

26、分產(chǎn)生熒光峰, ,另一組分另一組分不產(chǎn)生熒光不產(chǎn)生熒光; ;選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定選用不同的激發(fā)光進(jìn)行測(cè)定如如果果兩兩組組分分的的熒熒光光光光譜譜和和激激發(fā)發(fā)光光譜譜相相互互干干擾擾利利用用熒熒光光強(qiáng)強(qiáng)度度的的加加和和性性（F F= =F F1 1+ +F F2 2+ +F F3 3+ + ），），在在適適宜宜的的熒熒光光波波長(zhǎng)長(zhǎng)處處測(cè)測(cè)定，定，用用聯(lián)聯(lián)立立方方程程來來求求解解第三節(jié)第三節(jié) 熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)熒光分光光度計(jì)和其他熒光分析技術(shù)用于測(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器有：用于測(cè)量熒光強(qiáng)度的儀器有：1.1.濾光片熒光計(jì)濾光片熒光計(jì)2.2.濾光片單色器熒光計(jì)濾光片單色器熒光計(jì)3.3.熒光

27、分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)一、熒光分光光度計(jì)一、熒光分光光度計(jì)1.1.熒光分光光度計(jì)的主要部件：熒光分光光度計(jì)的主要部件：光源、激發(fā)單色光源、激發(fā)單色器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)器、發(fā)射單色器、樣品池、檢測(cè)系統(tǒng)光源光源激發(fā)單色器激發(fā)單色器樣品池樣品池發(fā)射單色器發(fā)射單色器檢測(cè)器檢測(cè)器放大器放大器指示器指示器記錄器記錄器SK-2003A型熒光光譜儀型熒光光譜儀(國(guó)內(nèi)首創(chuàng)）國(guó)內(nèi)首創(chuàng)）RF-5400熒光光度計(jì)熒光光度計(jì)Hitachi(日立日立)F-2500熒光分光光度熒光分光光度熒光分光光度計(jì)澳大利亞熒光分光光度計(jì)澳大利亞2.2.儀器的校正儀器的校正靈敏度的校正靈敏度的校正 在選定波長(zhǎng)及狹縫寬度的條

28、件下，用一種穩(wěn)在選定波長(zhǎng)及狹縫寬度的條件下，用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的對(duì)照品對(duì)儀器定的熒光物質(zhì)，配成濃度一致的對(duì)照品對(duì)儀器進(jìn)行校正，使每次測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同進(jìn)行校正，使每次測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同數(shù)值（數(shù)值（5050或或100100）。）。 波長(zhǎng)校正波長(zhǎng)校正 汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長(zhǎng)刻度校正。汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線對(duì)單色器波長(zhǎng)刻度校正。激發(fā)光譜和熒光光譜的校正激發(fā)光譜和熒光光譜的校正1.單光束熒光光度計(jì)，可用儀器上附有的校正單光束熒光光度計(jì)，可用儀器上附有的校正裝置將每一波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致，然后裝置將每一波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度調(diào)整到一致，然后以表觀光譜上每一波長(zhǎng)的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每以表

29、觀光譜上每一波長(zhǎng)的強(qiáng)度除以檢測(cè)器對(duì)每一波長(zhǎng)的感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正。一波長(zhǎng)的感應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行校正。2.雙光束熒光光度計(jì)，可用參比光束抵消光學(xué)雙光束熒光光度計(jì)，可用參比光束抵消光學(xué)誤差。誤差。二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介二、其他熒光分析技術(shù)簡(jiǎn)介1.激光熒光分析激光熒光分析特點(diǎn)：激光作光源，一個(gè)單色器，用于分析超特點(diǎn)：激光作光源，一個(gè)單色器，用于分析超低濃度物質(zhì)。低濃度物質(zhì)。2.時(shí)間分辨熒光分析時(shí)間分辨熒光分析特點(diǎn)：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢特點(diǎn)：利用不同物質(zhì)的熒光壽命不同，在激發(fā)和檢測(cè)之間延緩的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。測(cè)之間延緩的時(shí)間不同，實(shí)現(xiàn)分別檢測(cè)的目的。3.同步熒光分析同步熒光分析特點(diǎn)

30、特點(diǎn):選擇適宜的選擇適宜的, ,同時(shí)掃描激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射同時(shí)掃描激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，得到同步熒光光譜；減少光譜重疊，提高波長(zhǎng)，得到同步熒光光譜；減少光譜重疊，提高分辨率；用于定量分析。分辨率；用于定量分析。4.4.膠束增敏熒光分析膠束增敏熒光分析特點(diǎn)：采用化學(xué)方法提高熒光效率；膠束溶特點(diǎn)：采用化學(xué)方法提高熒光效率；膠束溶液對(duì)熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用。液對(duì)熒光物質(zhì)有增溶、增敏和增穩(wěn)的作用。無機(jī)物的熒光分析無機(jī)物的熒光分析很多金屬或非金屬無機(jī)離子與一些有機(jī)化合物形成很多金屬或非金屬無機(jī)離子與一些有機(jī)化合物形成有熒光的配合物，測(cè)定熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定量分析。有熒光的配合物，測(cè)定熒光強(qiáng)度可以進(jìn)行定

31、量分析。常用的試劑：常用的試劑：1. 8羥基喹啉及其衍生物：羥基喹啉及其衍生物：用于用于Al、Ga、In、Sc、La、Mg、Zn、Cd等元素的熒光測(cè)定。等元素的熒光測(cè)定。2.2.黃酮類試劑：黃酮類試劑：桑色素、黃烷醇、槲皮素桑色素、黃烷醇、槲皮素用于用于、族元素的熒光測(cè)定族元素的熒光測(cè)定3.3.二氨基化合物：二氨基化合物：用于測(cè)定用于測(cè)定SeAl的測(cè)定方法：的測(cè)定方法：將大約將大約40 mL不含硝酸根的弱酸性試液，加入不含硝酸根的弱酸性試液，加入10mL 8羥基喹啉溶液振蕩羥基喹啉溶液振蕩2min，加入氨水調(diào)節(jié)，加入氨水調(diào)節(jié)到到pH811，再用力振蕩，再用力振蕩30s，水相以每次，水相以每次4

32、mL氯氯仿洗滌二次。合并萃取液并以氯仿稀釋至仿洗滌二次。合并萃取液并以氯仿稀釋至20mL, ,再加入再加入Na2SO4。然后在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定，。然后在熒光分光光度計(jì)上測(cè)定，激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)365nm、發(fā)射波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)560nm。有機(jī)物的熒光分析有機(jī)物的熒光分析芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在紫外光照芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的有機(jī)化合物在紫外光照射下大多數(shù)能產(chǎn)生熒光，某些弱熒光物質(zhì)可與熒光射下大多數(shù)能產(chǎn)生熒光，某些弱熒光物質(zhì)可與熒光劑作用生成強(qiáng)熒光物質(zhì)。劑作用生成強(qiáng)熒光物質(zhì)。1.1.油脂苯并（油脂苯并（a a）芘測(cè)定：）芘測(cè)定：油樣經(jīng)提取、濃縮、純化后進(jìn)行熒光測(cè)定，油樣經(jīng)提取、濃縮、純化后

33、進(jìn)行熒光測(cè)定，l lex 386nm、l lem406nm。2.2.尿中尿中N N1 1甲基尼克酰胺的測(cè)定：甲基尼克酰胺的測(cè)定：尿液經(jīng)純化、堿處理和酮縮合成為帶有黃色熒光的尿液經(jīng)純化、堿處理和酮縮合成為帶有黃色熒光的衍生物，在酸性溶液中加熱變成穩(wěn)定而產(chǎn)生強(qiáng)藍(lán)色衍生物，在酸性溶液中加熱變成穩(wěn)定而產(chǎn)生強(qiáng)藍(lán)色熒光的物質(zhì)熒光的物質(zhì), ,l lex 355nm、l lem430nm 。 3.1-2-3.1-2-甲氨基甲氨基5 5氯化磺酰萘氯化磺酰萘(Dansyl-Cl ,DNS-ce 丹酰氯）用于氨基酸的熒光測(cè)定：丹酰氯）用于氨基酸的熒光測(cè)定：DNS-Cl是一種熒光試劑，是一種熒光試劑，DNS-C1能與

34、所有的氨能與所有的氨基酸生成具熒光的衍生物，在堿性條件下與氨基基酸生成具熒光的衍生物，在堿性條件下與氨基酸酸( (肽或蛋白質(zhì)肽或蛋白質(zhì)) )的氨基結(jié)合成帶有熒光的的氨基結(jié)合成帶有熒光的DNS- -氨基酸氨基酸( (DNS- -肽或肽或DNS- -蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)) ) ，DNS- -氨基酸氨基酸在紫外光照射下呈現(xiàn)黃色熒光在紫外光照射下呈現(xiàn)黃色熒光 。核酸分子熒光探針核酸分子熒光探針遺傳物質(zhì)的脫氧核糖酸遺傳物質(zhì)的脫氧核糖酸 (DNA), 自身的熒光效率很低，自身的熒光效率很低，一般條件下幾乎檢測(cè)不到一般條件下幾乎檢測(cè)不到DNA的熒光，因此，常選用的熒光，因此，常選用某些某些熒光分子作為探針熒光分子作

35、為探針，通過探針標(biāo)記分子的熒光變，通過探針標(biāo)記分子的熒光變化來研究化來研究 DNA 與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探與小分子及藥物的作用機(jī)理，從而探討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新的高效低毒藥物。目前討致病原因及篩選和設(shè)計(jì)新的高效低毒藥物。目前, ,典典型的熒光探針分子為溴化乙錠，此外也使用釘?shù)呐浜闲偷臒晒馓结樂肿訛殇寤义V，此外也使用釘?shù)呐浜衔锏?。在基因檢測(cè)方面，已逐步使用物等。在基因檢測(cè)方面，已逐步使用熒光染料熒光染料作為標(biāo)作為標(biāo)記物來代替同位素標(biāo)記，從而克服了同位素標(biāo)記物產(chǎn)記物來代替同位素標(biāo)記，從而克服了同位素標(biāo)記物產(chǎn)生的污染生的污染, ,價(jià)格昂貴及難保存等的不足。價(jià)格昂貴及難保存等的不足。DNA序列分析中的熒光染料：序列分析中的熒光染料：在電泳分離熒光法在電泳分離熒光法檢測(cè)檢測(cè)DNA序列分析中，通常分四組（序列分析中，通常分四組（A,C,G,T體體系）進(jìn)行，如果用四種不同的熒光染料為探針系）進(jìn)行，如果用四種不同的熒光染料為探針, ,標(biāo)標(biāo)記一個(gè)共同的引物，分別用在記