銀杏葉黃素的提取及紫外光譜表征

1、浙江農(nóng)林大學(xué)開放性實驗論文 項目名稱 銀杏葉黃素的提取及紫外光譜表征學(xué)院班級 理學(xué)院 姓名 王卉殊 學(xué)期 2012-2013年第一學(xué)期 銀杏葉黃素的提取及紫外光譜表征 班級:應(yīng)用化學(xué)112班 姓名：王卉殊摘要：本實驗用乙醇提取，通過氧化鋁柱層析，用正己烷洗脫，得到的葉黃素。即可除去銀杏葉中大量的醇溶性雜質(zhì)，又可得到了純凈的葉黃素。將葉黃素用紫外分光光度計表征，確定其最大吸收波長。關(guān)鍵詞：銀杏葉，葉黃素，提取，柱層析，紫外分光光度計1 文獻綜述1.1 銀杏葉的概述銀杏葉（Ginkgo Leaf）是近年來國內(nèi)外藥物開發(fā)和研究的熱點之一，其脂溶性提取物主要成分為黃酮和內(nèi)酯類化合物，已被廣泛應(yīng)用于心腦

2、血管疾病的治療。銀杏葉，性味苦甘澀平，內(nèi)含雙黃酮，經(jīng)實驗和臨床證明，它具有降低血清膽固醇、擴張冠狀動脈的作用，對于冠心病、高血壓有一定的輔助治療作用.1葉黃素是一種無維生素A 活性的類胡蘿卜素，屬純天然色素，無毒副作用，不溶于水，溶于油脂、乙醇等。葉黃素有八種異構(gòu)體，以全反式為主，一般從植物中提取。葉黃素廣泛存在于蔬菜、花卉、水果與某些藻類生物中，屬于“類胡蘿卜素”族物質(zhì)，而類胡蘿卜素是國際公認的具有防病抗病生理功能的天然物質(zhì)，其主要功能是單線態(tài)氧的有效淬滅劑，能消除羥自由基，是脂類過氧化反應(yīng)的斷鏈抗氧化劑，在細胞和細胞膜中和脂類結(jié)合而有效的抑制脂類的氧化，對于人體疾病的預(yù)防發(fā)揮重要的作用。開

3、發(fā)利用銀杏葉黃素對于豐富葉黃素來源，提高銀杏葉的價值具有重大意義。1抗氧化劑是一種在植物中廣泛存在的化學(xué)物質(zhì)，能夠和體內(nèi)的自由基廣泛結(jié)合，發(fā)揮抗氧化作用。自由基可以提高機體的氧化作用，殺死體內(nèi)的有害菌并產(chǎn)生能量，但過量的自由基將損害細胞，危害健康。隨著對抗氧化劑研究的不斷深入，人們認識到不同的抗氧化劑在體內(nèi)執(zhí)行不同的生物學(xué)功能。葉黃素（Xanthophylls）是一種性能優(yōu)異的抗氧化劑，是構(gòu)成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要組分之一，葉黃素在甘藍、羽衣甘藍、菠菜等深綠色葉菜以及金盞花、萬壽菊等花卉中含量最高。在南瓜、桃子、辣椒、芒果、柑橘、蛋黃中則含豐富的葉黃素前體葉黃素酯。人類的眼睛黃

4、斑區(qū)含有高濃度的葉黃素，是構(gòu)成人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域的主要色素2，但在人體內(nèi)無法制造，必須靠含葉黃素的食物來補充，若嚴重缺乏這種色素，眼睛就會失明。 1.2 葉黃素化合物的研究進展國外對葉黃素的研究已有10 多年的歷史, 在開發(fā)應(yīng)用葉黃素方面, 美國Kem in 公司、瑞士Roche 公司處于研究的前沿。除了美國和瑞士的公司外, 日本和德國的一些公司也均有葉黃素及其保健產(chǎn)品的研究與生產(chǎn)。在國際市場上, 含葉黃素的保健食品和營養(yǎng)補充劑的價格約為35 45 美元ö瓶, 其中50 粒(膠囊)ö瓶, 20mgö粒(膠囊) , 葉黃素產(chǎn)品的利潤空間十分豐厚3。近幾年, 國內(nèi)的青

5、島大學(xué)天然產(chǎn)物研究所、北京大學(xué)、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等單位均開展了葉黃素研究工作。廣州市范樂醫(yī)藥科技有限公司與瑞士Roche 公司合作生產(chǎn)的以葉黃素為主要有效成分的維視保軟膠囊已經(jīng)面世。但是, 與國外的研究進展相比, 國內(nèi)的研究與生產(chǎn)水平還有一定差距。開發(fā)和研制高純度葉黃素, 研究其穩(wěn)定劑型, 拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域, 使其產(chǎn)業(yè)化, 將是我國研究人員今后的一項重要工作。1.3 葉黃素化合物的提取方法分離及提取 (1)、膜分離技術(shù)。 用陶瓷膜微濾(MF)對浸提液進行精濾提純，再用反滲透膜(R0)濃縮過濾液。這種工藝以膜分離技術(shù)為主體，替代了傳統(tǒng)的酒精提純和蒸發(fā)濃縮，工藝過程簡單、色素溶液基本處于常溫操作狀態(tài)，既

6、節(jié)約能源，又保證了色素產(chǎn)品的質(zhì)量。 (2)、干燥法提取葉黃素。 研究出一種新型轉(zhuǎn)筒式干燥機，用來干燥和捶擊金盞花或者萬壽菊花瓣，可以從中提取葉黃素。當(dāng)捶擊比率不同時，捶擊效率就在70%90%之間波動。葉黃素的多少決定于干燥時間長度。但在相同的干燥時間里，70下干燥提取的葉黃素含量比60下提取的葉黃素含量要少。 (3)、高效液相色譜分析法提取。 以二氯甲烷(22.5mL)+乙腈(9.5mL)+甲醇(67.5mL)+水(0.5mL)為流動相，流量為1.0mL/min。使用光度檢測器(波長為450nm)檢測分離后的類胡蘿卜素和葉綠素。樣品進樣體積為20L。在此條件下，葉黃素、葉綠素b、葉綠素a、番茄

7、紅素(lycopene)、-胡蘿卜素和-胡蘿卜素的保留時間分別為3.0、4.9、6.6、12.1、14.6和15.3min。取螺旋藻的培養(yǎng)液(通過測定光密度(560nm)得出培養(yǎng)液中螺旋藻干重于離心管中，離心后棄去溶液，加水洗滌后，加入2mL體積分數(shù)為90%丙酮水溶液，置于超聲波發(fā)生器水浴上，使螺旋藻破碎。離心后取上層提取液用高效液相色譜法測定葉黃素/玉米黃質(zhì)、-胡蘿卜素及葉綠素a的含量，其最高含量分別為：1.65g/mg，2.15g/mg和21.4g/mg。 (4)、改良的高效色譜分析法。 采用美國Waters公司的680型自動程序梯度控制器，501型高壓液相泵，M-490型可編程序紫外可見

8、光檢測器，730型數(shù)據(jù)處理器，記錄保留時間和峰面積，走紙速度為2cm/min。選擇最佳的色譜分離條件是色譜分析中的關(guān)鍵，本方法選用兩種流動相A液和B液，采用線性梯度洗脫分離色素組分。用改良的高效色譜分析法分析葉黃素循環(huán)組分，具有快速、準(zhǔn)確、分離度好以及重復(fù)穩(wěn)定等優(yōu)點。 （5）、玉米黃漿水中提取玉米黃色素。 選用己烷質(zhì)量分數(shù)高達74%80%的抽提溶劑油，根據(jù)液一固萃取原理，通過液固二相存在濃度差時的分子擴散作用，利用泵循環(huán)施以外力時的對流擴散作用，達到色素浸出的目的。再通過真空濃縮精制獲得液態(tài)色素產(chǎn)品，或者添加輔料獲得固態(tài)色素產(chǎn)品。 （6）、大豆中葉黃素的解析。 在酸和堿性稻殼灰中大豆油色素(葉

9、黃素)解析時，連續(xù)的異丙醇/己烷的洗滌，增加溶液極性可提高葉黃素的解析，表明競爭吸附很大程度上決定于溶液的極性。但是當(dāng)加入2%異丙醇洗滌時，用多種提取法解析出來的葉黃素會減少。葉黃素吸附的量越多必然伴隨著更多的葉黃素的解析。這說明酸性環(huán)境比堿性環(huán)境更有利于解析。 7、葉黃素產(chǎn)品生產(chǎn)工藝。 以萬壽菊花中用正己烷萃取而得的葉黃素為例： 皂化時氫氧化鈉水溶液w(NaOH)=0.17。 萬壽菊(Marigold)是提煉葉黃素及類胡蘿卜素的主要原料，其中黃色色素含量平均每公斤不低于12克，這種色素是無公害的天然色素。1.4 葉黃素化合物的藥理作用葉黃素是一種重要的抗氧化劑，為類胡蘿卜素家族（一組植物中發(fā)

10、現(xiàn)的天然的脂溶性色素）的一員，又名“植物黃體素”，在自然界中與玉米黃素共同存在。 （1）視網(wǎng)膜的主要色素成分：葉黃素與玉米黃素構(gòu)成了蔬菜、水果、花卉等植物色素的主要組分，也是人眼視網(wǎng)膜黃斑區(qū)域*的主要色素。人類的眼睛含有高量的葉黃素，這種元素是人體無法制造的，必須靠攝入葉黃素來補充，若缺乏這種元素，眼睛就會失明。 （2）保護眼睛不受光線損害，延緩眼睛的老化及防止病變：太陽光中的紫外線及藍光進入眼睛會產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致白內(nèi)障，黃斑區(qū)退化，甚至癌癥。紫外線一般能被眼角膜及晶狀體過濾掉，但藍光卻可穿透眼球直達視網(wǎng)膜及黃斑，黃斑中的葉黃素則能過濾掉藍光，避免藍光對眼睛的損害。黃斑區(qū)的脂肪外層特別容易

11、受到太陽光的氧化傷害，因此這個區(qū)域極易發(fā)生退化。 （3）抗氧化，有助于預(yù)防機體衰老引發(fā)的心血管硬化、冠心病和腫瘤疾病F. Granado 等人研究了含有葉黃素的降糖藥物對I 型糖尿病患的療效, 患者服藥21 天后, 利用HPLC 考察了葉黃素的生物降解率。研究表明, 葉黃素對I 型糖尿病患者可以有效地降低血糖,并且還有擴張血管的作用。另有研究表明, 易被人體胃與小腸吸收的葉黃素, 因其具有抗氧化性, 能通過免疫調(diào)節(jié)使細胞間通訊而發(fā)揮其抗癌作用。除此之外, 葉黃素還有防止由細胞衰老及機體衰老引發(fā)的冠心病, 心血管硬化等疾病, 從而提高人體免疫力。 （4）保護視力：葉黃素作為抗氧化劑和光保護作用，

12、可促進視網(wǎng)膜細胞中視紫質(zhì)（Rhodopsin）的再生成，可預(yù)防重度近視及視網(wǎng)膜剝離，并可增進視力、保護視力。特別適合學(xué)生、司機等人食用。 （5）緩解視疲勞癥狀；(視物模糊、眼干澀、眼脹、眼痛、畏光等) （6）提高黃斑色素密度，保護黃斑，促進黃斑發(fā)育； （7）預(yù)防黃斑變性及視網(wǎng)膜色素變性； （8）減少玻璃膜疣的產(chǎn)生，預(yù)防AMD的發(fā)生，AMD是一種老年眼科退化性疾病，特別在歐美。一般容易發(fā)生在4JO歲以上人群。其發(fā)病因素，據(jù)褐斑病變團體調(diào)查分析，除了年齡和遺傳因素外，和食物中抗氧化劑的攝入量、太陽光刺激、吸煙、性別等均有關(guān)系。而葉黃素和玉米黃素，是眼斑點色素的重要構(gòu)成，存在于色斑的中間，它的功能，

13、好像是太陽高能藍光的過濾器，從而保護了眼部的視網(wǎng)膜的被損害；同時又是視網(wǎng)膜的抗氧化劑，以保護眼球細胞的被氧化損傷。由于葉黃素不能為人體自身合成，只能從食物中攝取，因此注意經(jīng)常補充葉黃素類食物，對防治AMD十分重要。2 實驗部分2.1 目的要求2.1.1.用乙醇提取后，再通過氧化鋁柱層析，經(jīng)過正己烷洗脫得到純品葉黃素。2.1.2.并用紫外光譜掃描得到紫外光譜圖以確定葉黃素。2.1.3.通過用乙醇提取葉黃素的實驗，要求掌握天然產(chǎn)物提取的基本操作技能2.1.4通過紫外吸收光譜表征葉黃素的最大吸收，要求理解紫外吸收光譜用途。2.2 實驗原理葉黃素(3, 3-二羥基-胡蘿卜素) 是一種萜，為胡蘿卜素的氧

14、化物，又名“植物黃體素”3，分子式：C40H56O2，分子量：568.854，熔點為190 。葉黃素的極性很小不溶于水，而溶于某些有機溶劑，如氯仿、二氯甲烷、正己烷等，呈黃色。它具有3個手性中心、故有8種立體異構(gòu)體，葉黃素分子有一條含40個碳原子的長鏈，其中有多個共軛雙鍵，正是這些共軛雙鍵使葉黃素具有鮮明的顏色和抑制自由基的能力2。葉黃素結(jié)構(gòu)如下： 葉黃素的結(jié)構(gòu)L-葉黃素通過類異戊二烯化合物或萜類化合物途徑合成5。葉黃素的極性較小，但分子中有羥基，可溶于乙醇，又可溶于正己烷，故用乙醇提取，再用正己烷洗脫，即可有效的除去雜質(zhì)，又可得到純品的葉黃素。美國國家健康協(xié)會眼科協(xié)會（NEI，The Nat

15、ional Eye Institute of the National Institutes of Health）已經(jīng)證明，食用類胡蘿卜素豐富的食品和降低老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)之間有明顯的聯(lián)系6。雖然，L-葉黃素的作用并不明確，但人們推測，L-葉黃素通過吸收藍光，淬滅在光敏反應(yīng)中產(chǎn)生的反應(yīng)氧，進而避免了光線對感光細胞層的損害7。1994年，科學(xué)家研究了900位成年人的飲食習(xí)慣，目的就是發(fā)現(xiàn)ARMD和類胡蘿卜素、維生素A, C及E的關(guān)系8。受試者中有幾百人已經(jīng)患有AMD，而對照組不患此病。結(jié)果表明，攝入高劑量類胡蘿卜素的人群患A

16、MD的機率比攝入低劑量的人群要低43%。研究者發(fā)現(xiàn)菠菜和羽衣甘藍作用（含有大量L-葉黃素）的保護尤其明顯，他們確信，L-葉黃素和玉米黃質(zhì)是降低AMD發(fā)病率的最基本物質(zhì)。近些年來，我國也發(fā)明了葉黃素的新型提取工藝如高速逆流色譜法從萬壽菊花粗提物中分離制備出高純度單體L-葉黃素的方法9和從植物中提取L-葉黃素的方法10等，解決了L-葉黃素精加工問題，使L-葉黃素提取純度達到98，使L-葉黃素產(chǎn)品在國內(nèi)進行深度開發(fā)成為一種可能。每天使用100g 處理經(jīng)UV-B照射的皮膚，發(fā)現(xiàn)皮膚的表皮層厚度增生減少了52，UV-B誘導(dǎo)表皮細胞的過度增生，這是UV-B皮炎的標(biāo)志。研究還發(fā)現(xiàn)，吸煙者血漿、BMC及皮膚中

17、的類胡蘿卜素的濃度遠遠低于非吸煙者的水平11。2.3 材料與儀器2.3.1 材料來源原料來自于校園內(nèi)，以秋、冬落地銀杏葉2.3.2 使用儀器和藥品儀器： 常規(guī)的玻璃儀器、電熱套、UV 2550紫外分光光度計 藥品： 乙醇、正己烷、氧化鋁2.4 葉黃素的提取與分離2.4.1. 提?。喝?0g黃色鮮銀杏葉，用剪刀剪細，加入200ml 95%乙醇浸泡2小時，過濾，濾渣用95%乙醇再提取一次，普通蒸餾回收溶劑，得到膏狀濃縮物為葉黃素的粗產(chǎn)品。2.4.2. 裝柱：填裝好色譜柱是柱色譜成功的關(guān)鍵，色譜柱要填的平整，中間沒有氣泡和空隙。將色譜柱固定在鐵架上，柱身要和桌面垂直，（這樣可形成較平整的柱面）將25

18、ml 95%乙醇倒入層析柱內(nèi)，使溶劑流出的同時將稱好的20g氧化鋁通過干燥的小玻璃漏斗慢慢加入層析柱中而漸漸下沉，邊加邊用帶橡皮管的玻璃輕輕敲打柱身，以排除空氣，使填裝均勻而無裂縫，加完氧化鋁后，繼續(xù)讓溶劑流出，直到液面在氧化鋁的頂部為0.51cm高度時，關(guān)閉下端活塞。在氧化鋁表面上用圓形濾紙覆蓋，以保持頂部平整，不受所加溶劑的干擾而產(chǎn)生不規(guī)則的色帶。2.4.3. 加樣：待色譜柱中液面離氧化鋁表面約1 mm時，加入2ml 濃縮液（活塞打開），當(dāng)樣品液面離氧化鋁頂部約1mm時，用少量的正己烷洗滌柱壁上的樣品物質(zhì)，洗凈為止（液體為無色）。2.4.4. 洗脫分離：在柱子內(nèi)加入正己烷溶劑（溶劑高度約1

19、2cm）層析開始進行，柱下用小燒杯接收流出液，待黃色液體流出時，用干凈干燥的錐形瓶接收得約2030ml 即可，得到純?nèi)~黃素。2.4.5 實驗結(jié)果：（產(chǎn)品外觀）純品葉黃素為黃色粉末狀，由于能溶于正己烷溶劑中，故我們得到的是用正己烷洗脫的黃色溶解液。2.5. 紫外光譜表征 將洗脫得到的溶液進行紫外可見分光光度計掃描，正己烷溶液中葉黃素的最大吸收波長為 444.00。3. 結(jié)果與討論用95%乙醇提取得到的葉黃素粗品，再經(jīng)濃縮后得到粘性的膏狀物，是因為許多親脂性和親水性的成分都均可用于乙醇中，故而得到的成分較為復(fù)雜，混合物成粘性的膏狀物，由于葉黃素為親脂性成分，在正己烷中溶解度大，因此采用氧化鋁層析柱

20、分離，使某些雜質(zhì)被氧化鋁所吸附，用正己烷為洗脫液將葉黃素洗脫下來，除去雜質(zhì)，得到純品葉黃素。通過乙醇提取，氧化鋁層析柱的分離可達到良好的純化效果，所以此方法是可行的。葉黃素產(chǎn)品可用于保健品及藥品應(yīng)用。4. 實驗后感想這次的實驗讓我覺得很有意義，步驟都貼近生活。我們可以從中學(xué)到的知識與難度成正比,使我受益匪淺。校園里的銀杏樹下都是落葉，但是并不是所有的葉子都可以，必須是全部變黃的銀杏葉。這樣提取的銀杏葉才能提取出叫純正的葉黃素。在處理銀杏葉時，大家人手一把剪刀，將黃色的葉子剪得很碎，是溶液與葉子充分接觸。做實驗的時候老師也一直陪在我們的身邊，方便講解和交流。讓我們的使用做得很成功。經(jīng)過這次的實驗

21、，我們整體對各個方面都得到了不少的提高，例如團隊精神、交流能力、獨立思考、信息的捕獲能力等；提高了自己動手能力，培養(yǎng)理論聯(lián)系實際的作風(fēng)，增強創(chuàng)新意識。希望下次的實驗?zāi)茏龅酶?，能夠讓我們得到更好的鍛煉。參考文獻1 于曉麗. 葉黃素產(chǎn)品研究J. 內(nèi)蒙古石油化工, 2005(5):2-3.2Yeum KJ, Taylor A, Tang G, Russell RM. Measurement of carotenoids, retinoids, and tocopherols in human lenses. Invest Ophthalmol Vis Sci , 1995, 36: 2756276

22、1.3 Annette L，Tobias G，Guangwen TBioavailability of lutein in humans from intrinsically labeled vegetable determined by LC-APCI-MS JJournal of Nutritional Biochemistry, 2003， 14(11):663-6704惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)M . 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2005, (1) : 248 258.5 陶俊, 張上隆，徐昌杰，安新民，張良誠. 類胡蘿卜素合成的相關(guān)基因及其基因工程.  生物工程學(xué)報, 2002, 18(3):276-281.6 Bone RA, Landrum JT, Guerra LH, Ruiz CA. Lutein and zeaxanthin dietary supplements raise macular pigment density