動物肝臟DNA提取和鑒定-實驗技術(shù)

1、甘肅中醫(yī)藥大學核酸的分類核酸的分類l DNA (DNA (脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸) ) 主要存在于細胞核的染色體中。主要存在于細胞核的染色體中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如線粒體，如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠），葉綠體體DNADNA（cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。l RNARNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于細胞質(zhì)中，如存在于細胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，還有非細胞形式存在的病毒和噬還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含菌體，其

2、或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)l在細胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復合物形式存在在細胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復合物形式存在l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度較小的粘度較小l在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來l 濃鹽法：濃鹽法：利用利用RNA和和DNA在不同鹽濃度溶液中的溶解在不同鹽濃度溶液中的溶解度不同

3、將二者分離。度不同將二者分離。l離子去污劑法：離子去污劑法：利用利用SDS、CTAB（十六烷基三甲基溴（十六烷基三甲基溴化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取化銨）等去污劑使蛋白質(zhì)變性，直接從生物材料中提取DNA。l 苯酚抽提法：苯酚抽提法：苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制苯酚既是蛋白變性劑，又能抑制DNase的降解。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與的降解。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA連接鍵連接鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。溶于水相。基因組基因組DNA

4、的提取方法的提取方法 核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用：去垢劑的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂； 2 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；來； 3 3對對RNase、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1

5、.5-1.5-二磺二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉 作用：作用： 1. 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細胞的作活性和破裂細胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白質(zhì)：降解蛋白質(zhì)

6、 溶菌酶溶菌酶：破碎細胞：破碎細胞 核酸提取的主要步驟核酸提取的主要步驟l沉淀核酸，去除鹽類，沉淀核酸，去除鹽類，有機溶劑等雜質(zhì)有機溶劑等雜質(zhì)l除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、除去與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子：酚脂類等生物大分子：酚/氯仿抽提、氯仿抽提、蛋白變性劑（蛋白變性劑（SDS、異硫氰酸胍、異硫氰酸胍等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌等）、蛋白酶處理、高鹽洗滌l除去其它不需要除去其它不需要的核酸分子的核酸分子l破碎細胞：研磨、組織勻漿、破碎細胞：研磨、組織勻漿、超聲、凍融；異硫氰酸胍、超聲、凍融；異硫氰酸胍、堿裂解；酶解（溶菌酶）堿裂解；酶解（溶菌酶）注意事項注意事項l加入加入R

7、NA降降解酶除解酶除RNAl加入加入DNA酶酶抑制劑：檸抑制劑：檸檬酸、氰化檬酸、氰化物、砷酸鹽、物、砷酸鹽、EDTA、SDS、苯酚、苯酚等等l蛋白變性劑反應(yīng)蛋白變性劑反應(yīng)不宜過于劇烈不宜過于劇烈l 避免過酸、避免過酸、過堿及高溫過堿及高溫一、實驗?zāi)康模阂?、實驗?zāi)康模?1、學習并掌握用濃鹽法從動物組織中的提取DNA方法及其原理。 2、學習和掌握二苯胺法測定DNA的原理和方法。二、實驗原理二、實驗原理l溶于高鹽溶液（溶于高鹽溶液（1mol/L）, 微溶于低鹽溶液（微溶于低鹽溶液（0.14mol/L）l溶于低鹽溶液（溶于低鹽溶液（0.14mol/L） 微溶于高鹽溶液（微溶于高鹽溶液（1mol/L）

8、p 核酸含量的測定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針核酸含量的測定方法：紫外吸收法、定磷法和分別針對對DNA和和RNA的顏色反應(yīng)方法。的顏色反應(yīng)方法。p 脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在脫氧核糖核酸中的脫氧核糖在酸性環(huán)境酸性環(huán)境中變成中變成-羥基羥基-酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色化合物，在酮基戊醛與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍色化合物，在595nm處有最大的吸收處有最大的吸收 。p DNA20400微克范圍內(nèi)，光密度與微克范圍內(nèi)，光密度與DNA的濃度成正比，的濃度成正比，在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)的靈敏度。 三、實驗試劑三、實驗試劑l95%冷

9、冷乙醇、乙醇、NaCl固固體體l二苯胺：二苯胺：稱取純稱取純二苯胺二苯胺1g溶于溶于100ml冰冰醋酸中，醋酸中，加入加入10ml過過氯酸，氯酸，混勻?；靹?。臨用時臨用時加加1ml1.6%乙醛乙醛溶液，溶液，所配置所配置試劑應(yīng)試劑應(yīng)為無色。為無色。l0.14molL NaCl0.05molL 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液(PH=6.8)lDNA標準液標準液200ug/ml:DNA鈉鈉鹽用鹽用5mmol/L的的NaOH配制。配制。l氯仿氯仿/異戊醇異戊醇=20：1（V/V）l5% SDS組織搗碎勻漿機組織搗碎勻漿機豬肝豬肝8g勻勻 漿漿16ml的的 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液離心，離心，400

10、0r/min ,10min上清（棄掉）上清（棄掉）沉淀沉淀沉淀沉淀25ml緩沖液洗滌緩沖液洗滌離心，離心，4000r/min ,20min上清（棄掉）上清（棄掉）40ml的的 檸檬酸鈉緩沖液檸檬酸鈉緩沖液沉淀沉淀21ml氯仿氯仿/異戊醇異戊醇4ml 5% SDS振蕩振蕩 30 min（保鮮膜封口）（保鮮膜封口）加入加入3.6gNaCl 固體，固體，終濃度為終濃度為1mol/L離心，離心，3500r/min ,20min吸取上清（量取體積）吸取上清（量取體積）95%冷乙醇（緩慢加入）邊冷乙醇（緩慢加入）邊加邊朝一個方向緩慢攪動加邊朝一個方向緩慢攪動DNA粗制品粗制品除去蛋白質(zhì)的方法除去蛋白質(zhì)的方

11、法 lSDS（十二（十二烷基硫烷基硫酸鈉）酸鈉）等去污等去污劑使蛋劑使蛋白質(zhì)變白質(zhì)變性，可性，可以直接以直接從生物從生物材料中材料中提取提取DNAl防止防止DNA酶酶的降解，的降解，提取時提取時可加入可加入適量適量EDTA（乙二（乙二胺四乙胺四乙酸）、酸）、檸檬酸，檸檬酸，以降低以降低DNA酶酶的活性的活性l氯仿一氯仿一異成醇異成醇使蛋白使蛋白質(zhì)變性，質(zhì)變性，離心除離心除去變性去變性蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)DNA的定量測定的定量測定lDNA粗品用粗品用5mmol/LNaOH溶解并定容至溶解并定容至50ml，作為待測品。，作為待測品。l 混勻，混勻，60水浴保溫水浴保溫45min，冷卻后，冷卻后，595nm處，比色。處，比色。l以吸光度以吸光度A595nm對對DNA含量（含量（ug）作圖，）作圖， 繪制標準曲線。繪制標準曲線。l從標準曲線上查出樣品的從標準曲線上查出樣品的DNA含量。含量。l計算計算100g豬肝中豬肝中DNA的含量：的含量： 待測樣品中待測樣品中DNA的質(zhì)量的質(zhì)量25(稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)) 稱取豬肝的質(zhì)量稱取豬肝的質(zhì)量=l 勻漿（破碎細胞）要充分，需剪成小塊。勻漿（破碎細胞）要充分，需剪成小塊。l固體固體NaCl應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，應(yīng)磨碎，加入應(yīng)分批緩慢加入，邊加邊搖，避免局部濃度過大或者未及溶解而沉入氯仿層