馬兜鈴酸體內(nèi)檢測(cè)方法及代謝轉(zhuǎn)化研究

1、馬兜鈴酸體內(nèi)檢測(cè)方法及代謝轉(zhuǎn)化研究項(xiàng)目完成單位：國(guó)家藥物及代謝產(chǎn)物分析研究中心項(xiàng)目完成人： 李亞偉摘 要 建立了簡(jiǎn)單、靈敏的高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的方法。馬兜鈴酸I和內(nèi)標(biāo)吲哚美辛經(jīng)乙酸乙酯液-液萃取后，用HPLC法進(jìn)行分析。色譜柱為YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明大鼠口服馬兜鈴酸I后吸收很快，消除較慢，藥-時(shí)曲線消除相存在有多峰現(xiàn)象，按非房室模型計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。并且在血漿中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能

2、的馬兜鈴酸I代謝產(chǎn)物。我們采用正、負(fù)離子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多種質(zhì)譜分析方法對(duì)馬兜鈴酸I及其代謝物進(jìn)行了探索研究，但是由于馬兜鈴酸I離子化困難，離子化效率低，未得到理想的結(jié)果。然后我們通過(guò)往流動(dòng)相中加入醋酸銨以及改變多種流動(dòng)相體系等措施使馬兜鈴酸的離子化效率有所改善，從而分析研究了馬兜鈴酸的M+NH4+離子在LC-MS/MS譜上的裂解方式，并檢測(cè)到可能是馬兜鈴內(nèi)酰胺Ia的硫酸結(jié)合型II相代謝產(chǎn)物。但是本質(zhì)譜分析方法還有待于進(jìn)一步的改進(jìn)。一、 研究背景近年來(lái)，歐洲學(xué)者報(bào)道了一系列含有馬兜鈴酸（Aristolochic acid, AA）的中草藥導(dǎo)致腎損傷的病例，并將此稱為“中草

3、藥腎病”。目前，這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，從而開(kāi)始對(duì)AA所致腎損傷的臨床表現(xiàn)及病理機(jī)制進(jìn)行深入的研究。AA是馬兜鈴屬植物中的主要成分，該屬植物分布廣泛，在我國(guó)有40多種，其中有些是常用中藥，如馬兜鈴、關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、尋骨風(fēng)等。在一些減肥中藥中，由于使用了含有AA的馬兜鈴屬植物，特別是誤將關(guān)木通、廣防己用作為有利尿作用的木通，從而造成使用者腎臟功能損害，其臨床表現(xiàn)是貧血和高血壓，腎功能呈“亞急性”或“快速進(jìn)展性”的不可逆損傷，停藥后仍不能逆轉(zhuǎn)，往往在數(shù)月或12年內(nèi)發(fā)展為終末期腎病，嚴(yán)重者可致腎功能衰竭。醫(yī)生建議在使用一些含有AA的中草藥時(shí)應(yīng)特別慎重，嚴(yán)防腎損傷的發(fā)生。

4、目前有關(guān)AA引起腎損傷的機(jī)制尚不十分清楚，它在人體內(nèi)的吸收、分布、代謝及消除過(guò)程也未被充分闡明3。因此，研究AA的體內(nèi)檢測(cè)方法，了解其體內(nèi)過(guò)程及藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，將有助于深入研究其毒理機(jī)制，從而為其毒副作用的防治提供理論依據(jù)。另一方面，若能對(duì)患者體內(nèi)的AA水平進(jìn)行有效而準(zhǔn)確的監(jiān)測(cè)，則有可能對(duì)毒副反應(yīng)的發(fā)生起到預(yù)警作用，最大限度地避免悲劇的重演。因此，AA的體內(nèi)檢測(cè)方法及代謝研究具有十分重要的理論和實(shí)際價(jià)值。近二十年來(lái)，除了有少量植物中AA的HPLC分析研究外，國(guó)內(nèi)外有關(guān)AA體內(nèi)分析方法的文獻(xiàn)報(bào)道幾乎沒(méi)有。其藥物動(dòng)力學(xué)研究系采用紫外分光光度法，顯然無(wú)論靈敏度和特異性均不能符合要求；而代謝產(chǎn)物的研究

5、則是從生物樣品中分離制備代謝物純品，這樣往往可能遺漏含量較低的代謝物。因此我們擬采用HPLC、LC-MS、GC-MS等技術(shù)，研究建立AA在生物樣品中新的分析方法，使其具有靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)，并符合藥物動(dòng)力學(xué)研究和臨床藥物監(jiān)測(cè)的需要，為全面研究AA的毒理機(jī)制、控制毒副反應(yīng)的發(fā)生提供方法學(xué)基礎(chǔ)，從而為中藥現(xiàn)代化、科學(xué)化進(jìn)程作出貢獻(xiàn)。二、馬兜鈴酸體內(nèi)檢測(cè)方法及代謝轉(zhuǎn)化研究策略建立了簡(jiǎn)單、靈敏的高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的方法。以SD種雄性大鼠作為研究對(duì)象，研究了大鼠單次口服馬兜鈴酸I溶液后其藥代動(dòng)力學(xué)行為。另外采用正、負(fù)離子化模式的ESI-MS、APCI-MS等多種

6、質(zhì)譜分析方法對(duì)馬兜鈴酸I及其代謝物進(jìn)行了探索研究。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：1、以SD種雄性大鼠作為研究對(duì)象，體重210±20g。 2、配制馬兜鈴酸I（1.00 gL-1）和內(nèi)標(biāo)物吲哚美辛（1.00 gL-1）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。3、藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)部分所使用的液相條件：色譜柱為YMC C18柱（5µm, 3.0mm×150mm I.D.）；流動(dòng)相為乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）；流速0.3mL·min-1, 檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。4、對(duì)血漿中的馬兜鈴酸I和內(nèi)標(biāo)吲哚美辛使用重蒸乙酸乙酯進(jìn)行液-液萃取。5、對(duì)分析方法按有關(guān)規(guī)范要求進(jìn)行了平均方法回收率、精密度與準(zhǔn)確度和穩(wěn)

7、定性的考察。6、研究了大鼠單次口服馬兜鈴酸I溶液后其藥代動(dòng)力學(xué)行為。 7、以苯巴比妥鈉誘導(dǎo)大鼠，制備大鼠肝微粒體。8、對(duì)馬兜鈴酸I進(jìn)行大鼠體外肝微粒體溫孵體系中的代謝進(jìn)行研究。用HPLC法對(duì)大鼠體外代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。9、生物樣品收集：大鼠（n=4）在給藥前均禁食12小時(shí)，以含5%蔗糖的生理鹽水維持，同時(shí)收集空白尿和糞。給藥后收集0-24小時(shí)及24-72小時(shí)尿和糞。大鼠（n=4）禁食12小時(shí)后，做膽汁引流手術(shù)，觀察3小時(shí)，同時(shí)收集空白膽汁，然后口服灌胃給藥，收集0-24小時(shí)及24-72小時(shí)膽汁。10、建立馬兜鈴酸I在大鼠體內(nèi)外代謝的生物樣品前處理辦法。11、我們采用正、負(fù)離子化模式的ESI-MS

8、、APCI-MS等多種質(zhì)譜分析方法對(duì)馬兜鈴酸I及其代謝物進(jìn)行了探索研究，并檢測(cè)到可能是馬兜鈴內(nèi)酰胺Ia的硫酸結(jié)合型II相代謝產(chǎn)物。三、馬兜鈴酸I在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)研究馬兜鈴酸I（Aristolochic acid I，AAI）和內(nèi)標(biāo)物吲哚美辛（Indomethacin）的結(jié)構(gòu)式分別為以下所示： Aristolochic acid I IndomethacinFig. 3-2 Structures of AAI and Internal Standard (Indomethacin)1 儀器與材料 1.1 藥品與試劑 馬兜鈴酸I對(duì)照品（鑒別用，純度>95%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所吲

9、哚美辛（含量測(cè)定用） 中國(guó)藥品生物制品檢定所肝素鈉 常州新華活性材料研究所碳酸氫鈉（分析純） 北京化工廠乙腈（色譜純） Merck公司甲醇（色譜純） Merck公司 冰醋酸（分析純） 北京化工廠乙酸乙酯（分析純） 北京化工廠雙蒸水 北京協(xié)和藥廠1.2 動(dòng)物 SD大鼠，體重210±20g， 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供, 許可證號(hào)：9CXK（京）2002-0003。 1.3 儀器 日本Jasco公司高效液相色譜儀（PU-980泵，UV-975檢測(cè)器）；SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；TGL-16G型高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TTM-1

10、型旋渦混合器（日本SIBATA公司）；天平（LIBROR AEL-160型，Shimadzu公司；AG135型，METTLER TOLEDO公司）；微量移液器（40-200 µL，NICHIRYO公司；100-1000 µL，GILSON公司）。1.4 試藥的配制 稱取10.00 mg馬兜鈴酸I，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解超聲促溶，配成1 gL-1的馬兜鈴酸I標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。然后根據(jù)需要進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，配制成相當(dāng)于濃度為0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1馬兜鈴酸I的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱取20.0 mg馬兜鈴

11、酸I，用1% NaHCO3溶液溶解，超聲促溶，配成1.0 gL-1的溶液供大鼠口服。肝素鈉用生理鹽水配成4 gL-1的溶液。稱取內(nèi)標(biāo)吲哚美辛5.00 mg，配成濃度為1.00 gL-1甲醇溶液作為儲(chǔ)備液，準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移0.75 mL至50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋為0.015 gL-1 的內(nèi)標(biāo)供試液。2 方法與結(jié)果2.1 血漿樣品處理 取大鼠血漿0.2 mL，置于10 mL具塞離心管中。加入內(nèi)標(biāo)溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）200 L，混勻。加入乙酸乙酯3 mL，渦流震蕩1 min，離心10 min （3000r·min-1），分取上層有機(jī)相。同法用乙酸乙酯再提

12、取一次合并有機(jī)相，于40氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物溶?00 L流動(dòng)相中，渦流1 min，離心后取上清液20 L進(jìn)行HPLC分析。2.2 色譜條件和色譜行為色譜柱：YMC C18柱（5 m，3.0 mm×150 mm I.D.）流動(dòng)相：乙腈-水-冰醋酸（50:50:1），流速： 0.3 mL·min-1, 檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。在上述色譜條件下，空白血漿、含藥血漿和實(shí)測(cè)血漿的HPLC譜圖如Fig.3-3所示。結(jié)果顯示馬兜鈴酸I和內(nèi)標(biāo)吲哚美辛的色譜峰不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰的干擾，色譜分離良好（R>1.5），測(cè)定專屬性強(qiáng)。馬兜鈴酸I的保留時(shí)間為11.87min，內(nèi)標(biāo)吲哚美辛的保留時(shí)間為

13、16.88min，色譜峰3可能為馬兜鈴酸I的一個(gè)代謝產(chǎn)物，其保留時(shí)間為5.77min。 (A) (B) (C)Fig.3-3 HPLC chromatograms of blank plasma(A), standard plasma(B) and test plasma(C).A: Blank plasma sample.B: Plasma sample spiked with 5g·mL-1AAI(1) and internal standard(2).C: 0.167h plasma sample after an oral administration of AAI(po.1

14、0 mg·kg-1) to a SD rat, a possible metabolite(3) of AAI. Internal Standard: Indomethacin2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 取大鼠空白血漿0.2 mL，置于10 mL具塞離心管中，加入馬兜鈴酸I系列標(biāo)準(zhǔn)溶液200 L，分別配制成相當(dāng)于濃度為0.25，0.50，1.25，2.50， 5.00，10.00和20.00 g·mL-1的血漿樣品，按照上述方法中“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以血漿中待測(cè)物濃度（C）為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，求得直線回歸方程

15、，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程為Y=0.0946C-0.0172，=0.9994，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)Fig.3-4。本方法在0.25-20.00g·mL-1范圍內(nèi)線性良好，最低定量濃度為0.25g·mL-1。Fig.3-4 A typical standard curve for the determination of AAI in rat plasma2.4 方法回收率分別取低、中、高3個(gè)濃度（0.25、2.50、20.00g·mL-1）的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍”項(xiàng)下方法操作，所測(cè)得的馬兜鈴酸I色譜峰面積值與標(biāo)準(zhǔn)溶液直接進(jìn)樣分析所得的面積值對(duì)比，考察各濃度點(diǎn)的

16、平均方法回收率。每一濃度進(jìn)行5樣本分析。結(jié)果見(jiàn)Tab.3-1。Tab.3-1 The relative extracted percentage of AAI at three different concentrationAdded(g·mL-1) 0.25g·mL-1 2.50g·mL-1 20.00g·mL-1Measured 0.28 2.62 20.34 (g·mL-1) 0.26 2.57 21.55 0.26 2.63 20.13 0.25 2.66 21.95 0.27 2.32 21.50 (g·mL-1) 0.26

17、 2.56 21.09RE(%) 4.72 2.40 5.47RSD(%) 4.67 5.39 3.82 2.5 精密度與準(zhǔn)確度取空白血漿0.2 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍”項(xiàng)下方法操作，分別制備濃度為0.25、2.50和20.00g·mL-1的馬兜鈴酸I待測(cè)樣品，每一濃度進(jìn)行5樣本分析，連續(xù)測(cè)定2天，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度，求算精密度與準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)Tab.3-2。精密度與準(zhǔn)確度均符合有關(guān)國(guó)內(nèi)外規(guī)范要求。Tab. 3-2 Precision and accuracy of the HPLC method to determine AAI in rat plasmaConcentr

18、ation0.25g·mL-12.50g·mL-120.00g·mL-1Inter-day（n=5） (g·mL-1)0.26 0.260.240.260.263.09 2.82 2.732.65 2.7119.94 20.16 21.18 20.45 21.20(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.26 2.32 3.552.80126.1820.592.932.90Inter-day（n=5）(g·mL-1)0.27 0.27 0.25 0.240.242.88 2.56 2.67 2.35 2.6521.12 19.03

19、20.84 20.96 21.01(g·mL-1)RE(%) RSD(%)0.25 1.36 6.012.80126.1820.592.94.272.6 樣品穩(wěn)定性考察 考察馬兜鈴酸I的高（20.00g·mL-1）、低（0.25g·mL-1）不同濃度的樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果表明血漿樣品在冷凍-融化循環(huán)3次實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的馬兜鈴酸I的濃度沒(méi)有明顯降低（相對(duì)偏差在10%以內(nèi)）。室溫條件下馬兜鈴酸I在流動(dòng)相中至少穩(wěn)定存在24h。2.7 馬兜鈴酸I在大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究雄性SD大鼠5只，每只大鼠間隔一定的時(shí)間取血，取血時(shí)間點(diǎn)為0.017，0.083，0.13，0

20、.20，0.25，0.42，0.58，0.75，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0h。給藥前禁食12h，全程不禁飲水。大鼠灌胃口服1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0gL-1），劑量為10.0 mg·kg-1，于不同時(shí)間點(diǎn)由大鼠眼眶后靜脈叢取血約500 L，置于肝素化離心試管中，離心分離血漿，按上述方法中“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，測(cè)得大鼠單次口服馬兜鈴酸I后各個(gè)采血點(diǎn)的血藥濃度，數(shù)據(jù)見(jiàn)Tab.3-3。平均血藥濃度-時(shí)間曲線如Fig.3-5所示。體內(nèi)結(jié)果表明大鼠口服馬兜鈴酸I后藥-時(shí)曲線存在有多峰現(xiàn)象。用WINNOLIN藥代計(jì)算程序處理，按照非房室模型進(jìn)行推算

21、、權(quán)重選擇，擬合藥-時(shí)曲線，并計(jì)算相關(guān)藥代參數(shù)，有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)Tab.3-4。Fig.3-5 Mean plasma concentration-time curve of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTab.3-3 Plasma concentration of AAI after oral single dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsTime(h)12345MeanSD0.03330.08330.11670.18330.250.43330.58330.7511.522

22、.5340.538.1110.999.539.104.181.612.756.711.961.301.051.880.750.314.327.028.637.193.261.697.096.481.720.750.450.410.340.434.828.5310.1311.142.931.691.165.792.630.830.500.380.350.295.717.368.3810.122.061.012.271.332.220.830.500.420.296.9714.3812.4428.0019.6411.655.261.871.190.580.460.410.460.375.999.6

23、69.8213.116.413.533.714.441.940.860.620.720.460.111.563.071.628.457.434.552.422.620.540.270.290.650.16Tab.3-4 Pharmacokinetic parameters of AAI after single oral dose of 10.0 mg·kg-1 in ratsSubject Rsq Tmax Cmax AUClast AUC0 T1/2_z Vz/F Cl/F AUMC0 MRT0 (observed) (observed) (observed) (observed

24、) (observed) h ug·mL-1 mg·h·L-1 mg·h·L-1 h 1 0.624 0.117 10.99 10.66 12.00 1.246 0.449 0.250 21.467 1.7892 0.769 0.183 8.63 8.73 9.10 0.755 0.359 0.330 10.425 1.1463 0.817 0.250 11.14 8.21 8.57 0.722 0.365 0.350 10.020 1.1694 0.772 0.250 10.12 6.41 7.25 1.382 0.825 0.414 11.

25、833 1.6325 0.706 0.300 28.00 13.82 14.77 1.437 0.421 0.203 14.885 1.008 0.737 0.22 13.77 9.57 10.34 1.108 0.484 0.309 13.726 1.349SE 0.075 0.071 8.013 2.819 3.025 0.345 0.195 0.083 4.730 0.3413 討論3.1 HPLC分析方法中各種影響因素的條件摸索利用高效液相色譜儀對(duì)馬兜鈴酸I的色譜峰進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)馬兜鈴酸I的最大吸收波長(zhǎng)與文獻(xiàn)7報(bào)道基本接近：其最大吸收波長(zhǎng)位于250nm、318nm、390nm處

26、，實(shí)驗(yàn)中為了避免雜質(zhì)峰的干擾，同時(shí)兼顧最大吸收，保證其靈敏度，所以選擇254nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。 文獻(xiàn)8-10報(bào)道的檢測(cè)馬兜鈴酸的流動(dòng)相組成有：甲醇：水：乙酸=70:29:1(v/v/v)；乙腈：0.1%磷酸緩沖液=60:40(v/v)，pH 2.5-2.8；乙腈：0.3%碳酸銨溶液=25:75(v/v)，pH 7.5。本實(shí)驗(yàn)參考以上流動(dòng)相組成，對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，使流動(dòng)相組成適合生物樣品分析要求，并且滿足下一步LC-MS法對(duì)馬兜鈴酸生物樣品的分析要求。本實(shí)驗(yàn)中在微徑柱上使用甲醇/水/乙酸流動(dòng)相組成體系時(shí)，需要將乙酸加至2%才能將保留時(shí)間調(diào)整合適，考慮到酸性太強(qiáng)會(huì)使柱壽命降低，所以未選用此體系。摸索發(fā)

27、現(xiàn)將乙腈/0.3%碳酸銨溶液體系調(diào)整比例為27:73（v/v）適合馬兜鈴酸I的分析，但是在此流動(dòng)相組成下內(nèi)標(biāo)物吲哚美辛的色譜峰出現(xiàn)多峰現(xiàn)象，原因不明。最后選擇的流動(dòng)相組成為乙腈：水：乙酸=50:50:1（v/v/v），在此條件下馬兜鈴酸I和內(nèi)標(biāo)吲哚美辛的保留時(shí)間合適，適合生物樣品分析的要求，分離良好，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾。3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇在內(nèi)標(biāo)物的選擇上，考察了包括馬兜鈴酸II和一些與馬兜鈴酸結(jié)構(gòu)較為相似的化合物的色譜行為以及提取回收率和穩(wěn)定性，其中馬兜鈴酸II的保留時(shí)間和原藥馬兜鈴酸I在本實(shí)驗(yàn)所使用的液相條件下保留時(shí)間比較接近，分離度不是特別理想。萘的保留時(shí)間合適，與馬兜鈴酸I也 較為接近，

28、分離度良好，但是在按照上述方法中“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作過(guò)程中，萘的揮發(fā)性較強(qiáng)，分取上層有機(jī)相，于40氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物?fù)溶后進(jìn)行HPLC分析時(shí)，未出現(xiàn)萘的色譜峰。綜合考慮待選化合物的保留時(shí)間以及與原藥相同的提取體系下待選內(nèi)標(biāo)物的回收率和穩(wěn)定性等因素，最后選定吲哚美辛為內(nèi)標(biāo)物。3.3 提取溶劑的選擇取大鼠空白血漿0.2 mL，加入內(nèi)標(biāo)溶液（0.015 g·L-1 吲哚美辛甲醇溶液）和馬兜鈴酸I （0.0025 g·L-1甲醇溶液）各200 L，考察了不同的提取溶劑體系對(duì)回收率和穩(wěn)定性的影響，比較了用重蒸乙酸乙酯、重蒸乙酸乙酯-異丙醇（1:9）、二氯甲烷-異丙醇（9:1）的

29、液-液提取方法。另外還考察了加入氯化鈉固體、甲醇、不同濃度鹽酸酸化對(duì)提取回收率的影響。結(jié)果表明內(nèi)標(biāo)的甲醇溶液具有沉淀蛋白的作用，直接用乙酸乙酯做為提取體系的溶劑提取回收率和穩(wěn)定性很合適，加入鹽酸酸化并沒(méi)有使提取率有明顯的增加，為了簡(jiǎn)化操作步驟，直接利用乙酸乙酯作為液-液提取體系。3.4 馬兜鈴酸I在大鼠血漿中的藥代動(dòng)力學(xué)行為本研究采用RP-HPLC法測(cè)定大鼠血漿中馬兜鈴酸I濃度的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為5.77 min的色譜峰可能為馬兜鈴酸I的一個(gè)代謝產(chǎn)物，見(jiàn)色譜圖Fig.3-3（C）。對(duì)此色譜峰和馬兜鈴酸I的色譜峰進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，其結(jié)果見(jiàn)Fig.3-6。經(jīng)過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者的紫外吸收譜型非常相

30、似，且最大吸收波長(zhǎng)也很接近。并且通過(guò)與空白血漿對(duì)照，初步可以判斷其為馬兜鈴酸I的一個(gè)代謝產(chǎn)物。但是由于馬兜鈴酸I及其代謝產(chǎn)物在各種離子化條件下，包括電噴霧質(zhì)譜（ESI-MS）和大氣壓化學(xué)電離（APCI-MS），其離子化效率均很低，所以相應(yīng)的質(zhì)譜分析方法尤其是LC-MS或GC-MS方法尚未建立起來(lái)，將血漿樣品進(jìn)行LC-MS和GC-MS方法分析時(shí)，可能的代謝產(chǎn)物沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)。為進(jìn)一步確定這個(gè)可能代謝物的結(jié)構(gòu)，將剩余的血漿樣品合并后，裝入自制的正相硅膠柱，使用氯仿、丙酮、異丙醇、甲醇、含1%冰醋酸的甲醇進(jìn)行洗脫，經(jīng)減壓濃縮蒸干，復(fù)溶于流動(dòng)相中，利用RP-HPLC進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)可能的代謝物在正相硅膠

31、柱上產(chǎn)生死吸附，沒(méi)有被洗脫下來(lái)。大鼠口服馬兜鈴酸I后吸收很快，T1/2_z為1.108h，消除較慢。本研究首次發(fā)現(xiàn)大鼠口服馬兜鈴酸I后消除相存在多峰現(xiàn)象。藥物的多峰現(xiàn)象一般與腸-肝循環(huán)、胃-腸循環(huán)或腸-腸循環(huán)有關(guān)。腸-肝循環(huán)受食物影響明顯，在禁食給藥后再攝取食物的情況下出現(xiàn)，這可能是因?yàn)閿z食使得儲(chǔ)存于膽囊中的藥物隨膽汁釋放入腸道又被重新吸收的緣故。在本實(shí)驗(yàn)中由于大鼠被采血的時(shí)間較密集，所以給藥后大鼠就被供給食物了，所以馬兜鈴酸I在大鼠體內(nèi)的多峰現(xiàn)象有可能與腸-肝循環(huán)有關(guān)。這一結(jié)論有待于進(jìn)一步研究來(lái)驗(yàn)證。 (A) (B)Fig.3-6 The UV spectra of AA I (A) and

32、 the possible metabolite of it (B)四、馬兜鈴酸I代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜分析方法探討1 試劑與儀器1.1 試劑與藥品 馬兜鈴酸I對(duì)照品（鑒別用，純度>95%） 中國(guó)藥品生物制品檢定所 馬兜鈴酸混合物 Sigma 公司6-磷酸葡萄糖（G-6-P） Sigma公司6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G-6-P DH） Sigma公司氧化型輔酶II（NADP） Sigma公司還原型輔酶I（NADH） 北京百泰生化試劑公司 乙腈（色譜純） Merck公司甲醇（色譜純） Merck公司 冰醋酸（分析純） 北京化工廠雙蒸水 北京協(xié)和藥廠1.2 儀器高效液相色譜系統(tǒng)：日本Jasco公司（PU

33、-980泵，UV-975檢測(cè)器） SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)質(zhì)譜儀1： AutoSpec Ultima-Tof串聯(lián)質(zhì)譜儀（Micromass，UK）質(zhì)譜儀2： LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司） HPLC系統(tǒng)：Autosample Surveyor MS Pump Surveyor2 研究方法2.1 生物樣品的收集 體外溫孵體系的建立 采用大鼠肝微粒體體外有氧溫孵體系，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，考察了微粒體蛋白和馬兜鈴酸I的量對(duì)代謝轉(zhuǎn)化率的影響，以便選擇最佳溫孵體系，體外溫孵是在生理溫度37下進(jìn)行，整個(gè)系統(tǒng)用pH7.4 Tris

34、-HCl緩沖液維持pH值穩(wěn)定。 往適量的pH7.4 Tris-HCl緩沖液中按Tab.3-6所示的濃度分別加入肝微粒體、NADP、NADH、G-6-P、G-6-P DH以及MgCl2后搖勻，置于37水浴中預(yù)溫孵3分鐘，加入適量經(jīng)DMSO助溶的馬兜鈴酸I溶液，繼續(xù)置于37水浴中振搖，每20分鐘通氧氣1分鐘，2小時(shí)后撤離水浴，終止反應(yīng)?？瞻讓?duì)照管不加馬兜鈴酸I，其它操作與樣品管相同，沸水浴滅活。Tab.3-6 Incubation systems with rat liver microsomes and cofactor solution（10ml）GroupNADPmmol/LNADHmmol

35、/LG-6-Pmmol/LG-6-PDHI.U./mLMg2+mmol/LMicrosomeProteinmg/mL AAImg123451.01.01.01.01.00.50.50.50.50.510.010.010.010.010.01.01.01.01.01.04.04.04.04.04.02.03.04.03.03.0 1.0 1.0 1.0 1.52.0 尿液和糞便的收集 SD雄性大鼠5只置于代謝籠中，禁食12小時(shí)，10%蔗糖溶液維持，收集24小時(shí)空白尿液和糞便，然后給大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0 g·L-1），劑量按體重計(jì)算為10.0 m

36、g·kg-1，分別收集0-24小時(shí)的尿液和0-72小時(shí)的糞便，-20下保存。 膽汁的收集SD雄性大鼠手術(shù)前禁食12小時(shí)，乙醚麻醉狀態(tài)下做膽管插管手術(shù)，10%蔗糖生理鹽水灌胃維持。給藥前收集空白膽汁，然后給大鼠口服灌胃1% NaHCO3溶液配制的馬兜鈴酸I溶液（1.0 g·L-1），劑量按體重計(jì)算為10.0 mg·kg-1，收集給藥以后的膽汁，在-20下保存。2.2 生物樣品的前處理 體外溫孵產(chǎn)物的前處理 溫孵產(chǎn)物用乙酸乙酯10 mL提取，提取三次，合并有機(jī)相，于40減壓蒸干，用流動(dòng)相（甲醇：水=60:40）200 L復(fù)溶，離心后取上清液20 L進(jìn)行HPLC分析。

37、尿液和糞便的前處理 將給藥后收集的大鼠糞便研磨成粉末狀，置于燒杯中，加入乙醇：水（50:50）混合溶劑300 mL浸泡過(guò)夜，過(guò)濾，殘?jiān)偌尤胪瑯尤軇┨崛∫淮?，合并濾液。將大鼠糞便濾液和尿液分別于40減壓濃縮，濃縮至小體積后，用反相C18硅膠拌樣，涼干。 按1:25比例，取反相C18硅膠自行裝柱，將硅膠填實(shí)，先用甲醇沖洗柱子，然后再用雙蒸水沖洗，樣品填入柱子后先用大量的雙蒸水沖洗，然后用乙腈和水進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫流程如下：乙腈（mL）: 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.5 5.5 7.5 10 16雙蒸水（mL）: 49.0 48.5 48.0 47.5 47.0 46.

38、5 45.5 44.5 42.5 40 34最后使用甲醇和含1%冰醋酸的甲醇沖洗，每份50 mL，分別于40減壓蒸干，用流動(dòng)相（甲醇：水=5:95或15:85）進(jìn)行復(fù)溶，離心后取上清液進(jìn)行HPLC分析。 膽汁的處理 將收集的大鼠空白膽汁和給藥膽汁分別用乙酸乙酯提取（體積比為1:2），提取三次，合并有機(jī)相，于40減壓蒸干，用流動(dòng)相（甲醇：水=60:40）進(jìn)行復(fù)溶，離心后取上清液進(jìn)行HPLC分析。2.3 分析方法2.3.1 RP-HPLC分析方法 色譜條件色譜儀：Jasco公司PU-980泵，UV-975檢測(cè)器，SRI MODEL 203 PeakSimple 液相色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)色譜柱：YMC

39、C18柱（5m, 3.0 mm×150 mm I.D.）流速：0.3 mL·min-1 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm進(jìn)樣量：20µl流動(dòng)相1：甲醇：水：冰醋酸=5:95:1流動(dòng)相2：甲醇：水：冰醋酸=10:90:1 流動(dòng)相3：甲醇：水：冰醋酸=15:85:12.3.2 質(zhì)譜分析方法質(zhì)譜條件儀器型號(hào)：AutoSpec Ultima-Tof 串聯(lián)質(zhì)譜儀EI-MS：電離電壓：70eV；分辨率：1000；加速電壓：8000VFAB-MS：Cs+離子槍；分辨率：1000；加速電壓：8000V 基質(zhì)：甘油（Gly或G），間硝基芐醇（m-NBA） 硫代甘油（TG），二硫蘇糖醇（DTT）

40、 ESI-MS：錐體電壓： 20V 毛細(xì)管電壓： 8.5KV 加速電壓： 4KV 溶劑體系： 甲醇-醋酸銨（100:1） 流速： 20 µLmin-1 APCI-MS：Needle voltage: 60V Sampling Cone: 20V Skimmer Lens: 43.2V Ring Electrode: 18.1% Nebulizer Heater: 80 Solution: Methanol Flow Rate: 1.0 mLmin-1GC-MS: 色譜柱： DB-5（30m×0.25mm I.D.，0.25µm）毛細(xì)管柱 載氣： He，1mLmin

41、-1 進(jìn)樣口溫度：220；接口溫度：220；離子源溫度：220進(jìn)樣方式：不分流，1 µL柱升溫程序：60 (2min) 20/min 220 (1min) 3/min 280(1min)10/min 300 (1min)儀器型號(hào)：LCQ Advantage （Thermo Finnigan 公司）ESI-MS: Spray voltage： 4.2 kv Sheath Gas Flow Rate： 40 psi Tube lens offset： 30 Capillary voltage： 3.00V Capillary temperature： 220Solution: Metha

42、nol APCI-MS: Vapouriser temperature： 450 Capillary temperature： 150 Needle current： 5 µAAuxiliary Gas Flow Rate: 20 psiSolution: MethanolLC-MS: 色譜柱： YMC C18柱（5m，3.0 mm×150 mm I.D.）流動(dòng)相： 乙腈-水-冰醋酸（50:50:1）流速： 0.3 mL·min-1 樣品處理：馬兜鈴酸I溶于甲醇-醋酸銨（100:1）溶劑體系3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論3.1 馬兜鈴酸I的質(zhì)譜分析馬兜鈴酸I標(biāo)準(zhǔn)品在EI-MS

43、譜（Fig.3-8）中得到分子離子m/z 341和碎片離子m/z 295、m/z 293和m/z 278，其中m/z 295為M-NO2+，而m/z 293和m/z 278分析判斷為雜質(zhì)峰。Fig.3-8 EI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spectrometer在FAB-MS的正、負(fù)離子模式下，嘗試使用各種底物，均沒(méi)有得到分子離子峰。采用APCI離子化方式，分別在AutoSpec Ultima-Tof串聯(lián)質(zhì)譜儀和LCQ質(zhì)譜儀上，均沒(méi)有檢測(cè)到馬兜鈴酸I的分子離子峰。利用AutoSpec Ultima-Tof串聯(lián)質(zhì)譜儀分析檢測(cè)馬兜鈴酸I的 ESI-MS譜，見(jiàn)Fig.3-9。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有多個(gè)加合離子，例如M+ Na +( m/z 364)，2M+Na+( m/z 705)，3M+Na+( m/z 1046)和4M+Na+( m/z 1387)。但是可以看出馬兜鈴酸I在正離子模式的ESI電離方式下也很難離子化，同時(shí)此結(jié)果也表明馬兜鈴酸I具有較強(qiáng)的分子間相互作用力。Fig.3-9 ESI-MS of AAI with AutoSpec Ultima-Tof mass spec