第四部分A280A260法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度

1、第四部分 A280/A260法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度目前在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中有幾種測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法：280nm/260nm（A280/A260）光吸收法，Bradford檢測(cè)法，Lowry檢測(cè)法和二喹啉甲酸（BCA）檢測(cè)法，通常根據(jù)蛋白質(zhì)樣品量大小，蛋白純度等因素選擇不同的測(cè)定方法。本實(shí)驗(yàn)只需對(duì)層析洗脫峰進(jìn)行快速而粗略的定量分析，因此選擇A280/A260光吸收法。一、原理由于蛋白質(zhì)分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，在紫外280nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故可用波長(zhǎng)吸收值大小來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，但由于此方法無(wú)法排除核酸的干擾，因而在通常情況下還要測(cè)定樣品在2

2、60nm處的OD值（光吸收值）。二、提要1. 所需時(shí)間：幾分鐘2. 優(yōu)點(diǎn)：方便、快速，且對(duì)蛋白質(zhì)無(wú)破壞性，測(cè)定后的蛋白質(zhì)仍能回收利用。3. 缺點(diǎn)： 1）準(zhǔn)確度較差，不是嚴(yán)格的定量，因?yàn)榇朔ㄊ歉鶕?jù)酪氨酸（Tyr），苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Trp）殘疾的強(qiáng)吸收值來(lái)測(cè)定的。不同蛋白質(zhì)有不同的消光系數(shù)，如果一種蛋白質(zhì)中沒(méi)有上述三 種氨基酸殘基，用此法則不能檢出。 2）核酸可引起強(qiáng)干擾作用4.靈敏度：0.05mg/ml2mg/ml；比色杯的最小測(cè)量體積為0.1ml三、設(shè)備和試劑1. 設(shè)備1）紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；2）石英比色杯；3）濾紙；4）擦鏡紙；5）用于溶液轉(zhuǎn)移的吸管或移液槍2. 試劑實(shí)驗(yàn)用緩沖液

3、四、操作步驟將實(shí)驗(yàn)緩沖液加入比色杯中，將A280（或A260）值調(diào)零，再吸去緩沖液對(duì)照加入樣品，記錄A280和A260值；三次求平均值。五、注意事項(xiàng)1. 實(shí)驗(yàn)室中常犯的錯(cuò)誤是認(rèn)為用1cm的比色杯所測(cè)吸收值為1.0時(shí)，蛋白質(zhì)濃度大約為1mg/ml，這是非常不精確的；2. 玻璃和塑料在紫外吸收光范圍內(nèi)本身就具有光吸收值，因而不能用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量如果所測(cè)值超過(guò)測(cè)量范圍（A280示數(shù)顯示在0.12.0為宜），應(yīng)將樣品用緩沖液稀釋后再測(cè)量。3. 如果實(shí)驗(yàn)所用的緩沖液和水相比有較高的光吸收值，這說(shuō)明緩沖液有干擾物質(zhì)存在。4. 修改測(cè)定方法可部分改正由于干擾物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成不同所引起的誤差，最常用的是檢

4、測(cè)A280/A260的比值，通常： 純蛋白質(zhì)的光吸收A280/A260值為 1.8 純核酸的光吸收A280/A260值為 0.5蛋白質(zhì)溶液的A280/A260值如為2.0，這時(shí)可忽略溶液中核酸的光吸收值，否則視為含有核酸的蛋白質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其A280和A260，再用以下經(jīng)驗(yàn)公式，即可計(jì)算出蛋白質(zhì)的濃度： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）= 1.5×A280-0.75×A2605. 由于蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰常因pH變化而改變，故應(yīng)用此法時(shí)要注意溶液的pH。最好樣品的pH與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制定時(shí)的pH一致。第五部分 凝集素的糖抑制試驗(yàn)一、原理細(xì)胞膜是雙層脂鑲嵌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，脂和蛋白質(zhì)又能與糖

5、分子結(jié)合為細(xì)胞表面的分枝狀糖外被。目前認(rèn)為：細(xì)胞間的聯(lián)系，細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生都和細(xì)胞表面的分枝狀糖分子有關(guān)。凝集素（Lectin）是一類(lèi)能夠?qū)Ｒ恍?，可逆性地與糖結(jié)合的蛋白質(zhì)或糖蛋白，它具有凝集細(xì)胞刺激細(xì)胞分裂的作用。由于它與細(xì)胞表面的糖分子連接，在細(xì)胞間形成橋的結(jié)果，加入與凝集素互補(bǔ)的糖可以抑制該凝集素對(duì)細(xì)胞的凝集。不同凝集素有其特異性結(jié)合的糖的類(lèi)型，在此，我們通過(guò)糖抑制試驗(yàn)確定植物凝集素的糖結(jié)合特異性。二、設(shè)備與試劑1.設(shè)備1）96孔培養(yǎng)板；2）移液槍?zhuān)?）普通光學(xué)顯微鏡；4）蓋玻片；5）玻璃燒杯；6）EP管7）擦鏡紙2.試劑1）樣品溶液；2）兔血紅細(xì)胞懸液；3）糖或糖蛋白溶液；4）生理鹽水三、方法與步驟1.首先加入20ul初始濃度為1mg/ml倍比稀釋的樣品溶液。2.每孔加入20ul的糖（初