抗腫瘤藥物阿霉素對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上抗腫瘤藥物阿霉素對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響 馮景（8） 張書（6）指導(dǎo)老師：張偉摘要：為了探究抗腫瘤藥物阿霉素對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響，使用了MTT比色法測(cè)定了細(xì)胞給不同濃度后的相對(duì)數(shù)量，研究其對(duì)細(xì)胞增殖的影響；使用熒光染色法研究其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，并觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。關(guān)鍵字：阿霉素 細(xì)胞凋亡 MTTAbstract：To explore the anticancer drug doxorubicin effect on cell proliferation and apoptosis, studying its effects on cell proliferation

2、by the MTT that analyzes the relative number of cells after different concentrations; learning its affect on cells morphology using fluorescence staining and apoptotic morphology was observed.Keywords: Apoptosis doxorubicin MTT近50年的抗腫瘤藥物研究開發(fā)工作使腫瘤化療取得相當(dāng)?shù)倪M(jìn)步，特別是使血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但嚴(yán)重威脅人類生命健康的占惡性腫瘤90%以

3、上的實(shí)體瘤的治療尚未達(dá)到滿意的療效?？鼓[瘤藥物正從傳統(tǒng)的非選擇性單一的細(xì)胞毒性藥物向針對(duì)機(jī)制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物具有抗腫瘤作用，部分常用的抗腫瘤藥物及其作用機(jī)制如表1所示，其中很多抗腫瘤藥物可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，而對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用較小。表1.部分常用的抗腫瘤藥物及其作用機(jī)制藥物名稱作用機(jī)制藥物名稱作用機(jī)制Actinomycin D（ 更生霉素）抑制RNA的合成Glucocorticoids（糖皮質(zhì)激素）激素Adriamycin （Doxorubicin，阿霉素）DNA嵌入劑5-Fluorouracil（ 5-氟尿嘧啶）抗代謝藥物Bleomycin (

4、博來(lái)霉素)引起DNA片斷化Hydroxyurea（羥基脲）抗代謝藥物Camptothecin（ 喜樹堿）拓?fù)洚悩?gòu)酶I型藥物Mitoxantrone（米托蒽醌）DNA嵌入劑Chlorambucil（苯丁酸氮芥）DNA交聯(lián)劑Paclitaxel(TAXOL) (紫杉醇)靶向微管藥物Cisplatin （順鉑）DNA交聯(lián)劑Staurosporine （ 星形孢菌素）激酶抑制劑Cytarabine（阿糖胞苷）抗代謝藥物Tamoxifen（它莫西芬）激素拮抗劑Cycloheximide (放線菌酮)蛋白質(zhì)合成抑制劑Topotecan（拓?fù)涮婵担┩負(fù)洚悩?gòu)酶I型藥物Cyclophosphamide（環(huán)磷酰胺

5、）DNA交聯(lián)劑Vinblastine （長(zhǎng)春堿）靶向微管藥物材料和方法1 實(shí)驗(yàn)材料1.1 生物材料 人胃癌細(xì)胞BGC-8231.2 試劑 MTT母液(5mg/mL)、裂解液（10%SDS0.01N HCl）、胰酶、PBS溶液、PI 、Ho.33342、阿霉素。阿霉素：是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，抗瘤譜較廣，對(duì)多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病，對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病及粒細(xì)胞白血病均有效，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時(shí)可考慮應(yīng)用此藥。PI（碘化丙啶）：是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色

6、試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細(xì)胞膜，但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對(duì)核染色。Ho.33342 ：結(jié)合于DNA的AT堿基對(duì)，釋放藍(lán)色熒光,可進(jìn)入活細(xì)胞,用于細(xì)胞周期的研究,染色體和細(xì)胞核的觀察2 實(shí)驗(yàn)方法步驟2.1 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,用胰酶消化計(jì)數(shù),配制細(xì)胞懸液濃度為: 3-4104/mL，取細(xì)胞接種到96孔板，每孔200L，即8000細(xì)胞/孔。2.2 加藥處理:待細(xì)胞貼壁后于第二天中午換液加藥(可在24小時(shí)進(jìn)行), 換200L新鮮培養(yǎng)基，用無(wú)菌水配制相應(yīng)濃度的藥液（詳細(xì)配置藥液方法見表2），每個(gè)孔加入4L配制后藥液，作用72

7、小時(shí)。表2.阿霉素濃度配制表1246810阿霉素 ul0.40.81.62.43.24無(wú)菌水 ul39.639.238.437.636.836總體積 ul404040404040圖1.96孔板加樣示意圖2.3 測(cè)定: 取測(cè)定孔, 棄去培養(yǎng)基,加100L 新鮮的培養(yǎng)基, 加12 L MTT，8小時(shí)后加100L裂解液。過夜后，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 2.4 將酶標(biāo)儀測(cè)出的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行分析，找出半數(shù)抑制濃度( IC50 )，IC50是指在用藥后存活的細(xì)胞數(shù)量減少一半時(shí)所需的藥物濃度。在MTT法中, 就是以對(duì)照組吸光度OD 值減少一半所需的藥物濃度為IC50。2.5 取生長(zhǎng)到80-90%融匯度

8、，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按1：4比例傳代。取1瓶細(xì)胞傳到4瓶 。2.6 第二天加入藥物或水。本組實(shí)驗(yàn)加入4g/ml的藥物培養(yǎng)基。2.7 48小時(shí)后，收集培養(yǎng)液，用胰酶適度消化細(xì)胞，用收集的培養(yǎng)液吹打細(xì)胞，將分散成單個(gè)的細(xì)胞懸液收集至10mL離心管中，1000rpm, 離心 15 min去上清，用0.2毫升PBS重懸細(xì)胞。2.8 取178 l PBS細(xì)胞懸液，加入PI 20 L（終濃度100 g/ml），Ho.33342 2 L（終濃度10g/ml），混勻，37度溫箱中避光標(biāo)記15min。(帶手套操作）2.9 1000rpm，離心10min，棄上清，加30L PBS重懸，取10 L滴于載玻片上，蓋片

9、（不能有氣泡或漂起），保存于暗處。2.10 熒光顯微鏡觀察拍照（紫外激發(fā)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表3 各藥物濃度梯度對(duì)應(yīng)的OD值序號(hào)0124681011.6781.2071.2650.4140.388-0.148-0.26321.6021.5091.1530.3240.301-0.146-0.331.5861.5311.1970.3660.094-0.107-0.22841.6531.5391.250.4190.66-0.142-0.275均值1.629751.44651.216250.380750.36075-0.13575-0.2665抑制率0.112440.253720.76638

10、0.7786511表4 SPSS軟件求得的IC50（紅框所示）圖2各藥物濃度梯度對(duì)應(yīng)的抑制率及其擬合直線根據(jù)圖二可以看出，藥物濃度越大，對(duì)細(xì)胞抑制效果越強(qiáng)，又因R2=0.941，擬合效果較好。根據(jù)表四得：ic50=3.21g/ml。綜合其他組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和助教的預(yù)實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為3.21g/ml可能抑制效果不夠明顯，不利于拍到凋亡細(xì)胞形態(tài)，最終取4g/ml繼續(xù)做后面的藥物對(duì)核型影響的實(shí)驗(yàn)。2 熒光染色結(jié)果圖3 阿霉素對(duì)照組細(xì)胞核熒光染色照片圖4 阿霉素（4 g/ml)細(xì)胞核熒光染色照片對(duì)照組細(xì)胞細(xì)胞核正常，呈規(guī)則的圓形，細(xì)胞整體呈藍(lán)色，幾乎沒有凋亡細(xì)胞，屬于正常細(xì)胞，由于操作問題，有少量呈紫紅色壞死細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組除了有正常的細(xì)胞外，還有一些細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)腎形或坍縮狀等不規(guī)則形狀，有凋亡小體(白色箭頭所示)形成，屬于凋亡細(xì)胞，此外，還有大量壞死（白圈所示）細(xì)胞，細(xì)胞呈紅色或紫紅色。結(jié)果表明阿霉素對(duì)于BG-823細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。討論1 實(shí)驗(yàn)整體系統(tǒng)誤差分析受到實(shí)驗(yàn)條件的限制，鋪板后加藥前之間