動物細(xì)胞和植物細(xì)胞培養(yǎng)反響器

1、動物細(xì)胞和植物細(xì)胞培養(yǎng)反響器動植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)有很大的不同。動植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)有很大的不同。動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別：動物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別： 動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞附著在固體或半固體的表動物細(xì)胞無細(xì)胞壁，且大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞附著在固體或半固體的表面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖面才能生長；對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，除氨基酸、維生素、鹽類、葡萄糖或半乳糖外，還需有血清。動物細(xì)胞對環(huán)境敏感，包括外，還需有血清。動物細(xì)胞對環(huán)境敏感，包括pH、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力都比、溶氧、溫度、剪切應(yīng)力都比微生物有更嚴(yán)的要求，一般須嚴(yán)格的監(jiān)

2、測和控制。微生物有更嚴(yán)的要求，一般須嚴(yán)格的監(jiān)測和控制。植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別：植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物培養(yǎng)區(qū)別： 植物細(xì)胞對營養(yǎng)要求較動物細(xì)胞簡單。但由于植物細(xì)胞培養(yǎng)一般要求在高植物細(xì)胞對營養(yǎng)要求較動物細(xì)胞簡單。但由于植物細(xì)胞培養(yǎng)一般要求在高密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細(xì)胞生長較微生物要緩慢，長時密度下才能得到一定濃度的培養(yǎng)產(chǎn)物，以及植物細(xì)胞生長較微生物要緩慢，長時間的培養(yǎng)對無菌要求及反應(yīng)器的設(shè)計也提出特殊的要求。間的培養(yǎng)對無菌要求及反應(yīng)器的設(shè)計也提出特殊的要求。動植物、微生物細(xì)胞的培養(yǎng)比較動植物、微生物細(xì)胞的培養(yǎng)比較微生物動物細(xì)胞植物細(xì)胞大小(直徑,m)1-1010-1001

3、0-100懸浮生長可以多數(shù)細(xì)胞需附著表面才能生長可以，但易結(jié)團(tuán)，無單個細(xì)胞營養(yǎng)要求簡單非常復(fù)雜較復(fù)雜生長速率快，倍增時間0.5-5小時慢，倍增時間15-100小時慢，倍增時間24-74小時代謝調(diào)節(jié)內(nèi)部內(nèi)部、激素內(nèi)部、激素環(huán)境敏感不敏感非常敏感能忍受廣泛范圍細(xì)胞分化無有有剪切應(yīng)力敏感低非常高高傳統(tǒng)變異，篩選技術(shù)廣泛使用不常使用有時使用細(xì)胞或產(chǎn)物濃度 較高低低植物細(xì)胞培養(yǎng)：是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體植物細(xì)胞培養(yǎng)：是指在離體條件下將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來培養(yǎng)基中，將組織振蕩分散成游離的懸浮細(xì)胞，通

4、過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖來獲得大量細(xì)胞群體的方法。獲得大量細(xì)胞群體的方法。第一節(jié)第一節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器生產(chǎn)方式收獲時間紫草寧濃度（%干重）完整植物2-3年1-2植物細(xì)胞培養(yǎng)21天14表表1 1 植物細(xì)胞培養(yǎng)和從完整的植物生產(chǎn)紫草寧的比較植物細(xì)胞培養(yǎng)和從完整的植物生產(chǎn)紫草寧的比較1細(xì)胞培養(yǎng)液的特性細(xì)胞培養(yǎng)液的特性 植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大50100倍，體積大約要膨大倍，體積大約要膨大105106倍，在培養(yǎng)倍，在培養(yǎng)液中所占體積可高達(dá)液中所占體積可高達(dá)4050%，而酵母一般只有，而酵母一般只有5%左右，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)左右，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液的黏度可增大液的黏度可

5、增大30倍。倍。2植物細(xì)胞培養(yǎng)中的傳氧狀態(tài)植物細(xì)胞培養(yǎng)中的傳氧狀態(tài) 所有植物細(xì)胞都是好氧性的，但不需太高的傳氧速率。所有植物細(xì)胞都是好氧性的，但不需太高的傳氧速率。植物細(xì)胞由植物細(xì)胞由于體積較大，比表面積比微生物小得多，耗氧速率一般也比微生物小得多于體積較大，比表面積比微生物小得多，耗氧速率一般也比微生物小得多，如煙草細(xì)胞培養(yǎng)中最大值為，如煙草細(xì)胞培養(yǎng)中最大值為0.6mmol/g.h，而微生物則在，而微生物則在1.58 mmol/g.h。3. 培養(yǎng)液中植物細(xì)胞的特性培養(yǎng)液中植物細(xì)胞的特性 植物植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大；植物細(xì)胞通常以細(xì)胞數(shù)在細(xì)胞比微生物細(xì)胞大；植物細(xì)胞通常以細(xì)胞數(shù)在2-200之間

6、、直之間、直徑為徑為2mm左右的非均相集合細(xì)胞團(tuán)方式存在；植物細(xì)胞左右的非均相集合細(xì)胞團(tuán)方式存在；植物細(xì)胞纖維素細(xì)胞壁纖維素細(xì)胞壁抗剪切能抗剪切能力弱。力弱。 一、植物細(xì)胞培養(yǎng)的過程特點一、植物細(xì)胞培養(yǎng)的過程特點1、懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器、懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器l機(jī)械攪拌式反應(yīng)器：機(jī)械攪拌式反應(yīng)器：l非機(jī)械攪拌式（氣體攪拌式）反應(yīng)器：非機(jī)械攪拌式（氣體攪拌式）反應(yīng)器：2、固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器、固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器l填充床反應(yīng)器：填充床反應(yīng)器：l流化床反應(yīng)器：流化床反應(yīng)器：l膜反應(yīng)器：膜反應(yīng)器：二、植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器二、植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器大規(guī)模植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器1.1 機(jī)械攪拌式

7、反應(yīng)器機(jī)械攪拌式反應(yīng)器l機(jī)械攪拌式反應(yīng)器是最傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵裝置，同樣也可用于植物細(xì)機(jī)械攪拌式反應(yīng)器是最傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵裝置，同樣也可用于植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。胞懸浮培養(yǎng)。l機(jī)械攪拌式反應(yīng)器已成功地用于許多細(xì)胞的培養(yǎng)中，能夠獲得較高的溶氧系數(shù)，機(jī)械攪拌式反應(yīng)器已成功地用于許多細(xì)胞的培養(yǎng)中，能夠獲得較高的溶氧系數(shù)，而且也具有反應(yīng)器內(nèi)的溫度、而且也具有反應(yīng)器內(nèi)的溫度、pHpH、 溶氧及營養(yǎng)物濃度較其他反應(yīng)器更易溶氧及營養(yǎng)物濃度較其他反應(yīng)器更易控制等優(yōu)點；控制等優(yōu)點；l但其缺點在于剪切力大，易對植物細(xì)胞造成較大損傷，對次級代謝產(chǎn)物的但其缺點在于剪切力大，易對植物細(xì)胞造成較大損傷，對次級代謝產(chǎn)物的合成也會

8、產(chǎn)生影響。能耗大。機(jī)械攪拌需要相對比較復(fù)雜的密封，這些密合成也會產(chǎn)生影響。能耗大。機(jī)械攪拌需要相對比較復(fù)雜的密封，這些密封使用不當(dāng)容易產(chǎn)生泄漏造成染菌使細(xì)胞培養(yǎng)失敗。封使用不當(dāng)容易產(chǎn)生泄漏造成染菌使細(xì)胞培養(yǎng)失敗。 1、懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)生物反應(yīng)器反應(yīng)器結(jié)構(gòu)：反應(yīng)器結(jié)構(gòu)： 與微生物通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐相似與微生物通風(fēng)攪拌發(fā)酵罐相似設(shè)計要點：設(shè)計要點： 要選用該類反應(yīng)器，除需要篩選出抗剪切力的要選用該類反應(yīng)器，除需要篩選出抗剪切力的細(xì)胞系外，對反應(yīng)器結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)改造，尤其細(xì)胞系外，對反應(yīng)器結(jié)構(gòu)進(jìn)行適當(dāng)改造，尤其是攪拌漿的結(jié)構(gòu)和類型的改進(jìn)，使其具有緩和是攪拌漿的結(jié)構(gòu)和類型的改進(jìn)，使其具有緩和的、但

9、又充分的攪拌效果。的、但又充分的攪拌效果。六葉羅式攪拌器實物圖六葉羅式攪拌器實物圖羅氏攪拌器：在較低的攪拌速度下有較好的混合效果。羅式攪拌器羅氏攪拌器：在較低的攪拌速度下有較好的混合效果。羅式攪拌器有六葉攪拌器和四葉攪拌器，一般常用六葉攪拌器。有六葉攪拌器和四葉攪拌器，一般常用六葉攪拌器。攪拌器的個數(shù)取決于反應(yīng)器的高徑比，最低端的攪拌器離罐底的距離通常攪拌器的個數(shù)取決于反應(yīng)器的高徑比，最低端的攪拌器離罐底的距離通常為反應(yīng)器直徑的三分之一，第二個攪拌器與第一個攪拌器的距離約為攪拌為反應(yīng)器直徑的三分之一，第二個攪拌器與第一個攪拌器的距離約為攪拌器直徑的器直徑的1.21.2倍，余此類推。倍，余此類推

10、。后來，有人使用錨式攪拌器和螺旋式攪拌器進(jìn)行植物細(xì)胞的培養(yǎng)，也取后來，有人使用錨式攪拌器和螺旋式攪拌器進(jìn)行植物細(xì)胞的培養(yǎng)，也取得了較好的效果。一般認(rèn)為螺旋式攪拌器效果最優(yōu)。得了較好的效果。一般認(rèn)為螺旋式攪拌器效果最優(yōu)。 錨式攪拌器和螺旋攪拌器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器錨式攪拌器和螺旋攪拌器植物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 吸筒式攪拌器和帆式攪拌器也常用于植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，其結(jié)構(gòu)如下圖所吸筒式攪拌器和帆式攪拌器也常用于植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，其結(jié)構(gòu)如下圖所示。吸筒式攪拌器的結(jié)構(gòu)原理在本章動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中會有詳細(xì)介紹，帆式攪示。吸筒式攪拌器的結(jié)構(gòu)原理在本章動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中會有詳細(xì)介紹，帆式攪拌器結(jié)構(gòu)相對簡單，

11、由四片較大的攪拌葉組成。這兩種攪拌在使用時轉(zhuǎn)速都不高，拌器結(jié)構(gòu)相對簡單，由四片較大的攪拌葉組成。這兩種攪拌在使用時轉(zhuǎn)速都不高，一般在一般在30308080轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分。分。 吸管式攪拌器和帆式攪拌器吸管式攪拌器和帆式攪拌器帶帆形攪拌器的連續(xù)灌注系統(tǒng)培養(yǎng)反應(yīng)器攪拌槳是用尼龍絲編織帶制成帆形，攪拌軸用磁力驅(qū)動旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)攪拌槳是用尼龍絲編織帶制成帆形，攪拌軸用磁力驅(qū)動旋轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為速為2050r/min，氧氣通過插入溶液中的硅膠管擴(kuò)散到培養(yǎng)液內(nèi)，以維，氧氣通過插入溶液中的硅膠管擴(kuò)散到培養(yǎng)液內(nèi)，以維持培養(yǎng)液內(nèi)一定的溶解氧水平持培養(yǎng)液內(nèi)一定的溶解氧水平。1.2 非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器非機(jī)械攪拌式反應(yīng)器l優(yōu)點：優(yōu)

12、點： 由于沒有活動的攪拌裝置，剪切力小，對細(xì)胞損傷小，而且容易實現(xiàn)長期由于沒有活動的攪拌裝置，剪切力小，對細(xì)胞損傷小，而且容易實現(xiàn)長期無菌培養(yǎng)。無菌培養(yǎng)。 l缺點：操作彈性小，低氣速時尤其在培養(yǎng)后期植物細(xì)胞密度較高時，混合效果較差。缺點：操作彈性小，低氣速時尤其在培養(yǎng)后期植物細(xì)胞密度較高時，混合效果較差。如果提高通氣量，又會產(chǎn)生大量泡沫，氣泡破裂時產(chǎn)生的剪切力會傷害正在生長的細(xì)如果提高通氣量，又會產(chǎn)生大量泡沫，氣泡破裂時產(chǎn)生的剪切力會傷害正在生長的細(xì)胞，因此只適用于對剪切力不敏感的細(xì)胞培養(yǎng)，此時一種較為有效的方法是添加消泡胞，因此只適用于對剪切力不敏感的細(xì)胞培養(yǎng)，此時一種較為有效的方法是添加消

13、泡劑。此外，對這類反應(yīng)器缺乏足夠的經(jīng)驗，放大過程也不如機(jī)械攪拌式反應(yīng)器成熟。劑。此外，對這類反應(yīng)器缺乏足夠的經(jīng)驗，放大過程也不如機(jī)械攪拌式反應(yīng)器成熟。通入空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡式反應(yīng)器和氣升式通入空氣作通氣和攪拌的生物反應(yīng)器，主要有鼓泡式反應(yīng)器和氣升式反應(yīng)器。反應(yīng)器。鼓泡式反應(yīng)器：細(xì)胞及培養(yǎng)液裝在反應(yīng)器中，反應(yīng)器的高徑比通常為鼓泡式反應(yīng)器：細(xì)胞及培養(yǎng)液裝在反應(yīng)器中，反應(yīng)器的高徑比通常為46。氣體通過底部的氣體分配器鼓入，分散成氣泡沿著液體上升，同時攪氣體通過底部的氣體分配器鼓入，分散成氣泡沿著液體上升，同時攪動液體以增加傳質(zhì)速率。一般在塔內(nèi)設(shè)有擋板，以減少液體返混。為動液體以

14、增加傳質(zhì)速率。一般在塔內(nèi)設(shè)有擋板，以減少液體返混。為加強(qiáng)液體循環(huán)和傳遞反應(yīng)熱，可設(shè)外循環(huán)管和塔外換熱器。加強(qiáng)液體循環(huán)和傳遞反應(yīng)熱，可設(shè)外循環(huán)管和塔外換熱器。 2、固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器、固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器 固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指通過利用化學(xué)或物理的方法，將細(xì)胞固定固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指通過利用化學(xué)或物理的方法，將細(xì)胞固定在某一支撐物上，比如固體顆?；蛘吣ど?，然后加以培養(yǎng)。用這種方法在某一支撐物上，比如固體顆?；蛘吣ど?，然后加以培養(yǎng)。用這種方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)不僅減少了細(xì)胞受到剪切力傷害的可能性，而且由于細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)不僅減少了細(xì)胞受到剪切力傷害的可能性，而且由于細(xì)胞固定在某種支撐物上，可以很容易

15、與培養(yǎng)液分開，既有利于細(xì)胞產(chǎn)物的固定在某種支撐物上，可以很容易與培養(yǎng)液分開，既有利于細(xì)胞產(chǎn)物的分離，又使細(xì)胞能夠反復(fù)培養(yǎng)利用，降低了生產(chǎn)成本。分離，又使細(xì)胞能夠反復(fù)培養(yǎng)利用，降低了生產(chǎn)成本。2.1 填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器2.2 流化床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器2.3 膜生物反應(yīng)器膜生物反應(yīng)器l優(yōu)點：優(yōu)點： 單位體積固定細(xì)胞量大。單位體積固定細(xì)胞量大。l缺點：缺點： 混合效率低，使必要的氧傳遞、混合效率低，使必要的氧傳遞、pHpH值、溫度值、溫度 的控制和產(chǎn)物的排泄很困難；的控制和產(chǎn)物的排泄很困難； 填充床中顆?；蛑С治锏钠扑闀枞后w流填充床中顆?；蛑С治锏钠扑闀枞后w流 動；動； 用于固

16、定的膠粒在高壓下容易變形，會導(dǎo)致用于固定的膠粒在高壓下容易變形，會導(dǎo)致 填充床阻塞。填充床阻塞。2.1 填充床反應(yīng)器填充床反應(yīng)器l填充床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞固定于支持物（膠填充床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞固定于支持物（膠粒、泡沫、金屬顆?；蛳噙B的網(wǎng)）表面或內(nèi)部粒、泡沫、金屬顆?；蛳噙B的網(wǎng)）表面或內(nèi)部，細(xì)胞固定支持物顆粒堆疊成床，培養(yǎng)基在床，細(xì)胞固定支持物顆粒堆疊成床，培養(yǎng)基在床層間流動，通過培養(yǎng)液流動實現(xiàn)混合和傳質(zhì)。層間流動，通過培養(yǎng)液流動實現(xiàn)混合和傳質(zhì)。2.2 流化床生物反應(yīng)器流化床生物反應(yīng)器l流化床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞包裹于膠粒、金屬或流化床生物反應(yīng)器中，細(xì)胞包裹于膠粒、金屬或泡沫顆粒中成為固定化植物

17、細(xì)胞，通過培養(yǎng)液自泡沫顆粒中成為固定化植物細(xì)胞，通過培養(yǎng)液自下而上在反應(yīng)器內(nèi)的流動使固定化細(xì)胞呈流態(tài)化下而上在反應(yīng)器內(nèi)的流動使固定化細(xì)胞呈流態(tài)化懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)液與植物細(xì)胞充分接觸，混合程懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)液與植物細(xì)胞充分接觸，混合程度高，傳質(zhì)傳熱效果好。度高，傳質(zhì)傳熱效果好。l流化床生物反應(yīng)器缺點在于：流化床生物反應(yīng)器缺點在于： 剪切力和顆粒碰撞會破壞固定化細(xì)胞；剪切力和顆粒碰撞會破壞固定化細(xì)胞； 流體動力學(xué)復(fù)雜使其放大困難。流體動力學(xué)復(fù)雜使其放大困難。2.3 膜生物反應(yīng)器膜生物反應(yīng)器l膜式反應(yīng)器是近年來生物反應(yīng)器研究的重要領(lǐng)域，也是近年來廣泛使用的一種固膜式反應(yīng)器是近年來生物反應(yīng)器研究的重要領(lǐng)域

18、，也是近年來廣泛使用的一種固定化反應(yīng)器。膜固定化是采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細(xì)胞。營養(yǎng)定化反應(yīng)器。膜固定化是采用具有一定孔徑和選擇透性的膜固定植物細(xì)胞。營養(yǎng)物質(zhì)可以通過膜滲透到細(xì)胞中，細(xì)胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中。物質(zhì)可以通過膜滲透到細(xì)胞中，細(xì)胞產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物通過膜釋放到培養(yǎng)液中。l膜生物反應(yīng)器最常用的是中空纖維和螺旋式卷繞反應(yīng)器。膜生物反應(yīng)器最常用的是中空纖維和螺旋式卷繞反應(yīng)器。 中空纖維反應(yīng)器：中空纖維反應(yīng)器： 中空纖維是用聚礬或聚丙烯制成。管壁的厚度約中空纖維是用聚礬或聚丙烯制成。管壁的厚度約5075um，直徑，直徑200um，管，管壁是半透膜，能夠透過各種

19、營養(yǎng)物質(zhì)，但是細(xì)胞卻不能穿過。壁是半透膜，能夠透過各種營養(yǎng)物質(zhì)，但是細(xì)胞卻不能穿過。 一個培養(yǎng)筒內(nèi)由數(shù)千根中空纖維組成，然后封存在特制的圓筒內(nèi)，這一個培養(yǎng)筒內(nèi)由數(shù)千根中空纖維組成，然后封存在特制的圓筒內(nèi)，這樣就形成了樣就形成了2個空間，纖維管內(nèi)為個空間，纖維管內(nèi)為“內(nèi)室內(nèi)室”，管間隙為，管間隙為“外室外室”。 細(xì)胞固定在中空纖維外壁和反應(yīng)器外殼內(nèi)壁之間，或者說，細(xì)胞填充在反應(yīng)細(xì)胞固定在中空纖維外壁和反應(yīng)器外殼內(nèi)壁之間，或者說，細(xì)胞填充在反應(yīng)器內(nèi)，多束中空纖維從中穿過器內(nèi)，多束中空纖維從中穿過 。營養(yǎng)物質(zhì)從中空纖維流過，通過中空纖維膜滲透。營養(yǎng)物質(zhì)從中空纖維流過，通過中空纖維膜滲透到細(xì)胞層中。到

20、細(xì)胞層中。 （細(xì)胞保留在管外，基質(zhì)走管內(nèi)）（細(xì)胞保留在管外，基質(zhì)走管內(nèi)）螺旋式卷繞反應(yīng)器：在兩層平板膜中間夾著一層細(xì)胞，然后將夾著細(xì)胞的兩層螺旋式卷繞反應(yīng)器：在兩層平板膜中間夾著一層細(xì)胞，然后將夾著細(xì)胞的兩層平板膜卷繞成螺旋狀。在卷繞過程中，膜與膜之間用支撐物隔開一定的空間，平板膜卷繞成螺旋狀。在卷繞過程中，膜與膜之間用支撐物隔開一定的空間，細(xì)胞營養(yǎng)液被引入到這個空間里，其中的一部分通過膜進(jìn)入細(xì)胞層，維持細(xì)胞細(xì)胞營養(yǎng)液被引入到這個空間里，其中的一部分通過膜進(jìn)入細(xì)胞層，維持細(xì)胞生長，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也通過膜滲透到營養(yǎng)液中，被下游過程回收。生長，細(xì)胞的代謝產(chǎn)物也通過膜滲透到營養(yǎng)液中，被下游過程回收。

21、 1、貼壁培養(yǎng)：大多數(shù)動物細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量、貼壁培養(yǎng)：大多數(shù)動物細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪鋪展，然后開始有絲分裂，并很快進(jìn)入對數(shù)生長期。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。滿培養(yǎng)表面，并形成致密的細(xì)胞單層。第二節(jié)第二節(jié) 動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器一、動物細(xì)胞培養(yǎng)方法：一、動物細(xì)胞培養(yǎng)方法：貼壁的單核細(xì)胞貼壁的單核細(xì)胞使用過的舊瓶子培養(yǎng)使用過的舊瓶子培養(yǎng)BHK

22、21 細(xì)胞細(xì)胞時細(xì)胞更容易發(fā)生脫落，而使用新瓶時細(xì)胞更容易發(fā)生脫落，而使用新瓶子進(jìn)行培養(yǎng)時細(xì)胞能良好生長。子進(jìn)行培養(yǎng)時細(xì)胞能良好生長。l最初采用滾瓶培養(yǎng)。最初采用滾瓶培養(yǎng)。lVan Wezel 在在1967年開發(fā)了一種微載體系統(tǒng)年開發(fā)了一種微載體系統(tǒng)培養(yǎng)壁依賴性細(xì)胞。培養(yǎng)壁依賴性細(xì)胞。l微載體是直徑為微載體是直徑為60250um的微珠。的微珠。l細(xì)胞貼附于微載體上，懸浮于培養(yǎng)基中，逐細(xì)胞貼附于微載體上，懸浮于培養(yǎng)基中，逐漸生長成單層，具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的漸生長成單層，具有單層培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點。優(yōu)點。玻璃微珠玻璃微珠制備微載體的材料主要有：制備微載體的材料主要有： 葡聚糖葡聚糖（DEAE

23、-Sephadex A50及及A25） 塑料塑料 明膠明膠 玻璃玻璃 纖維素纖維素2、懸浮培養(yǎng)：少數(shù)懸浮生長型動物細(xì)胞在離體培養(yǎng)時不需要、懸浮培養(yǎng)：少數(shù)懸浮生長型動物細(xì)胞在離體培養(yǎng)時不需要 附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長。適用于一些來源附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長。適用于一些來源 于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞以及某些轉(zhuǎn)化細(xì)于血液、淋巴組織的細(xì)胞，許多腫瘤細(xì)胞以及某些轉(zhuǎn)化細(xì) 胞等非貼壁依賴性細(xì)胞胞等非貼壁依賴性細(xì)胞 。 動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上建立起動物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上建立起 來的，但由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不能耐受劇烈攪拌和來的，但由于動物

24、細(xì)胞沒有細(xì)胞壁，不能耐受劇烈攪拌和 通氣時產(chǎn)生的剪切力，因而又與經(jīng)典的發(fā)酵不同。通氣時產(chǎn)生的剪切力，因而又與經(jīng)典的發(fā)酵不同。小規(guī)模懸浮培養(yǎng)小規(guī)模懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)瓶懸浮培養(yǎng)瓶3、固定化培養(yǎng)：是指采用吸附（固體吸附劑）、共價貼附（與固、固定化培養(yǎng)：是指采用吸附（固體吸附劑）、共價貼附（與固相載體結(jié)合）、共價交連（用試劑處理使細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)相載體結(jié)合）、共價交連（用試劑處理使細(xì)胞間形成橋而絮結(jié)）、包埋（將細(xì)胞包埋在多孔材料內(nèi)）等方法將細(xì)胞固定在支）、包埋（將細(xì)胞包埋在多孔材料內(nèi)）等方法將細(xì)胞固定在支持物上，或?qū)⒓?xì)胞嵌入微囊或高分子聚合物的網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行培養(yǎng)持物上，或?qū)⒓?xì)胞嵌入微囊或高分子聚合物的網(wǎng)絡(luò)

25、中進(jìn)行培養(yǎng)。該方法對貼壁依賴性細(xì)胞與非貼壁依賴性細(xì)胞均適用。該方法對貼壁依賴性細(xì)胞與非貼壁依賴性細(xì)胞均適用。二、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式二、細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式l1、分批式操作、分批式操作l2、流加式操作、流加式操作l3、半連續(xù)式操作、半連續(xù)式操作l4、連續(xù)操作、連續(xù)操作l5、灌注培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)灌注培養(yǎng)1通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器通氣攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器 通氣攪拌式動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器顧名思義就是既有機(jī)械攪拌又有通氣裝通氣攪拌式動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器顧名思義就是既有機(jī)械攪拌又有通氣裝置，是在微生物發(fā)酵反應(yīng)器基礎(chǔ)上改進(jìn)的一類細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，適用于懸浮置，是在微生物發(fā)酵反應(yīng)器基礎(chǔ)上改進(jìn)的一類細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器

26、，適用于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)或者生長在微載球的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。機(jī)械攪拌和通氣形式的不同細(xì)胞的培養(yǎng)或者生長在微載球的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)。機(jī)械攪拌和通氣形式的不同產(chǎn)生了各種各樣的通氣攪拌反應(yīng)器。其中比較典型的是籠式通氣攪拌反應(yīng)器。產(chǎn)生了各種各樣的通氣攪拌反應(yīng)器。其中比較典型的是籠式通氣攪拌反應(yīng)器。三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器三、動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)反應(yīng)器1.1 籠式通氣攪拌器籠式通氣攪拌器l氣泡用絲網(wǎng)隔開，避免在向培養(yǎng)基通氣時損傷細(xì)胞。同時在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)氣泡用絲網(wǎng)隔開，避免在向培養(yǎng)基通氣時損傷細(xì)胞。同時在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時，微載體不會被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中。時，微載體不會被由于通氣所產(chǎn)生的

27、泡沫滯留在氣液界面中?；\式攪拌器剖面圖籠式攪拌器剖面圖l優(yōu)點：優(yōu)點：避免向培養(yǎng)基直接通氣時氣泡損傷細(xì)胞，避免向培養(yǎng)基直接通氣時氣泡損傷細(xì)胞，剪切力小。剪切力小。沒有移動部件，沒有移動部件，密封好。密封好。l缺點：缺點：氧傳遞系數(shù)小氧傳遞系數(shù)小，不能滿足高密度細(xì)胞的耗氧要求；氣路系統(tǒng)不能就地滅，不能滿足高密度細(xì)胞的耗氧要求；氣路系統(tǒng)不能就地滅菌。菌。 反應(yīng)器適用范圍反應(yīng)器適用范圍 懸浮培養(yǎng)：非貼壁依賴性細(xì)胞和貼壁于微載體的貼壁細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)：非貼壁依賴性細(xì)胞和貼壁于微載體的貼壁細(xì)胞。2氣升動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器氣升動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器與微生物發(fā)酵及植物細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)相同。與微生物發(fā)酵及植物細(xì)胞培

28、養(yǎng)的反應(yīng)器結(jié)構(gòu)相同。優(yōu)點：優(yōu)點：l結(jié)構(gòu)簡單，避免使用軸承而造成細(xì)胞培養(yǎng)的污染；結(jié)構(gòu)簡單，避免使用軸承而造成細(xì)胞培養(yǎng)的污染；l傳質(zhì)性能好，尤其是氧的傳遞效率高；傳質(zhì)性能好，尤其是氧的傳遞效率高；產(chǎn)生的湍動溫和，剪切力小，循環(huán)量大，使細(xì)胞營養(yǎng)成分均布于培養(yǎng)基中。產(chǎn)生的湍動溫和，剪切力小，循環(huán)量大，使細(xì)胞營養(yǎng)成分均布于培養(yǎng)基中。氣升式反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖氣升式反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖 1 1培養(yǎng)液上升區(qū)培養(yǎng)液上升區(qū) 2 2培養(yǎng)液下降區(qū)培養(yǎng)液下降區(qū) 3 3氣液氣液分配板分配板 4 4液體上升口液體上升口 5 5氣體導(dǎo)入口氣體導(dǎo)入口 6 6液體引入口液體引入口 7 7氣液分離區(qū)氣液分離區(qū) 8 8導(dǎo)流筒導(dǎo)流筒 9 9

29、液體導(dǎo)入?yún)^(qū)液體導(dǎo)入?yún)^(qū)3中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器l培養(yǎng)筒纖維管內(nèi)為培養(yǎng)筒纖維管內(nèi)為“內(nèi)室內(nèi)室”，灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長，管間，灌流無血清培養(yǎng)液供細(xì)胞生長，管間隙為隙為“外室外室”，接種細(xì)胞就貼附于，接種細(xì)胞就貼附于“外室外室”的管壁上，并吸取從的管壁上，并吸取從“內(nèi)室內(nèi)室”滲透來的營養(yǎng)，迅速生長繁殖。滲透來的營養(yǎng)，迅速生長繁殖。l由于細(xì)胞分泌物的分子量大而無法透過半透膜到由于細(xì)胞分泌物的分子量大而無法透過半透膜到“內(nèi)室內(nèi)室”，只能留在，只能留在“外室外室”不斷被濃縮，當(dāng)收集產(chǎn)物時，只要把管間不斷被濃縮，當(dāng)收集產(chǎn)物時，只要把管間“外室外室”的總出口打開就可獲取產(chǎn)的總出口打開

30、就可獲取產(chǎn)物。而代謝物由于分子量小，可以從管壁滲透到物。而代謝物由于分子量小，可以從管壁滲透到“內(nèi)室內(nèi)室”，最后從，最后從“內(nèi)室內(nèi)室”總出口排出，不會對總出口排出，不會對“外室外室”的細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。的細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。一種中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖一種中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖 1中空纖維束；中空纖維束； 2（2）反應(yīng)器外殼；反應(yīng)器外殼；3（3）中空纖維束固定板；中空纖維束固定板； 4（4）中空纖維內(nèi)腔進(jìn)出口；中空纖維內(nèi)腔進(jìn)出口；5（5）中空纖維外表面進(jìn)出口；中空纖維外表面進(jìn)出口； 6（6）密封板密封板 l用途：用途： 即可培養(yǎng)懸浮生長細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。即可培養(yǎng)懸浮

31、生長細(xì)胞，又可培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。4微囊培養(yǎng)系統(tǒng)微囊培養(yǎng)系統(tǒng)l美國美國Damon Biotech 公司創(chuàng)建。公司創(chuàng)建。l微囊技術(shù)：把生物活性物質(zhì)、完整的活細(xì)胞或組織包在薄的半透膜中。微囊技術(shù)：把生物活性物質(zhì)、完整的活細(xì)胞或組織包在薄的半透膜中。l微囊的制備：微囊的制備： 在無菌條件下，將活性細(xì)胞或生物活性成分懸浮在在無菌條件下，將活性細(xì)胞或生物活性成分懸浮在1.4%海藻酸鈉溶液海藻酸鈉溶液中；中； 通過特制的成滴器將含有細(xì)胞的懸液形成一定大小的小滴，滴入通過特制的成滴器將含有細(xì)胞的懸液形成一定大小的小滴，滴入CaCl2中，中，形成內(nèi)含活性細(xì)胞或生物活性成分的凝膠小珠；形成內(nèi)含活性細(xì)胞或生物活性成分的凝膠小珠； 再用半透膜材料包被，形成堅韌多孔可通透的外膜再用半透膜材料包被，形成堅韌多孔可通透的外膜; 重新液化膠化物使其流出，活性細(xì)胞或生物活性成分則留在多孔膜內(nèi)