影響禽流感病毒致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的研究進(jìn)展.docx

1、第36卷第2期2014年2月中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineVol.36,No.2Feb.2014doi:10.3969/j.issn.1008-0589.2014.02.19影響禽流感病毒致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的研究進(jìn)展徐曉龍，包紅梅，陳化蘭，王秀榮*(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物流感重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150001)中圖分類號(hào)：S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：10080589(2014)02.016504A型流感病毒根據(jù)其血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不

2、同分為不同亞型，目前已鑒定出有17種HA亞型和10種NA亞型。禽流感(AvianInfluenza,AI)是由A型流感病毒引起的急性或慢性呼吸道傳染病，根據(jù)臨床癥狀不同劃分為高致病性禽流感(Highlypathogenicavianinfluenza,HPAI)和低致病性禽流感(Lowpathogenicavianinfluenza,LPAI)OHPAI以急性死亡、高致死率和傳染性強(qiáng)為特征，被OIE列為需要實(shí)時(shí)通報(bào)的傳染病。禽流感病毒(AIV)為分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，由8個(gè)基因節(jié)段組成，其基因組編碼1112種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白：HA、NA、基質(zhì)蛋白(Ml)、離子通道蛋白(M2)、聚合酶復(fù)合

3、體(PB1、PB2和PA),核蛋白(NP),核輸出蛋白(NEP,即NS2);非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、PB1-F2o哈爾濱獸醫(yī)研究所首次在國(guó)內(nèi)分離到H5N1亞型HPAI病毒(HPAIV)后，香港發(fā)生H5N1亞型HPAIV感染并導(dǎo)致人死亡的事件，為全球首例AIV突破種間屏障直接感染人的現(xiàn)象。一般認(rèn)為，AIV感染人類是由不同亞型AIV經(jīng)豬體混合而得以重組，獲得結(jié)合人類呼吸道細(xì)胞的能力。研究表明，該次流行病毒株似乎未經(jīng)過(guò)重組，而是部分氨基酸位點(diǎn)的突變導(dǎo)致病毒跨種間傳播及致病性增強(qiáng)。本文就影響AIV致病性及傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行如下綜述。1HA與AIV致病性和傳播的關(guān)系HA是AIV囊膜纖突的主要成分，其主

4、要功能是結(jié)合宿主唾液酸類細(xì)胞受體，輔助病毒吸附宿主細(xì)胞，完成內(nèi)Correspondingauthor吞和脫殼。HA的影響主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面。1.1 HA裂解位點(diǎn)處氨基酸序列對(duì)致病性的影響AIV借助HA吸附于細(xì)胞膜，引起感染，其多個(gè)堿性氨基酸裂解位點(diǎn)對(duì)AIV致病性起著決定性作用。病毒囊膜與細(xì)胞膜融合時(shí)HA蛋白裂解為HA1和HA2,HA的裂解位點(diǎn)不同影響了流感病毒的組織嗜性。HPAIV的HA裂解位點(diǎn)處存在連續(xù)4個(gè)以上堿性氨基酸(-RRRR-),可以被多種蛋白酶所裂解，使其感染宿主并在不同組織細(xì)胞中增殖，進(jìn)而導(dǎo)致宿主的全身感染甚至死亡，而LPAIV在HA裂解位點(diǎn)中一般只有單個(gè)堿性氨基酸(R)，這

5、種結(jié)構(gòu)的HA蛋白只能被存在于呼吸道和消化道內(nèi)的精氨酸特異蛋白酶識(shí)別并裂解，因而病毒增殖只發(fā)生在呼吸道和消化道等局部，從而導(dǎo)致溫和性感染。1.2 HA蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響香港流感患者體中分離到的AIV,HA蛋白226位點(diǎn)突變?yōu)镸后，HA蛋白對(duì)唾液酸a2,3.半乳糖及唾液酸a-2,6.半乳糖均具有結(jié)合能力，這也是AIV可以直接感染人的原因之一。進(jìn)一步研究表明AIV的HA蛋白第226位氨基酸起關(guān)鍵作用，HA蛋白226位常為Q,228位常為G,而人流感病毒226位為L(zhǎng),228位為S,如226位為Q和228位為G,則易與唾液酸a2,3.半乳糖結(jié)合，若226位為L(zhǎng)和228位為S則易與唾液酸a.2

6、,6.半乳糖結(jié)合。該發(fā)現(xiàn)有助于進(jìn)一步研究AIV突破種間屏障直接感染人的機(jī)制。收稿日期：2012-11-28基金項(xiàng)目：十二五農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技課題(2012AA101303)；社會(huì)公益研究專項(xiàng)計(jì)劃(200903055)作者簡(jiǎn)介：徐曉龍(1989-),男，山東青島人，碩士研究生，主要從事禽流感分子診斷方向研究.*通信作者：E-mail:wxr1-3HA蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)傳播的影響HA能夠識(shí)別a-2,3半乳糖連接的唾液酸(SAa-2,3.Gal)和a-2,6半乳糖連接的唾液酸(SAa-2,6-Gal)兩種類型受體。人的上呼吸道上皮細(xì)胞表面主要含有SA.2,6.Gal,而在禽類呼吸道細(xì)胞及馬的氣管和鴨的

7、腸道主要含有SA-2,3-Gal,人流感病毒與SAa-2,6-Gal受體結(jié)合，AIV則易與SAa2,3.Gal受體結(jié)合，這一生物學(xué)特性形成了人-禽流感之間的種間屏障。通過(guò)病毒A/DK/GX/35/H5N1對(duì)豚鼠水平傳播能力的影響研究顯示，當(dāng)HA發(fā)生A】叮點(diǎn)突變時(shí)，病毒由同時(shí)識(shí)別SAa-2,3-Gal和SAa-2,6-Gal受體轉(zhuǎn)變?yōu)橹荒茏R(shí)別SAa-2,3.Gal受體，受體結(jié)合特性的變化導(dǎo)致該病毒不能在豚鼠間水平傳播。目前HPAIV還不能在人類之間傳播，Imai等利用H5HA/H1N1重組病毒，發(fā)現(xiàn)N158D、Q22%、NK和T318I4個(gè)位點(diǎn)的同時(shí)突變使得病毒具有在雪貂之間傳播的能力，還有研究

8、表明在雪貂間可以通過(guò)空氣傳播的H5N1病毒其H,03Y.T,56A.Q222!.和GS4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生了突變。最新發(fā)現(xiàn)為控制AIV在人類之間大肆傳播具有重要意義（表Do2NA蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性和傳播的影響NA是AIV囊膜上除HA之外的另一種重要糖蛋白，在病毒吸附宿主細(xì)胞時(shí)，能夠識(shí)別細(xì)胞受體末端的唾液酸殘基并介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞。Hulse等利用反向遺傳技術(shù)以A/CK/HK/YU562/01/H5N1的NA基因替換A/GD/HK/437-10/99ZH5N1的NA基因，顯示重組病毒對(duì)雞的致病性明顯增強(qiáng)，表明NA蛋白對(duì)病毒的致病性具有較大影響。NA的頸部是連接頭部的酶活性中心和跨膜結(jié)構(gòu)域以及細(xì)胞質(zhì)結(jié)

9、構(gòu)域的一段結(jié)構(gòu)。研究表明，NA頸部的長(zhǎng)度與病毒跨種傳播和致病力相關(guān)。近年研究表明H5N1病毒中NA頸部4869位缺失的分離率呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，而且短頸NA的H5N1病毒更易于表現(xiàn)高致病性。因此，推測(cè)這種缺失模式的短頸NA可能是水禽AIV傳播到陸生家禽，并對(duì)其逐漸產(chǎn)生適應(yīng)性的一個(gè)重要分子標(biāo)記。3聚合酶復(fù)合體與AIV致病性和傳播的關(guān)系A(chǔ)IV聚合酶復(fù)合體由PB1、PB2和PA組成，3種蛋白以非共價(jià)鍵緊密結(jié)合形成異源三聚復(fù)合體，共同行使病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制功能。3.1PB1蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響PB1蛋白具有聚合酶活性，其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐漸延長(zhǎng)。此外，PB1蛋白上的某些氨

10、基酸位點(diǎn)能夠影響AIV的致病性。在A/AH/2/05/H5N1和A/CK/SC/81/05/H5N1兩株模式病毒株背景下，Zhong等發(fā)現(xiàn)PB1蛋白、6知和v祁I(lǐng)的突變，在很大程度上增強(qiáng)病毒對(duì)模型小鼠的致病性，同時(shí)反方向的突變也能夠極大地減弱病毒的致病性，兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變作用則更加明顯。2001年研究表明，在大部分甲型流感病毒中從PB1基因的+1閱讀框（ORF）開始翻譯產(chǎn)生新的病毒蛋白（PB1.F2）,該蛋白定位在線粒體，并通過(guò)兩個(gè)線粒體蛋白的相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，H5N1亞型病毒PB1-F2蛋白的66位S與N相比，S對(duì)鼠的致病性更強(qiáng)。當(dāng)PB1-F2蛋白發(fā)生S%D突變時(shí)，病毒的致病性

11、減弱，表明PB1-F2蛋白也是影響AIV致病性的重要因子的。還有研究表明，PB1-F2蛋白與PB1蛋白相互作用，能夠影響蛋白在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的分布，這也可能影響AIV的毒力吧PB2蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響PB2亞基能夠識(shí)別細(xì)胞mRNA的5,端的帽子結(jié)構(gòu)，并具有37,的核酸內(nèi)切活性。研究顯示PB2基因能夠影響流感病毒的宿主范圍。Subbarao等將分離到的1株AIV的PB2基因和人流感病毒的另外7個(gè)基因進(jìn)行重組獲得1株重組病毒，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，禽源的PB2基因改變了人流感病毒的宿主范圍，進(jìn)一步研究顯示，PB2的627位氨基酸在A型流感病毒宿主范圍中起決定作用。Hatta等應(yīng)用反

12、向遺傳學(xué)技術(shù)對(duì)A/HK/483/97/H5Nl（對(duì)小鼠致?。┖虯/KH/486/97/H5Nl（對(duì)小鼠不致病）病毒研究，表明PB2蛋白是導(dǎo)致這兩株H5N1亞型AIV對(duì)小鼠產(chǎn)生致病性差異的關(guān)鍵因素，進(jìn)一步通過(guò)定點(diǎn)突變表明PB2蛋白的E62%突變?cè)鰪?qiáng)了A/HK/486/97/H5N1對(duì)小鼠致病性向。另有研究顯示PB2蛋白701位點(diǎn)的N對(duì)于AIV跨越物種屏障感染小鼠并在小鼠體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制起到重要作用網(wǎng)。Gao等證明PB2蛋白701位點(diǎn)的N是AIV在豚鼠體內(nèi)復(fù)制所必需的叫PB2蛋白上其他氨基酸位點(diǎn)同樣對(duì)致病性具有影響，有報(bào)道PB2蛋白矽突變能夠增強(qiáng)病毒RNA聚合酶在人體細(xì)胞中的活性，而且PB2的突變能夠

13、顯著增強(qiáng)AIV在小鼠組織中的復(fù)制能力網(wǎng)。除了單一蛋白上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的影響，不同蛋白間以及同一蛋白不同氨基酸位點(diǎn)的聯(lián)合突變對(duì)致病性的影響也受到廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)H1N1/2009病毒株P(guān)B2蛋白中A271T的突變可使AIV在豚鼠中通過(guò)飛沫傳播的能力喪失，若該突變與HA蛋白QVR突變一起作用則可使AIV在雪貂中飛沫傳播的能力喪失該研究為人類進(jìn)一步研究AIV致病分子機(jī)制提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.2 PA蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響PA蛋白是一種跣酸化蛋白，對(duì)聚合酶的結(jié)構(gòu)起著重要的作用，PA蛋白的功能尚不清楚，定點(diǎn)突變表明PA蛋白能夠影響AIV的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。Song等將A/Goose/HB65

14、/H5N1和AZDucWHB49/H5Nl兩株病毒定點(diǎn)突變，表明PA蛋白224和383位氨基酸是影響病毒對(duì)家鴨致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)，證明PA蛋白是影響H5N1亞型AIV對(duì)家鴨致病性的主要因素，但具體的機(jī)理需要進(jìn)一步的研究確定口氣NS蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響NS1蛋白是AIV一個(gè)重要的毒力因子，具有多種功能，它可以干擾mRNA前體的剪切、polyA的形成以及干擾細(xì)胞mRNA從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)NS1蛋白中關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變化能夠使AIV對(duì)自然免疫產(chǎn)生拮抗作用。有報(bào)道NS1蛋白S42P突變會(huì)顯著增強(qiáng)A/Duck/Guangxi/12/O3/H5N1在小鼠中的致病力，然而在同樣的位置以S代替P

15、將減弱A/Duck/Guangxi/27/03/H5N1的毒力，進(jìn)一步研究表明NS1蛋白中第42位的S不僅是H5N1病毒對(duì)抗宿主細(xì)胞干擾素誘導(dǎo)的關(guān)鍵，也是NS1蛋白防止雙鏈RNA介導(dǎo)的NF-kB通路和IRF-3通路激活的關(guān)鍵照。NS2蛋白主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)病毒復(fù)制產(chǎn)生的核糖核蛋白體(vRNP)從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)NS2蛋白含有核輸出信號(hào)，能夠與核穿孔復(fù)合體中某些蛋白相互作用，介導(dǎo)M1-RNP復(fù)合體穿過(guò)核膜。目前NS2蛋白中關(guān)鍵氨基酸點(diǎn)位對(duì)病毒致病性的影響還有待研究。4 NP蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響NP蛋白為核蛋白，是病毒粒子主要的結(jié)構(gòu)蛋白，為AIV中誘導(dǎo)宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要成分。NP蛋白

16、在體內(nèi)和體外均能夠與病毒聚合酶復(fù)合體中的PB2和PB1相互結(jié)合，但并不與PA相結(jié)合，同時(shí)其能夠與Ml蛋白相互作用從而影響病毒粒子的出芽過(guò)程。Tada等發(fā)現(xiàn)NP蛋白UelwThr的突變能夠促進(jìn)病毒RNA的合成，增強(qiáng)AIV對(duì)雞的致病力咧。推測(cè)該突變可能改變NP蛋白構(gòu)象，影響其與PB1、PB2以及轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用。但NP蛋白對(duì)病毒致病性的影響具體機(jī)制，以及它與病毒其他蛋白的功能關(guān)系尚不清楚。5 M蛋白中氨基酸位點(diǎn)對(duì)致病性的影響AIV的M基因編碼Ml和M2蛋白。Ml為維持病毒形態(tài)的基質(zhì)蛋白，介導(dǎo)病毒粒子出芽和裝配過(guò)程；M2蛋白裝配于囊膜上作為跨膜離子通道蛋白。研究表明，當(dāng)Ml蛋白的N3)和T2,

17、5A發(fā)生突變時(shí)，A/duck/Fujian/01/2002/H5N1在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出高致病性，而A/duck/Guangxi/53/2002/H5Nl則為較低的致病性，由此證明Ml蛋白中相關(guān)氨基酸位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致兩者對(duì)小鼠致病性產(chǎn)生差別的關(guān)鍵表1部分影響AIV致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)蛋白關(guān)健位點(diǎn)作用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物HANl58D,QL,N22%,T3,8I病毒獲得在雪貂之間傳播的能力雪貂"Y,T156A,Q22,GS突變使得病毒具有在雪貂間通過(guò)空氣傳播的能力雪貂DN降低H5N1亞型HPAIV對(duì)雞的致病性雞所E,26DT,60A病毒傳播的關(guān)鍵條件豚鼠PB2701N病毒能夠傳播的關(guān)鍵條件豚鼠

18、N62對(duì)AIV跨越種間屏障感染哺乳動(dòng)物起了決定作用刖小鼠El58G顯著增強(qiáng)病毒在小鼠組織中的復(fù)制能力小鼠通過(guò)誘導(dǎo)提高糖皮質(zhì)激素水平增強(qiáng)H9N2病毒毒力閆小鼠PB1-F2N*S使得H5N1亞型AIV致病性增強(qiáng)小鼠PB1s%PB1蛋白622和709位點(diǎn)的突變?cè)鰪?qiáng)病毒致病性小鼠V709!PAT,57A能夠影響病毒的復(fù)制能力無(wú)H5,0APA蛋白510位點(diǎn)His到Ala的突變降低病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)NP1%能夠促進(jìn)病毒RNA的合成，提升HPAIV的致病能力向雞NS1149A149位為丙氨酸的重組病毒拮抗干擾素生成的能力較強(qiáng)雞MlmH5N1亞型A1V的Ml蛋白第30位天冬氨酸和215位丙氨酸的累小鼠T21

19、5A加效應(yīng)是對(duì)小鼠高致病力所必需四AI不僅對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害嚴(yán)重，同時(shí)還具有重大公共衛(wèi)生學(xué)意義。因此，加強(qiáng)致病機(jī)制研究和加強(qiáng)對(duì)AIV的監(jiān)測(cè)和評(píng)估，是控制AIV疫情的基本措施。大量研究數(shù)據(jù)表明AIV的致病性是多因素相互作用的結(jié)果，并且與病毒本身和宿主特性有關(guān)。HA蛋白裂解位點(diǎn)處的連續(xù)堿性氨基酸和與唾液酸受體結(jié)合的能力能夠影響AIV的宿主范圍，NS1蛋白主要涉及影響宿主干擾素的調(diào)控，提高致病性，PB2蛋白也能夠影響宿主的范圍以及促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制。目前對(duì)HA、PB2及NS1這3種蛋白的影響機(jī)制研究較為深入，關(guān)于其他蛋白對(duì)病毒致病性影響機(jī)制目前尚未得到明確統(tǒng)一的結(jié)果，這方面的研究將受到更多關(guān)注，成為

20、影響AIV致病性和傳播的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)研究領(lǐng)域的新突破點(diǎn)。參考文獻(xiàn)：1 HarveyR,MartinAC,ZambonM,etal.RestrictionstotheadaptationofinfluenzaavirusH5hemagglutinintothehumanhostJ.JVirol,2004,78(1):502-507.2 GambaryanAS,PiskarevVE,YamskovIA,etal.HumaninfluenzavirusrecognitionofsialyloligosaccharidesJ.FEBSLett,1995,366(1):57-60.3 GaoYu-we

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