煙草種質(zhì)資源抗馬鈴薯Y病毒病基因型鑒定.docx

1、生物技術(shù)林世鋒,王仁剛,任學(xué)良,等：煙草種質(zhì)資源抗馬鈴藉Y病毒病基因型鑒定中國(guó)煙草學(xué)報(bào),2021,27(5).UNShifeng,WANGRengang,RENXueliung,etal.GenotypicidentificationofPotatovirusYresistanceintobaccogermplasmresources/.ActaTabacariaSinica,2021,27(5).doi:10.16472/j.chinatobacco.2020.342煙草種質(zhì)資源抗馬鈴薯Y病毒病基因型鑒定林世鋒I,王仁剛七任學(xué)良I,李尊強(qiáng)2,元野2,龍明錦1,張吉順】，王自力】I貴州省煙草科

2、學(xué)研究院，煙草行業(yè)分r遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)市觀山湖區(qū)龍灘壩路29號(hào)550081：2中國(guó)煙草總公司黑龍江省煙草公司牡丹江煙草科學(xué)研究所，哈爾濱市道里區(qū)哈藥路17號(hào)150076摘要：【背景和目的】從作物種質(zhì)資源中進(jìn)行等位基因鑒定，特別是優(yōu)異等位基因的發(fā)掘和應(yīng)用，是使種質(zhì)資源加速轉(zhuǎn)變?yōu)榛蛸Y源的關(guān)鍵所在?！痉椒ā坎捎妹缙谥耗Σ两臃N的方法，對(duì)煙草種質(zhì)資源的馬鈴薯Y病毒(PmasvirusY,PVY)抗病性進(jìn)行鑒定；通過(guò)煙草隱性抗PVY基因eIF4El(又稱為感PVY基因elF4Eh等位性測(cè)驗(yàn)、等位基因分子標(biāo)記檢測(cè)和RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序，對(duì)PVY抗病資源進(jìn)行基因型分析?！窘Y(jié)果】(1)從收集到的900多

3、份來(lái)自國(guó)內(nèi)外的煙草種質(zhì)資源中篩選出19份高抗PVY資源。(2)根據(jù)等位性測(cè)驗(yàn)結(jié)果推斷19份抗源所具有的PVY抗性均由eIF4El基因所控制。(3)等位基因分子標(biāo)記檢測(cè)和RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果將19份抗源的elF4El基因區(qū)分為4種突變類型?！窘Y(jié)論】本研究結(jié)果豐富了我國(guó)對(duì)抗PVY煙草種質(zhì)資源的篩選和利用的內(nèi)容，為后續(xù)煙草PVY抗性優(yōu)異籍位基因的發(fā)掘和育種利用提供了基礎(chǔ)材料和信息支撞。關(guān)鍵詞：煙草：種質(zhì)資源：馬鈴薯Y病毒：抗病性；C1F4E1基因；基因型由馬鈴薯Y病毒(PolciU)virusY,PVY)引起的煙草PVY病毒病是影響煙草生產(chǎn)的主要病害之一。實(shí)踐證明，選育和種植抗病品種是控制該病害

4、最經(jīng)濟(jì)有效的措施IUo抗病種質(zhì)資源的發(fā)掘、研究和利用是煙草抗PVY育種的重要基礎(chǔ)。已知煙草PVY的抗源分為兩大類，一類是以VAM(TII406)及其衍生種質(zhì)TN86為代表的隱性基因位點(diǎn)("M和“)控制的抗性口3】，另一類是以非洲煙草(Nicolicmaafricana)為代表的對(duì)PVY免疫的抗性叫。目前，受四位點(diǎn)控制的抗源被廣泛應(yīng)用于煙草抗病育種。為了提高肱位點(diǎn)的育種利用效率，國(guó)內(nèi)外研究者相繼開(kāi)發(fā)了與w位點(diǎn)相關(guān)的分子標(biāo)記，如RandomlyAmplifiedPolymorphicDNA(RAPD)和SequenceCharacterizedAmplifiedRegion(SCAR)標(biāo)

5、i己”'I。這些標(biāo)記與m位點(diǎn)間的遺傳距離較遠(yuǎn)，導(dǎo)致利用標(biāo)記數(shù)據(jù)判斷抗性表型誤差較大，進(jìn)而限制了這類分子標(biāo)記在育種中的實(shí)際應(yīng)用。在抗性獲得的研究中，Noguchis等151認(rèn)為va基因型煙草植株的抗性是由于對(duì)PVY感病的基因片段的缺失造成的。2014年，Julio等通過(guò)更加深入的研究，進(jìn)一步明確了m基因型煙草植株對(duì)PVY的抗性是由于真核翻譯起始因子4E1(eukaryotictranslationinitiationfactor4E1,elF4El)基因的缺失造成的，即eIF4El基因?yàn)闊煵蓦[性抗PVY基因(感病基因)。2015年，劉勇等劇根據(jù)煙草CIF4E1基因及其家族基因的序列信息，

6、開(kāi)發(fā)出一個(gè)與eIF4El野生型等位基因緊密連鎖的顯性標(biāo)記，隨后利用該標(biāo)記進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育成抗PVY新品種云煙基金項(xiàng)目：中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)FI“貴卅特有種質(zhì)PVY抗性共顯性分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及雙抗病毒病材料創(chuàng)制”(201901):中國(guó)煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目“美國(guó)北卡羅萊納烤煙新品種(系)的引進(jìn)、爵選和應(yīng)用”(201830:中田煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目“貴州烤煙種質(zhì)創(chuàng)制及新品種選育研充”(201601):中國(guó)煙草總公司黑龍江省公司科技項(xiàng)目“龍江煙區(qū)早熟、多抗烤煙新品種選有及示范推廣"(202030000200126)作者簡(jiǎn)介：林世鋒(1978),博上，副研究員，主要

7、研究方向?yàn)闊煵葸z傳育種與分子生物學(xué)，TelEmiiil：Iinshifcngl978通訊作者:王仁剛(1976),TelEmail：rengangwang收稿日期：202812-25；網(wǎng)絡(luò)出版日期:2021-06-18301110',但由于該標(biāo)記不能作為eIF4El等位基因缺失的共顯性標(biāo)記，降低了其在實(shí)際育種中的應(yīng)用價(jià)值和意義。2018年，Dluge等叫利用RNA測(cè)序的方法比較了基因型、舊基因型和野生型三種煙草中的基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)在具有PVY抗性的VAM和w基因型煙草中，真核翻譯起始因子eIF4El基因所在的染色體區(qū)段發(fā)生大

8、范圍的缺失，由于建立eIF4El等位基因缺失的共顯性標(biāo)記需要了解該基因缺失連接片段的序列特點(diǎn)，而elF4El基因及其側(cè)翼序列的大范圍缺失，造成研究者未能有效地克隆到該基因的缺失連接片段、獲得序列信息，從而未能開(kāi)發(fā)出等位基因缺失的共顯性標(biāo)記。作物種質(zhì)資源中蘊(yùn)含著大量?jī)?yōu)異等位基因，如何鑒定并將這些變異應(yīng)用于作物遺傳改良是種質(zhì)資源研究的中心任務(wù)之一【。先前研究結(jié)果表明，在煙草種質(zhì)中存在一定數(shù)量的PVY抗性資源，但有關(guān)種質(zhì)資源基因型，特別是有關(guān)煙草eIF4El優(yōu)異等位基因及其特異分了標(biāo)記的研究報(bào)道甚少l,3-,5|o本研究目的是鑒定收集到的900多份來(lái)自國(guó)內(nèi)外的煙草種質(zhì)資源的PVY抗性表型，并通過(guò)抗性

9、基因等位性測(cè)驗(yàn)和RT-PCR擴(kuò)增測(cè)序相結(jié)合的方法，分析篩選出的抗源材料所攜帶的elF4El基因的基因型，以期為后續(xù)煙草PVY抗性優(yōu)異等位基因的發(fā)掘和育種利用提供基礎(chǔ)材料和信息支撐。1材料與方法1.1試驗(yàn)材料供試種質(zhì)由貴州省煙草科學(xué)研究院提供，其中包括PVY抗病對(duì)照煙草品種TN90和感病對(duì)照煙草品種K326。以TN90和K326作母本與研究中篩選到的PVY抗病資源作父本進(jìn)行雜交獲得F1代雜交種材料，用于抗病資源中PVY抗性基因的等位性檢洲。1.2PVY人工接種以普遍發(fā)生的脈壞死株系（PVYN）為接種毒源，由貴州省煙草科學(xué)研究院品種選育三室分離和保存?？筆VY測(cè)試采用常規(guī)汁液摩擦接種法,6,o1.

10、3煙草基因組DNA的提取采用AxyPrep基因組DNA小量制備試劑盒（Axygen）提取煙草基因組DNA,并通過(guò)紫外分光光度法（Nanodrop）和瓊脂糖凝膠電泳法初步檢測(cè)基因組DNA的提取質(zhì)量。1.4煙草RNA提取和cDNA合成采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒提取總RNA“cDNA第一鏈的合成按照TaKaRa公司的PrimeScriptII1ststrandcDNASynthesisKit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.5煙草e!F4El基因的特異分子標(biāo)記檢測(cè)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道合成eIF4El野生型等位基因的5,端顯性分子標(biāo)記引物、開(kāi)陽(yáng)小黑煙和福泉柳葉煙elF4El突變型等位基因的共顯性分子標(biāo)記引

11、物”"別如*前酸還霸因）的特異性引物19,同時(shí)設(shè)計(jì)合成ejp4£j野生型等位基因的3,端顯性分子標(biāo)記引物（表1）,對(duì)篩選到的PVY抗病資源中的曰基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。1.6煙草e!F4El基因的全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增根據(jù)文獻(xiàn)20合成e!F4El基因全長(zhǎng)序列擴(kuò)增引物（表I）,以各自煙草cDNA為模板擴(kuò)增eIF4El基因全長(zhǎng)cDNA序列。PCR擴(kuò)增體系：TaKaRaLATaq酶0.25pL,I0XLATaqBuferH2.5pL,dNTPMix2pL,正向引物（lOpmol/L）1gL,反向引物（10pmol/L）1pL,模板1pL,加入ddHQ補(bǔ)平至25pLoPCR擴(kuò)增程序：94

12、C預(yù)變性3min,94°C變性30s,94°C變性30s,52'C退火30s,72°C延伸1min（30個(gè)循環(huán)），最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)，送上海生工公司進(jìn)行基因測(cè)序。表1本研究所用引物序列Tab.1Primersusedinthisstudy引物用途引物名稱引物序列（5r-39elF4El野生型等位基因CF2TTTGGTTTGATAATCCTATGGCT5*端顯性分子標(biāo)記GRIIGAAGGCAAGATATTCAGGAGCT內(nèi)引物ACGGCACTTTTTCCACTGTCGAAGATTTTAG開(kāi)陽(yáng)小黑煙elF4El突變型內(nèi)引物

13、BGAATATGAAATAACTTACCCCCAAAAACT等位基因共顯性分子標(biāo)記外引物PCAAGTACCCTTTTCCTACTAAAATCTATAACTAAG外引物QGCCGGACAGAATTAGTGTCACATAAAATTGAAGATTTTAC續(xù)表1引物用途引物名稱引物序列（5,3）福泉柳葉煙HF4E1'突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記公共正向弓1物CCCATTTGACACCATAAGTTCATACG野生型反向弓1物AAACACTGTTTGCAGAATTTAAGCAAC突變型反向引物GGAGTATGATCTAGACGAAGTATCTCTTGACTACelF4El野生型等位基因3,端顯性

14、分子標(biāo)記3'-FAATTCGTGCCACGTTAGGGC3'-RTTGAGTCGTCCTGCAATTTGCelF4El基因全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增eIF4EI-FCTAAAATCTATAACTAAGTACATAGAAAACACACGelF4E1-RGGTACTTAAACTGTCAAGTGGCAGC內(nèi)參基因NR序列擴(kuò)增NR-FCGCTGATAACTGGATTGAACGCNR-FGGTTACGAACGTAATGAAGTGGGAC2結(jié)果2.1抗性表型鑒定從900多份種質(zhì)資源中，通過(guò)苗期盆栽人工接種PVY抗性鑒定，獲得抗PVY資源開(kāi)陽(yáng)小黑煙、半坤村曬煙等19份（表2）?？筆VY資源大部分屬

15、于我國(guó)地方性哂煙及黃花煙品種。表2抗PVY的煙草種質(zhì)資源信息Tab.2TheinformationofthetobaccogermplasmresourcewithresistancetoPVY編號(hào)種質(zhì)名稱種質(zhì)類型抗性基因型編號(hào)種質(zhì)名稱種質(zhì)類型抗性基因型1開(kāi)陽(yáng)小黑煙曬煙R單堿基插入11C15I烤煙R完全缺失2壩林曬煙曬煙R單堿基插入12NC55烤煙R完全缺失3光柄柳葉（木）曬煙R單堿基插入13TN86白肋煙R完全缺失4一朵花曬煙R單堿基插入14Havana10雪茄煙R完全缺失5勵(lì)海鄉(xiāng)曬煙（二）曬煙R單堿基插入15CriodlloSalteno11雪茄煙R完全缺失6盤(pán)縣大柳葉曬煙R單堿基插入16

16、陜縣蘭花煙黃花煙R完全缺失7冊(cè)亨威旁土煙曬煙R單堿基插入17靈寶莫合煙黃花煙R完全缺失8半坤村曬煙曬煙R單堿基替換18建平大蘭花煙黃花煙R完全缺失9福泉柳葉煙曬煙R部分缺失19茄子煙黃花煙R完全缺失10普安付耳煙（3）曬煙R完全缺失20K326烤煙S野生型2.2與TN90抗病位點(diǎn)的等位性檢測(cè)己知白肋煙品種TN90對(duì)PVY的抗性是由隱性基因位點(diǎn)（知）控制的，具體而言是由煙草PVY感病基因e/F4El缺失造成的山、為檢測(cè)抗PVY資源與TN90對(duì)PVY抗性間的等位性關(guān)系，利用抗PVY資源與TN90及感病品種K326配制抗抗及抗感雜交組合，各選取60個(gè)R代單株，通過(guò)人工摩擦接種法進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，1

17、9份抗PVY資源與TN90配制抗抗組合的F.代單株均表現(xiàn)為抗病，而19份抗PVY資源與K326配制抗感組合的Fi代單株均表現(xiàn)為感病。上述結(jié)果表明，篩選到的19份抗PVY資源與TN90的PVY抗病基因間具有等位性，即推斷19份抗PVY資源的PVY抗性均是由感病基因eIF4EI缺失造成的。2.3eIF4El基因的特異分子標(biāo)記檢測(cè)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)煙草抗PVY材料的eIF4El基因可發(fā)生數(shù)種不同形式的突變，包括最為常見(jiàn)的基因全序列缺失突變（山，及單堿基插入和大片段缺失突變等IB20；相繼開(kāi)發(fā)了不同的分子標(biāo)記，包括煙草eIF4El野生型等位基因5,端顯性分子標(biāo)記、開(kāi)陽(yáng)小黑煙elF4El突變型等位基因共顯性

18、分子標(biāo)記明和福泉柳葉煙eIF4El突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記"8|,這些分子標(biāo)記的相對(duì)位置如圖I所示.考慮到上述分了標(biāo)記的檢測(cè)范圍未能涵蓋煙草elF4El基因3,端，本研究另外在煙草eIF4El基因3,端設(shè)計(jì)了煙草"F4E1野生型等位基因3,端顯性分了標(biāo)記（圖1）。接著本研究利用4種分子標(biāo)記引物對(duì)19份抗PVY資源和1份感PVY資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4種分子標(biāo)記將20份資源區(qū)分為4個(gè)標(biāo)記基因型（圖2）o標(biāo)記基因型A包括開(kāi)陽(yáng)小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、勵(lì)海鄉(xiāng)曬煙（二）、盤(pán)縣大柳葉和冊(cè)亨威旁土煙共7份抗病資源。標(biāo)記基因型B包括半坤村曬煙和K326,其

19、中半坤村曬煙表型鑒定為抗PVY,K326表型鑒定為感PVYo標(biāo)記基因型C只包括抗PVY資源福泉柳葉煙，已知福泉柳葉煙eIF4El基因3,端發(fā)生大片段缺失（部分缺失）mi。標(biāo)記基因型D包括普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana10、CriodlloSaltcno1K陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙、建平大蘭花煙共10份抗病資源，利用4種分子標(biāo)記引物擴(kuò)增均未產(chǎn)生任何條帶，初步推測(cè)這10份抗病資源elF4El基因發(fā)生了完全缺失。ATGTAG注：圖中上方黑色方框代表煙草dF4E!基因外顯子，方框之間的線段代表內(nèi)含子：下方雙向箭頭代表煙草etl-4El基因的不同分子標(biāo)記，I代表煙草e

20、lF4EI野生型等位基因5,端顯性分子標(biāo)記，2-I/2-2代表開(kāi)陽(yáng)小黑煙elF4EI突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記，3-1/3-2代表福泉柳葉煙e!F4El突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記，4代表煙草elF4EI野生型等位基因3,端顯性分子標(biāo)記。圖1煙草UF4E1基因的4種分子標(biāo)記在基因組上的相對(duì)位置示意圖Fig.IRelativepositionsoffourmolecularmarkersoftobaccoelF4EIgeneinthegenome注：（a）煙草WR/E/野生型等位基因5端顯性分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果：（b）開(kāi)陽(yáng)小黑煙WF4E/突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果：（c）福泉柳葉煙C1F

21、4E1突變型等位基因共顯性分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果：（d）煙草elF4El野生型等位基因31端顯性分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果：（c）內(nèi)參基因Actin擴(kuò)增結(jié)果：M：DL2000DNAMarker：1-20：煙草種質(zhì)資源（見(jiàn)表2）:S：標(biāo)記在感病品種中擴(kuò)增出的特異性條帶：R：標(biāo)記在抗病品種中擴(kuò)增出的特異性條帶：A、B、C、D：，個(gè)標(biāo)記基因型。圖2抗PVY煙草種質(zhì)資源中基因的分子標(biāo)記檢刪Fig.2MolecularmarkerdetectionofelF4ElgeneintobaccogermplasmresourcesrcsistanitoPVY2.4C1F4E1基因的RT-PCR擴(kuò)增及序列分析應(yīng)用RT-PCR技

22、術(shù)對(duì)19份抗PVY資源的eIF4El基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定，結(jié)果顯示，在福泉柳葉煙、普安付耳煙（3）、C151、NC55、TN86、Havana10、CriodlloSahenoII、陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、茄子煙和建平大蘭花煙等11份種質(zhì)資源中未能擴(kuò)增出eIF4El基因的全長(zhǎng)cDNA序列（圖3）,己知在福泉柳葉煙中elF4El基因發(fā)生3,端大片段缺失（該種突變型等位基因被命名為CIF4E1.F）,結(jié)合e!F4EI基因的特異分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)其他10份種質(zhì)資源中elF4El基因發(fā)生了完全缺失；在開(kāi)陽(yáng)小黑煙、壩林曬煙、光柄柳葉（木）、一朵花、胡海鄉(xiāng)I曬煙（二）、盤(pán)縣大柳葉和冊(cè)亨威

23、旁土煙等7份種質(zhì)資源中均能擴(kuò)增出兩個(gè)大小不同的條帶（圖3）,進(jìn)一步測(cè)序顯示eIF4El基因在這些資源中存在兩種剪接模式（圖4）,其原因在于eIF4El基因I號(hào)外顯子3端發(fā)生單-堿基（T）插入突變影響到部分前體RNA內(nèi)含子1的正確剪接（GT-AG法則）,導(dǎo)致下游2號(hào)外顯了發(fā)生跳躍缺失突變，考慮到此種突變型等位基因最初在開(kāi)陽(yáng)小黑煙中被發(fā)現(xiàn)，故將其命名為e/F4時(shí)您少：與上述elF4EI基因突變類型不同，在半坤村曬煙中可以擴(kuò)增出與感病品種K326一樣的單一條帶（圖3）,測(cè)序結(jié)果顯示，半坤村哂煙的eIF4El基因編碼區(qū)（CDS）第149位堿基處存在一個(gè)等位基因突變，即由G突變?yōu)镃（圖4）,從而導(dǎo)致相應(yīng)

24、編碼的蛋白質(zhì)第50位氨基酸殘基由色氨酸（W）突變?yōu)榻z氨酸（S）,為將半坤村曬煙中發(fā)現(xiàn)的e!F4El突變型等位基因與其他突變型等位基因區(qū)分開(kāi)來(lái)，我們將半坤村哂煙中發(fā)現(xiàn)的eIF4EI突變型等位基因命名為HF4E1.B。M1234567891011121314151617181920注：（a）煙草elF4EI«因的全長(zhǎng)cDNA序列擴(kuò)增：（b）內(nèi)參基因NR擴(kuò)增，用以保證每個(gè)PCR反應(yīng)使用了等最的cDNA模板：Ml：DL2000DNAmarker；1-20：煙草種質(zhì)資源（表2）,圖3煙草eIF4El基因的全RcDNA序列的PCR擴(kuò)增Fig.3PCRamplificationofthefull-

25、lengthcDNAsequenceofelF4Elgeneintobacco3討論溫室盆栽苗期人工接種鑒定結(jié)果，19份煙草種質(zhì)資源對(duì)PVY表現(xiàn)為高抗，其中開(kāi)陽(yáng)小黑煙、壩林曬煙、半坤村曬煙、福泉柳葉煙、C151、NC55、TN86Havana10>CriodlloSalteno11陜縣蘭花煙、靈寶莫合煙、建平大蘭花煙等12份資源PVY抗性在先前文獻(xiàn)中已有報(bào)道19,13,15,18.20，但除開(kāi)陽(yáng)小黑煙、福泉柳葉煙、C151、NC55和TN86等5份種質(zhì)資源外,對(duì)其他種質(zhì)資源中PVY感病基因elF4El的基因型未見(jiàn)報(bào)道。己知目前煙草育種利用的PVY抗源可能全部衍生自煙草資源VAM,利用VA

26、M抗源及其衍生抗源育成的抗PVY煙草品種包括白肋煙品種TN86、TN90和烤煙品種NC744、NC55、NC102等，但是在這些抗源及育成的抗病品種中往往圍繞著eIF4El基因及其側(cè)翼序列的染色體區(qū)域發(fā)生了大范圍的缺失，其中涵蓋上百個(gè)基因的缺失""o上述染色體區(qū)域的大范圍缺失及無(wú)法獲得缺失連接片段序列信息不僅造成eIF4El基因位點(diǎn)野生型和突變型共顯性分子標(biāo)記難以開(kāi)發(fā)，不利于隱性性狀的選擇，而且也會(huì)由于一些功能基因的缺失帶來(lái)不利的農(nóng)藝性狀。早有研究報(bào)道，VAM基因型抗源材料的PVY抗性存在連鎖累贅，如葉片短小、產(chǎn)量較低、缺乏葉面分泌物等【22-馬。這些連鎖累贅現(xiàn)象可能與eI

27、F4EI基因上下游大量功能基因的缺失相關(guān)，因此即使針對(duì)這類抗源材料設(shè)計(jì)出共顯性標(biāo)記用于回交育種輔助選擇或增加回交次數(shù)，也無(wú)法打破PVY抗性定向改良帶來(lái)的連鎖累贅。為克服或避開(kāi)上述問(wèn)題的困擾，本研究從鑒定煙草種質(zhì)資源抗PVY表型和基因型入手，通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)所有篩選到的抗病資源無(wú)一例外在elF4El基因位cIF4El.SelFIEl.BOIF4E1.K1oIF4El.K2elHEl.SelFIEl.BO1E4E1.K1eIF4El.K2cIF4El.SeIF4El.BelHEl.KleIF4El.K2696970512222eIF4El.SelFIEl.BeIF4El.KIoIF4El.K29901

28、55653332wjUuSSStfusShiggcaatgaiiggacaicaaiijgaicalist1uxl>icLuuxUJJ29LJjauxM1''，、ieiu11.iiu.,i.曲3祁且劇3曲日覓朗I(CAATGU1(XxACATlAAI1(«AIelHEl.SelFIEl.BelFlEl.Kl©1F4E1.K299043347555390909090elHEl.SelFIEl.BelHEl.KleIF4El.K2ICGTCGTATTTGGGCJi*i：i.IGAAATCAAEAAG(:ATCCATT.AGAilAATTCIT|.(TTTT

29、T<TTGATAAT卬TAT(XX：TAAAiCGTCGTATTTGGGCji,ii：t/ifflAAGCuccniv：;、11(r?j(TTTTTi1'>>'11(1GM1CGTCG：ATTTJIG(i*1：i；lCITA.h(iicc.'.rrv：;iAATTCTTiBACnTTriitgataaTUt.atggci.ICGTCGTATTTGGGCJii:©AAATCAALCCTAAGCATCCATTAGA<SAATTCTtACTTTrria；TTTGATAATCCTATGGCTAAA180180180180elMEl.SeIF4E

30、l.B©IF4E1.K1eIF4El.K2161CAGAGGTGCCAACAATCGTTATACAGTATAG(GA«；TGCCAA(；AAtCOTTATACAGTATAGGG,©；T氐CMGAA忡CTTATACAGTAT而:MIU'Igccm(；aatc(;ttmacagtm.g666660660661495elHEl.SelHEl.BeIF4El.KlCIE1E1.K2注：e!F4EI.S：野生型等位基因序列：elF4El.B,e!F4El.K<elF4El.KI和eIF4EI.K2):突變型等位基因序列.圖4煙草elF4El野生型與突變型等位基

31、因的全長(zhǎng)cDNA序列比對(duì)Fig.4Alignmentofthefull-lengthcDNAsequencesofwild-typeandmutantallelesofelF4EIintobacco點(diǎn)發(fā)生了不同類型的突變，其中篩選到的曬煙和黃花煙抗病資源均是我國(guó)地方品種(又稱農(nóng)家品種)，是經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然繁衍、淘汰及人工馴化選擇的結(jié)果，不涉及人工誘變或基因修飾。盡管篩選到的所有抗病農(nóng)家品種均是由于eIF4EI基因位點(diǎn)發(fā)生自然突變?cè)斐傻慕Y(jié)果，還不能說(shuō)明elF4El基因是煙草抗PVY的唯一機(jī)制，但可能表明elF4El基因位點(diǎn)是目前進(jìn)行煙草抗PVY品種選育的最佳靶向位點(diǎn)，不會(huì)對(duì)其他農(nóng)藝性狀帶來(lái)負(fù)面效應(yīng)

32、或帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)相對(duì)較小，同時(shí)利用篩選到的elF4El單個(gè)基因突變的抗病資源(如開(kāi)陽(yáng)小黑煙或半坤村曬煙)也可能消除或減小圍繞C1F4E1基因位點(diǎn)發(fā)生大量基因缺失突變的抗病資源(如TN90或NC55)作為供體親本帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)。然而，需要指出的是，近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后在煙草上發(fā)現(xiàn)了多個(gè)能夠突破elF4E/基因型抗性的PVY毒株12427,于此同時(shí)，在煙草中發(fā)現(xiàn)了與之對(duì)應(yīng)的新的隱性抗病基因eIF(iso)4EN°因此，今后如果能夠針對(duì)兩個(gè)隱性抗病基因eIF4El和eJF(iso)4E-T進(jìn)行煙草種質(zhì)資源抗PVY優(yōu)異等位變異的挖掘和聚合育種，勢(shì)必可以創(chuàng)制出賦予煙草對(duì)絕大多數(shù)PVY病毒株系

33、抗性的新品種僅氣回交育種對(duì)帶有個(gè)別不良性狀的品種改良是一種較好的育種途徑，而分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)因其對(duì)目標(biāo)基因的快速準(zhǔn)確選擇為回交育種提供有效工具a】。由J-eiF4El基因是隱性抗病基因，在以選擇雜合個(gè)體為目標(biāo)的回交轉(zhuǎn)育過(guò)程中，以擴(kuò)增elF4El野生型等位基因?yàn)槟繕?biāo)的顯性分子標(biāo)記不能有效識(shí)別含有eIF4El突變型等位基因的雜合個(gè)體，仍需通過(guò)逐代測(cè)交或自交的方法鑒定基因型，不盡完美。鑒于共顯性的分子標(biāo)記允許在回交轉(zhuǎn)育雜合體階段進(jìn)行隱性基因的鑒定，無(wú)需進(jìn)行測(cè)交或自交檢驗(yàn)，節(jié)省選育時(shí)間，本研究對(duì)煙草種質(zhì)資源抗PVY表型和基因型進(jìn)行鑒定，篩選到多個(gè)新的抗病資源，并獲得了各個(gè)抗病資源elF4El

34、基因突變序列信息，為建立煙草PVY隱性抗病基因elF4El的共顯性分子標(biāo)記提供了可能，為提高煙草PVY抗病育種選擇效率，加快品種改良進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)。4結(jié)論本研究從900多份煙草種質(zhì)資源中篩選出19份高抗PVY資源，其中14份為中國(guó)煙草地方品種資源。通過(guò)抗性基因等位性測(cè)驗(yàn)，初步推斷19份抗源的PVYn抗性由隱性抗病基因e/F4引所控制。通過(guò)序列分析，確定19份抗源中eIF4El基因存在4種突變類型，包括單堿基插入、普換、基因片段部分或完全缺失。這些結(jié)果為煙草PVY抗病育種中抗病材料的選擇提供了依據(jù)，也為煙草抗PVY共顯性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供了可能，從而有利于提高育種效率，加快育種進(jìn)程。參考文

35、獻(xiàn)|1周顯升.錢玉梅，陳德袤.等.煙草品種對(duì)馬鈴曹Y病毒抗性遺傳分析UJ.中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2007,13(1):31-36.ZHOUXiansheng.QIANYumei,CHENDexin,etal.GeneticanalysisoftobaccoresistancetopotatovirusY|J|.ActaTabacariaSinaca.2007,13(1):31-36.(2 KoelleG.GeneticanalyseeinerY-viras(Rippenbraune)resistentenmutantedertabaksorteVirginA|J|.Zuchter,1961.31:71

36、-71.3 MillerRD.Registraiionof'TN86'BurleyTobacco.CropScience.1987,27(2):365-366.|4LewisRS.TransferofresistancetopotatovirusY(PVY)fromNicotianaafricanatoNicotianatabacum:possibleinllucnccoftissuecultureontherateofintrogressionJ|.TheoreticalandAppliedGenetics.2005,11(X4):678-687.5NoguchiS,Taji

37、maT,YamamotoY,etal.DeletionofalargegenomicsegmentintobaccovarietiesthatarcresistanttoPotatovirusY(PVY)J.MolecularandGeneralGenetics.1999.262(4-5):822-829.|6JulioE,Denoyes-RothanB,VerrierJL,etal.DetectionofQTLslinkedtoleafundsmokepropertiesinNicotianatabacumbasedonastudyof114recombinantinbredlinesJ|.

38、MolecularBreeding.2006,18(1):69-91.17王貴，劉勇.盧秀彈，等.煙草PVY抗性的遺傳分析與分子標(biāo)記篩選J.分了植物育種,2012,10(1):97-103.WANGGui.LIUYong.LUXiuping.ctal.InheritanceofresistancetopotatovirusYintobaccoandmolecularmarkerindeniiilcation|J|.MolecularPlantBreeding,2012,10(1):97-103.|8JulioE.CotucheauJ,DecorpsC,etal.Aeukaryotictrans

39、lationinitiationfactor4e(eif4e)isresponsibleforlhe"va"tobaccorecessiveresistancetopotyvimses|J|.PlantMolecularBiologyReporter,2015.33(3):609-623.劉勇，宋中邦，童治軍，等.煙草PVY隱性抗病基因的分子標(biāo)記及其適用性JL中國(guó)煙草學(xué)報(bào).2015.21(1):76-81.LIUYong.SONGZhongbang,TONGZhijun,etal.Molecularmarkerfromrecessivegeneresistanttopota

40、tovirusYoftobaccoanditssuitabilityJJ.ActaTabacariaSinaca,2015.21(1):76-81.11O|劉勇.黃昌軍.曾建敏，等.抗PVY云煙87定向改快新品種“云煙301”的選育及特征特性J.中國(guó)煙草學(xué)報(bào).2020.26(3):59.65.LIUYong,HUANGChangjun,ZENGJianmei,etal.BreedingandcharacteristicofPVYresistantnewvarietyYunyan301obtainedbydircclionalmodificaliononbasisofYunyan87asfema

41、leparent|J|.ActaTabacariaSinaca.2020,26(3):59-65.|ll|DlugeKL,ZhongbangS,BingwuW,etal.CharacterizationofNicotianatabacumgenotypespossessingdeletionmutationsthataffectpotyvirusresistanceandlheproductionof(richomeexudatesJ).BMCGenomics,2018,19(1):484.112)武晶，黎裕.基于作物種質(zhì)資源的優(yōu)異等位基因挖掘：進(jìn)展與展望J.植物遺傳資源學(xué)報(bào),2019,20(

42、6):1380-1389.WUJing.LIYu.Miningsuperiorallelesincropgermplasmresources:advancesandperspectivesJJ.JournalofPlantGeneticResources,2019,20(6):1380-1389.(13陳榮平，馮春才，王春軍.等.部分煙草種質(zhì)資源的PVY抗性柴定J.中國(guó)煙草科學(xué)，2009,30(增刊)：56-58.CHENRon即ing.FENGChuncai.WANGChunjun.clal.Resistanceidentification(oPVYofsometobaccogermplas

43、mresources(J).ChineseTobaccoScience,2009,30(Supplement):56-58.114|從鑫,劉艷華，截培剛，等.抗PVY煙草種質(zhì)的遺傳多樣性分析U1.植物遺傳資源學(xué)報(bào),2014,15(3):679-684.CONGXin,LIUYanhua,DAIPeigang,etal.GeneticdiversityanalysisoftobaccogermplasmresistancetoPVY|J.JournalofPlantGeneticResources.2014.15(3):679-684.|15|劉勇，許美玲，黃昌軍，等.抗馬鈴警Y病毒的煙草種質(zhì)資

44、源抗性分析J.分子植物育種,2016.14(5):1212-1216.LIUYong,XUMeiling,HUANGChangjun,etal.IdentificationoftobaccogermplasmresistancetopotatovirusY(PVY)J|.Molecularplantbreeding.2016.14(5):1212-1216.(16|田波，裴美云.植物病毒研究方法|MJ.北京：科學(xué)出版社，1987:1-11.TIANBo.PEIMciyun.Researchmethodsofplantvirus(M.Beijing:SciencePress,1987:1-11.

45、(17 林世鋒，王仁剛，任學(xué)良，等.檢測(cè)煙草e!F4E-1基因單皈基插入突變的Bi-PASA標(biāo)記引物及方法：中國(guó)，CN1I0129479A(PJ.2019-08-16.LINShifcng,WANGRcngang.RENXucliang,clal.Bi-PASAmarkerprimerandmethodfordelectingtobaccoelF4E-lgenesinglebaseinsertionmutationP|.CN110129479/X.(18) 林世鋒，王仁剛.余始，等.煙草CIF4E-I位點(diǎn)大片段缺失突變的特異性共顯性分子標(biāo)記及應(yīng)用：中國(guó),CN109486992/X|P.2019

46、-03-19.LINShifeng,WANGRengang,YUJing,etal.Specificcodominancemolecularmarkerforlarge-fragmentdeletionmutationofcIF4E-lsiteoftobaccoandapplicationofmolecularmarker|P.CN109486992A.|19|余姑，趙杰宏，鄒頡，等.一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因烤后煙葉的四重PCR引物及方法：中國(guó),CN104152541A|P).2016-04-27.YUJing,ZHAOJichong.ZOUJic.ctal.QuadruplePCRprimersa

47、ndmethodforrapidlydetectingtransgenicroastedtobaccoleavesPJ.CNI04I5254IA.120林世鋒，王仁剛.余姑，等.煙草eIF4E-l突變位點(diǎn)特異性共顯性分子標(biāo)記及其應(yīng)用：中國(guó)，CNI08866234A|P.2018-11-23.I.INShifeng,WANGRengang,YUJing,etal.TobaccoelF4E-lnuilationsitespecificcodominantmolecularmarkerandapplicationthereof|PJ.CNI08866234A.21 SierroN.BatteyJND

48、,OuadiS.e(al.ThetobaccogenomesequenceanditscomparisonwiththoseoftomatoandpotatoJ|.NatureCommunications,2014,5:3833.22 NielsenMT,JonesGA.CollinsGB.InheritancepatternforsecretingandnonsccrclingglandulartrichomesintobaccoJ.CropScience,1982;22(5):1051-1053.23 NielsenMT,AkersCP.JarlfordVE,etal.Comparativ

49、eultrastructuralfeaturesofsecretingandnon-sccrctingglandulartrichomesoftwogenotypesofNicotiana(abacuniL|Jj.BotanicalGazette,1991,152(1):13-22.24 MasutaC,NishimuraM,MorishitaH,etal.Asingleaminoacidchangeinviralgenome-associatedproteinofpotatovirusYcorrelateswithresistancebreakingin,VirginAMutant'

50、tobaccoJ,Phytopathology,1999.89(2):118-23.25 LacroixC.GlaisL.VerrierJL.etal.EffectofpassageofaPotatovirusYisolateonalineoftobaccocontainingtherecessiveresistancegeneva2onthedevelopmentofisolatescapableofovercomingalleles0and2J1，EuropeanJournalofPlantPathology,2011.130(2):259-269.|26|KimJH.KimYS.Jang

51、SW.clal.Characterizationofanovelresistance-breakingisolateofPotatovirusYinNicotianaTabacurnlJj.InternationalJournalofPhytopathology,2014,3(1):1-10.1271李若，李尊強(qiáng)萬(wàn)秀清.等.一株突破va基因型煙草抗性的PVY病毒分離物的鑒定J.中國(guó)煙草學(xué)報(bào),2020,26(4):76-81.LIRuo.LIZunqiang,WANXiuqing,etal.IdentificationofaPVYvinisisolatebreakingdownva-genoty

52、petobaccoresisiance|J|.ActaTabacariaSinica.2020.26(4):76-81.|28|TakukuraY.UdagawaH.,ShinjoA.ctal.MutationofaNicotianatabacumL.eukaryotictranslation-initiationfactorgenereducessusceptibilitytoaresistance-breakingstrainofpotatovirusYJ.MolecularPlantPathology.2018,19(9):2124-2133.|29J李海渤.分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)及其在作物育種上的應(yīng)用(綜述)J.河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào).2002.16(4):68-71.LIHaibo.Marker-assistedselectionandapplicationtoth