豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究.docx

1、主題策劃FEATURE豬流行性腹瀉病毒基因及其疫苗的研究王鳳，湯德元李春燕.王彬，張曉杰，甘振磊.劉志杰(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025)摘要:豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起豬的一種急性腸道傳染病。該病由豬流行性腹瀉病毒感染豬而引起.以發(fā)熱、厭食、水樣腹瀉、嘔吐、嚴(yán)重脫水、消化道黏膜發(fā)炎及糜爛和食欲下降為主要特征，俗稱冬季拉稀病該病已成為世界流行性的疾病，是各養(yǎng)豬國家導(dǎo)致仔豬早期死亡的重要疫病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近幾年來,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對豬流行性腹瀉病毒的基因結(jié)構(gòu)、基因功能.分子致病機(jī)理.檢測手段以及疫苗預(yù)防方法有了更深入的認(rèn)識。而對豬流行性腹瀉的預(yù)

2、防和控制以接種疫苗為主，筆者主要針對豬流行性腹瀉病毒基因結(jié)構(gòu)、功能以及疫苗等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為豬流行性腹瀉病毒基因的深入研究和預(yù)防提供一些參考。關(guān)鍵詞:豬流行性腹瀉:病毒基因;結(jié)構(gòu)及功能;疫苗研究資助項(xiàng)目：貴州省貴陽市2005年畜牧科技專項(xiàng)基金項(xiàng)日資助【編號：(2005)筑科農(nóng)字第4-11號;作者簡介：王鳳(1985-),女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子病毒學(xué)的科研學(xué)習(xí).,通訊作者：湯德元(1964-),男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)和中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作.豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarr

3、heavirus,PEDV)引起豬的種急性腸道傳染病。豬流行性腹瀉病毒屬于冠狀病荏科(coronaviridae)冠狀病曜屬(coronavirus)的成員.主要引起豬流行性腹瀉。各種年齡、各個品種豬均可感染發(fā)病，哺乳仔豬、架子豬、育肥豬的發(fā)病率可達(dá)100%,成年母豬發(fā)病率為15%90%.其發(fā)病特點(diǎn)是：日齡小，癥狀重，日齡大，癥狀輕。1周齡哺乳仔豬常在腹瀉34d后脫水死亡，病死率達(dá)50%.斷奶豬、育肥豬癥狀較輕，腹瀉可持續(xù)47d,成年豬僅發(fā)生嘔吐和厭食.PEDV與豬傳染性肖腸炎病毒(TGEV)同屬于尼多病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬，2種病毒感染后所引起發(fā)病豬的臨床癥狀、流行特點(diǎn)和病理變化都極其相

4、似，均給罪豬業(yè)帶來嚴(yán)收危害。當(dāng)前PED發(fā)生率居高不下，發(fā)病情況也越來越復(fù)雜，出現(xiàn)混合感染的現(xiàn)象時有發(fā)生，目前倍受廣大研究者的取視.本文主要針對PEDV的基因組結(jié)構(gòu)、功能和PED疫苗的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，為豬流行性腹瀉基因的深入研究及對PED的預(yù)防提供參考。1PEDV的基因結(jié)構(gòu)及功能PEDV基因組是單股正鏈具有感染性的RNA,與其他冠狀病毒相似，其基因組5端有一個帽子結(jié)構(gòu)(cap),3端有一個Poly(A)尾，基因組全長為28033nt(PEDVCV777毒株)?；蚪M5,端非翻譯區(qū)(5UTR)位于復(fù)制酶多聚蛋白基因上游，長296nt,5UTR內(nèi)含有長為6598nt的前導(dǎo)序列(L)和一個AUG為

5、起始密碼子井擁有Kozak序列(GUUCaugC)和編碼12個氛基酸的開放閱讀框架(ORE).目前，除人冠狀病毒HCV229E外，已知的其他冠狀病毒成員都有Kozak序列，但序列有所差異.基因組3端非翻譯區(qū)(3UTR)長度為334nt,末端連有Poly(A)序列，3UTR內(nèi)含有由8個堿基(GGAAGAGC)組成的保守序列，起始于poly(A)游的73nt處，所有冠狀病毒成員都包含這個序列，只是在基因組中位置不同。刺余PolSORF3sMMN圖1PEDV基因組結(jié)構(gòu)基因組序列包括6個ORFs（見圖1）,從5，一3,端依次為編碼復(fù)制酶多聚蛋白lab（pplab）.纖突蛋白（S）,ORF3蛋白、小膜蛋

6、白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）的基因。復(fù)制酶多聚蛋白基因占全基因組2/3,長20346nt.包括ORFIa（12354nt）和ORFIb（8037nt）2個開放閱讀框架，二者之間有46nt的重疊序列，更登處有滑動序列（UUUAAAC）和假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)，它們能使核糖體進(jìn)行移碼閱讀（frameshifting）從而保證基因1的正確翻譯。S基因、E基因、M基因和N基因分別編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，長度分別為4152nt.231nt、681nt、1326nt.ORF3基因長675nt,編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，在每兩個相鄰基因之間有基因間隔序列（intervalsequence,IS）,它與基因組和亞基因組m

7、RNA的L序列3端有7-18nt相同，在病毒基因組發(fā)制和翻譯過程中發(fā)揮重要作用。1.1Pol基因Pol基因編碼依賴于RNA的非結(jié)構(gòu)蛋白，即夏制酶多聚蛋白lab（pplab）,為RNA多聚酶。復(fù)制酶多聚蛋白分子質(zhì)量約為753ku,有13個預(yù)測蛋白酶切割位點(diǎn)。PEDV基因組中S基因上游除編碼多聚酶的基因外并無其它基因。這同缺乏PEDV相關(guān)的血細(xì)胞聯(lián)集陶活性結(jié)果一致。因?yàn)?，如果冠狀病毒基因組存在這樣一種基因，它必定總是存在FS和多聚酶基因之間。多聚酶基因由2個大的重睿的開放性閩讀框架ORFIa（12354nt）和ORFlb（8037nt）組成，其中ORFIa和ORFIb共有46個核吾酸的重疊，重疊區(qū)

8、有一特異性7核普酸序列（UUUAAAC）和一假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。多聚酶基因翻譯成2個多蛋白前體，即ppla和pplab,較大的蛋白pplab則是通過核糖體移碼機(jī)制合成，并需要特異性7核昔酸序列和假結(jié)節(jié)結(jié)構(gòu)。ORFIa主要編碼蛋臼水解酶，包括分別切割復(fù)制酶多聚蛋白N端和C端的類木瓜蛋白酶（PL-PRO）和類脊費(fèi)灰質(zhì)炎病毒3C蛋白海（3CL-PRO）。PL-PRO的切割活性對鋅R有強(qiáng)依賴性。3CLPRO識別底物的核心序列是（ILMF）-QH（SAGC）。另外，ORFIa編碼蛋白還含有3個轉(zhuǎn)膜域（TM）ORFIb主要編碼RNA依賴性RNA聚合酶（RdRp）,同時有3個蛋白結(jié)構(gòu)域分別是鋅指蛋白域（Z）也稱金屬

9、結(jié)合域、螺旋酶域（Hcl）和保守序列域（C）.復(fù)制酶多聚蛋白經(jīng)共轉(zhuǎn)譯處理后產(chǎn)生與病毒基因組安制相關(guān)的一系列蛋白質(zhì)，主要功能包括負(fù)鏈RNA,前導(dǎo)RNA,sgmRNA（亞基因組RNA）和子代病RNA的轉(zhuǎn)錄作用以及對多聚蛋白切割產(chǎn)生具有功能產(chǎn)物的蛋白酶切割作用。因此，在病毒感染早期發(fā)揮重要作用。1.2 S（Spike）基因PEDVS基因的啟動密碼子通常并不是用于啟動蛋白質(zhì)的合成，而是翻譯分子量為180220ku的1383個氨基酸的多肽，即S蛋白，該多肽含有29個潛在的N-連接的糖基化位點(diǎn)，是PEDV的1個重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，并有與其他冠狀病謹(jǐn)纖突蛋白相似的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。序列同

10、一性比較表明，PEDVS基因與HCV229E（人冠狀病毒）的序列分別有60%（S2區(qū)）和37.0%（S1區(qū)）的同源性；與FIPV（貓傳染性腹膜炎病春）、TGEV、和CCV（犬冠狀病毒）的S序列分別有59.%60.0%（Sl區(qū)）和35.5%35.9%（S2區(qū)）的同源性。PEDV和HCV229E旁側(cè)序列在迄今所測定的所彳jS蛋白基因中都顯示了保守性。S蛋白在免疫反應(yīng)中起1：要作用，在病毒感染宿主機(jī)體后介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要生物學(xué)作用，如識別靶細(xì)胞、促進(jìn)病毒和細(xì)胞膜融合的作用，故S蛋白被認(rèn)為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原。此外，S蛋白有2729個潛在的糖基化位點(diǎn)，在低滲非離子溶劑中溶解

11、度最大。當(dāng)PH值為4時，S蛋白溶解度最大.而N蛋白則要求pH為9。制備的S蛋白和N蛋白可用作ELISA抗原，分別命名為S-EL1SA和N-ELISA。S-ELISA比N-ELISA更為有效.感染PEDV豬血清中的抗S蛋白抗體比抗N蛋白抗體更為持久，即可在更長的時間中檢測到抗S蛋白的抗體。1.3 0RF3基因ORF3基因能編碼ORF3蛋白。ORF3蛋白為223個氨基酸的多肽，分子質(zhì)量為25.3ku,是一種非結(jié)構(gòu)蛋白，其位置在116784個核其酸之間。ORF3基因編碼的產(chǎn)物存在一個含6個His的尾。ORF3基因至少存在3個可變區(qū)，有短的核甘酸缺失（27nt）對PEDV的2個不同分離株CV777和B

12、rl/87的測序后發(fā)現(xiàn)，這些核1T酸缺失2個分離株都有。ORF3序列中還發(fā)現(xiàn)了兩個功能基序（Motif）:精氨酸酶信號肽和ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn)。由于ORF3基因中核昔酸映失的存在，所以不能通過細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)制ORF3基因產(chǎn)物。對PEDVCV777和Brl/87兩個不同分離株的研究發(fā)現(xiàn)，雖然有時核節(jié)酸酸失是在相同的位置，但缺失并不總是相同。可以認(rèn)為，CV777和Brl/87起源于相同的病毒群，但以后各自進(jìn)化了。Park等（2007）對PEDVDRI3強(qiáng)、弱卷的ORF3序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)致弱的DR13在0RF3有17個氨基酸的缺失，為強(qiáng)、弱毒鑒別診斷方法的建立提供了依據(jù)。說明0RF3基因與病毒毒力

13、有關(guān)虬sM（sma11membrane）基因sM基因編碼E蛋白，E蛋白是PEDV最小的結(jié)構(gòu)蛋白，由76個氛基酸組成，預(yù)測分子量為8.8ku,其散在分布于病毒囊膜上，在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關(guān)重要的作用。PEDV的sM基因序列與HCV229E和TGEV的相比，分別有54%和29%的同源性。PEDV2個病毒分離株CV777和Brl/87的sM基因嚴(yán)格保守。Northern雜交分析PEDV亞基因組RNA時發(fā)現(xiàn)，編碼sM多肽的mRNA同預(yù)測的RNA5（成熟的病毒粒子中的第5個RNA組分）電泳遷移率相同。目前，研究者將PEDV的sM基因和M基因?qū)爰撞《据d體（pSFV）,在BHK-21細(xì)胞中得到

14、了成功的表達(dá)，為進(jìn)一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定了基礎(chǔ)。1.5M（Membrane）基因M基因編碼M蚩白，M蛋白是一種穿膜蛋白，由226個氨基酸組成，分子量介于2732ku之間。對M基因的序列比較分析表明，PEDV與HCV229E和TGEV的同源性分別為57%和53%。CV777和Brl/87核昔酸序列比較分析表明，在M基因上僅有2個核皆酸的差異。M基因非常保守，PCR檢淵時PEDV的引物一般都是針對M基因而設(shè)計的。M蛋白在病毒粒子的組裝和出芽過程中具有重要作用，同時也是病毒刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要結(jié)構(gòu)蛋白。另外，M蛋白能介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生干擾素，所以M蛋白可以作為PEDV基因工程疫苗

15、的候選基因。因此獲得M基因在體外有效的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，無論是對PEDV感染增殖的基礎(chǔ)性研究.還是利用M蛋白進(jìn)行病原鑒定或疾病免疫預(yù)防，均具有重要的理論和實(shí)踐意義?，F(xiàn)已用兔抗肽血清鑒定PEDVM$白，并用桿狀病毒進(jìn)行了表達(dá)?；钚缘腗蛋白為N-糖基化，分了域約為27ku,而重組體桿狀病毒合成的M蛋白（相對分子質(zhì)最）Mr為23ku,H與未糖基化的M蛋白有著相同的電泳遷移率。1.6N（nucleocapsid）基因PEDVN基因編碼N蛋白。N蛋白是PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，主要作用是形成核衣殼，相對分子量為大小為5558ku,由44】個氛基酸組成。對PEDVCV777和Brl/872個分離株N基因序列

16、分析發(fā)現(xiàn)僅有2個堿基的差異，用套式PCR擴(kuò)增4個分離株P(guān)EDVN基因540nt的片段后發(fā)現(xiàn)，其核苻酸序列基本相同。N基因1323個核昔酸的序列表明，PEDV與其他冠狀病毒N基因序列有相當(dāng)部分相同。但PEDVN基因明顯比HCV229E和TGEV大，其中有一段大約135nt的潛在插入存在，其可能位于N基因中央。PEDV與TGEV、HCV229E的N蛋白的明顯不同之處就是在PEDVN蛋白中央部分有一段接近40個疑基酸的特別殘基，其中富含天門冬酰胺，絲氨酸和精氨酸。N某因在氨基酸和核甘酸水平上與HCV229E有很大的同源性，其序列與MHV、IBV、HCV的同源性為12%-19%,與FIPV、CCV、P

17、RCV、TGEV、HCV229E的同源性較高，為32%37%。N步白氨基酸序列比較，PEDV和HCV229E有63個相同的殘基,而和TGEV有49個相同的殘基。PEDV、TGEV、HCV229E的N端序列的一致性比C端高。N基因處于PEDV基因組3端，N基因的3端和poly（A）尾之間有一個11個核皆酸的保守序列，這一序列是病毒復(fù)制過程中RNA負(fù)鏈合成的識別位點(diǎn)。N基因的5,端也存在一個類似于內(nèi)部保守某因?yàn)?nt的序列。N基因還有一個336個核皆酸的ORF,編碼富含Leu的蛋白。適應(yīng)細(xì)胞生長的PEDVN基因含有3個內(nèi)部開放閱讀框（internalopenreadingframes,IORF）,

18、分別命名為IT（113個密碼子）,1-2（63個密碼子）和1-3（72個密碼子），3個IORF均絕對保守。而牛的冠狀病毒（BCV）IORF（208個密碼子）表達(dá)一個與膜有關(guān)的23Ku的蛋白，但其生物學(xué)作用仍有待測定。MHV（鼠肝炎病旄）的IORF（207個密碼子）編碼一結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白與病毒復(fù)制無關(guān)。PEDV所有3個IORF的共同編碼作用與BCV或MHV大約相當(dāng)。野生型PEDVCV777分離株3端整個N基因和非編譯區(qū)的1800個核昔酸序列分析表明，野生型PEDV同適應(yīng)細(xì)胞生長的PEDV相似，N基因下游未發(fā)現(xiàn)其他基因。病危的細(xì)胞培養(yǎng)不會導(dǎo)致該基因組區(qū)任何核樣酸的變化，然而，適應(yīng)細(xì)胞生長的PEDV

19、對新生仔豬的致病力是明顯減弱了，這證明了該段基因及其基因產(chǎn)物對PED病毒致弱無關(guān)。不同冠狀病毒N蛋白比較顯示：在PEDVN蛋白中央行相當(dāng)長的親水區(qū)域。另外N蛋白除和基因組RNA纏繞形成核糖核蛋白（Ribonucleoprotein,RNP）復(fù)合體外，還參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。N蛋白等電點(diǎn)高，缺少糖基化和RNA結(jié)合位點(diǎn)，PEDV完整的N蛋白等電點(diǎn)為10.5,但C端50個殘基的等電點(diǎn)很低，僅為3.4,這是由于其C端殘基通常是帶負(fù)電荷或呈中性。病毒感染細(xì)胞中N蛋白較卡富，N蛋白能與病毒多聚酶作用，或許還有可能同細(xì)胞因子作用，從而改變宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄。N賀白有67個潛在的磷酸化位點(diǎn),在pH9.0低滲非離子

20、溶劑中溶解度最大。N蛋白有3個相對保守的結(jié)構(gòu)域,位于中間的是-個能與病毒RNA前導(dǎo)列結(jié)合的RNA結(jié)合域。此外，在對冠狀病毒一些成員N蛋白亞細(xì)胞定位的研究中表明N蛋白在細(xì)胞核（或核仁）中定位的特征，進(jìn)而也闡明了N蛋白的一些功能，N蛋白作為一個調(diào)節(jié)蛋白起作用，能第F擾宿主細(xì)胞周期，參與細(xì)胞通信，N蛋白還可以抑制干擾素的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。而對PEDVN蛋白亞細(xì)胞定位特征的研究還沒有報道。N蛋白在PEDV的結(jié)構(gòu)蛋白中所占比例最大，在感染的細(xì)胞中能得到大最表達(dá)。豬在感染PEDV的早期，體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白的高水平抗體。又鑒于其冠狀病毒N蛋白保守性強(qiáng)，所以利用N盅白來建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很

21、好的應(yīng)用前景,71.2PED疫苗的研究對PED的預(yù)防和控制應(yīng)以接種疫苗為主，國內(nèi)外的研究者在PED疫苗的研究方面已經(jīng)做了大量的工作，但到目前為止還沒有研制出特別有效的疫苗可以控制PED疾病的發(fā)生。卜面僅就豬流行性腹瀉各類疫苗的研究應(yīng)用現(xiàn)狀及前紋進(jìn)行概述。2.1滅活疫苗滅活疫苗包括組織滅活疫苗和細(xì)胞滅活疫苗。由于組織滅活苗效果很好，目前應(yīng)用最為廣泛。哈爾濱獸醫(yī)研究所、上海農(nóng)科院牧醫(yī)所和江蘇農(nóng)科院牧醫(yī)所等單位試生產(chǎn)。王明等閭用PED滬株研制氫氧化鋁滅活苗接種后海穴，以0.ImL/頭主動免疫3日齡仔豬，保護(hù)率為77.28%,以0.5mL/頭主動免疫接種322日齡豬，保護(hù)率為85%.以5mL/頭被動接

22、種妊娠母豬，其所產(chǎn)3日齡仔豬的保護(hù)率為97.06%。接種疫苗后14d開始產(chǎn)生免疫力，免疫期可達(dá)6個月.細(xì)胞滅活苗制備方便，應(yīng)用也越來越廣泛。馬思奇等明1994）研制的氧氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗的主動免疫試驗(yàn)和被動免疫試驗(yàn)的保護(hù)率分別為88.89%及90.7%,并研制了豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉病毒二聯(lián)富氧化鋁細(xì)胞滅活疫苗，滅活前毒價均為107.0-107.5TCID50/0.3mL,主動免疫保護(hù)率：TGE為100%、PED為92%,被動免疫保護(hù)率：TGE為87.9%、PED為82.4%,免疫期均為6個月。疫苗保存期1年，田間試驗(yàn)保護(hù)率92%96.35%。2.2細(xì)胞弱毒苗由于滅活苗產(chǎn)生完全免疫力需要

23、2周時間，且劑最偏大，不利于緊急預(yù)防與降低疫苗費(fèi)用，所以又研制了細(xì)胞弱毒苗。國外Park等聊將PEDV經(jīng)Vero細(xì)胞致弱后的毒株DR13,通過口服和肌肉注射兩種途徑免疫晚期妊娠母豬，觀察所產(chǎn)仔豬的發(fā)病率。結(jié)果口服免疫組的發(fā)病率（13%）遠(yuǎn)低于肌肉注射免疫組（60%）,口口服免疫組仔豬抗PEDV的SIgA含量明顯高于肌肉注射免疫組。研究表明，可應(yīng)用PEDV細(xì)胞弱毒苗經(jīng)口免疫晚期妊娠母豬，從而有效預(yù)防PEDV感染。Kweon等明用分離到的野毒株（命名為KPEDV-9），使之適應(yīng)Vero細(xì)胞并連續(xù)傳代至93代，進(jìn)行主動免疫試驗(yàn)、被動免疫試驗(yàn)以及安全性試驗(yàn)，結(jié)果都證實(shí)可作為弱毒苗使用。適應(yīng)Vero細(xì)胞

24、并連續(xù)傳代至93代的KPEDV9,接種妊娠母豬.ELISA檢測結(jié)果表明，伴豬免疫應(yīng)答水平大幅度提高，且新生仔豬可抵抗PEDV野毒感染。國內(nèi)佟有恩等用CV777株強(qiáng)毒株適應(yīng)Vero細(xì)胞系，并在83代后適應(yīng)了仔豬腎原代細(xì)胞。以104124代細(xì)胞適應(yīng)毒制備5批疫苗，主動免疫試驗(yàn)的總保護(hù)率為95.92%以106139代細(xì)胞適應(yīng)毒制備的8批疫苗，主動免疫試驗(yàn)的總保護(hù)率為96.2%.在與TGEV弱毒組合制備的二聯(lián)弱毒苗的初步田間試驗(yàn)中取得良好效果。2.3乳酸桿菌疫苗乳酸桿常作為微生態(tài)制劑中的主要益生菌，廣泛應(yīng)用于食品、飼料加工業(yè)。構(gòu)建乳酸桿菌質(zhì)粒栽體，表達(dá)在黏膜系統(tǒng)中增殖的病原微生物的保護(hù)性抗原基因，制備

25、綠色環(huán)保、可食用的多功能黏膜免疫的微生態(tài)制削疫苗應(yīng)用前景廣闊。而黏膜免疫恰恰是防治TGE和PED的主要途徑。因此，研制刺激腸道黏膜免疫系統(tǒng)的TGE和PED基因工程乳酸桿菌疫苗有重要意義。目前，有的實(shí)驗(yàn)室正在開展乳酸桿菌表達(dá)TGEV,PEDV主要保護(hù)性抗原基因的研究。此研究擬從健康豬體內(nèi)分離鑒定出乳酸桿菌，井進(jìn)一步篩選出thyA基因缺陷型乳酸桿菌，構(gòu)建含有TGEV或PEDV主要保護(hù)性抗原基因的以thyA基因?yàn)檫x擇壓力的非抗性乳酸桿菌表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化乳酸桿榮，制備基因工程乳酸桿菌疫苗。目前已筋選出2株thyA基因缺陷型乳酸桿曲，并已初步鑒定。TGEV、PEDV的S基因的克隆擴(kuò)增工作亦已結(jié)束虬2.4轉(zhuǎn)

26、基因植物疫苗Yang等財（2003）將PEDV的S基因轉(zhuǎn)入煙草中，提取轉(zhuǎn)基因植物蛋白給小鼠注射，進(jìn)行血清蝕斑減數(shù)中和測定，證明其具有免疫原性。給小鼠飼喂這種轉(zhuǎn)基因植物可i秀導(dǎo)小鼠產(chǎn)生全身免疫和黏膜免疫。Yang等（2005）相繼應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)入法將PEDV的S基因的主要抗原位點(diǎn)（命名為K-COE）和合成的PEDV中和抗原表位在煙草中表達(dá)，前者重組體蛋白占轉(zhuǎn)基因煙草葉片總可溶性植物蛋白含量的0.1%,后者含量則為2.1%。這些研究為研制PEDV口服轉(zhuǎn)基因植物疫苗提供了新的思路?？谇?，在以煙草花葉病毒為載體的無煙堿煙草植物中PEDV的S蛋白中和表位得到了成功表達(dá)，用表達(dá)蛋白免疫接種后.對仔

27、豬具有良好的保護(hù)作用，為PEDV轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。一些研究者將PEDV的E基因和M基因?qū)爰撞《疚殷w中，在BIIK-21細(xì)胞中得到了成功表達(dá)，這為進(jìn)一步探討E蛋白和M蛋白在抗病毒中的作用奠定r基礎(chǔ)。植物的多種優(yōu)越性均可被用于研究轉(zhuǎn)基因疫苗，并ft已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。但仍有一些障礙必須克服，如蛋白在植物中的表達(dá)水平低、表達(dá)產(chǎn)物在植物中的愆定性差、轉(zhuǎn)基因口服疫苗在產(chǎn)生免疫反應(yīng)之前在胃腸道內(nèi)有時被消化等，科學(xué)家就這些問題進(jìn)行了研究并正在加以解決。2.5核酸疫苗核酸疫苗又稱為基因疫苗、DNA疫苗，是20世紀(jì)90年代初從基因治療研究領(lǐng)域發(fā)展起來的一種全新疫苗，與傳統(tǒng)的弱毒或滅活疫苗相比，

28、DNA疫苗具有不散毒、不返強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。DNA疫苗還具有可以制成標(biāo)記性疫苗，便于臨床診斷監(jiān)測I疫苗性質(zhì)穩(wěn)定，便于儲存和運(yùn)輸；應(yīng)用范圍廣，不僅可用于傳染病和寄生蟲病的免疫預(yù)防，而旦還能夠用于腫瘤、自身免疫、過敏反應(yīng)等疾病的治療等優(yōu)點(diǎn)。另外，與亞單位疫苗相比，具有能長期激發(fā)機(jī)體體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)、制備工藝簡單和費(fèi)用低廉（不用純化蛋白）的優(yōu)點(diǎn)。雖然核酸疫苗兼具亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗的有效性，但核酸疫苗也存在整合到宿主染色體、致突變、產(chǎn)生抗菌素DNA抗體等危險性，其安全性還有待于進(jìn)一步觀察。豬流行性腹瀉核酸疫苗的研究還處于起步階段，是今后研究的熱點(diǎn)之一。2.6多價聯(lián)合疫苗TGEV和PEDV均屬冠狀

29、病毒，致病機(jī)理相似，組織嗜性相同。因此，研制聯(lián)苗亦是可行的。尤其在我國豬病毒性腹瀉廣泛流行，研制多聯(lián)苗更是十分必要的。2.6.1TGEV與PEDV二聯(lián)疫苗該系列產(chǎn)品包括豬傳染性胃肪炎（TGE）和豬流行性腹瀉（PED）二聯(lián)滅活苗、二聯(lián)活疫苗和弱毒二聯(lián)疫苗，二聯(lián)天活苗和二聯(lián)活疫苗是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的馬思奇、佟有恩共同主持完成的。該二聯(lián)疫苗的特點(diǎn)是：毒價高，后海穴接種（是對常規(guī)免疫途徑的突破），增強(qiáng)了免疫保護(hù)力，一次接種即可，省時、省力。經(jīng)國內(nèi)外聯(lián)機(jī)檢索查新證明，該二聯(lián)苗是國際領(lǐng)先研制成功的，并在技術(shù)上有原始創(chuàng)新。兩種疫苗可用于主動免疫保護(hù)不同年齡的豬只，但主要用于妊娠母豬的被動免疫

30、以保護(hù)仔豬。其中二聯(lián)滅活苗主動免疫保護(hù)率為96%,被動免疫保護(hù)率為85.1%,二聯(lián)活疫苗主動免疫保護(hù)率為97.7%,被動免疫保護(hù)率為98%。2種二聯(lián)疫苗的免疫期均為6個月，仔豬被動免疫期是哺乳期至斷奶后1周。二聯(lián)滅活疫苗在免疫后14d產(chǎn)生免疫力,二聯(lián)活疫苗免疫后7d產(chǎn)生堅強(qiáng)的保護(hù)。PED和TGE弱毒二聯(lián)疫苗是用豬流行性腹瀉弱毒疫苗株P(guān)EDV-G1P83和豬傳染性胃腸炎弱毒疫苗株TGEV-AG1制成。用該弱毒二聯(lián)疫苗進(jìn)行了保存期試驗(yàn)、安全效力、免疫期試驗(yàn)和區(qū)域試照。結(jié)果表明，試驗(yàn)疫苗在-2or保存4個月，經(jīng)4個月保存的疫苗免疫效力未見下降。4C保存48h對疫苗病毒的毒價沒有明顯影響。用該弱毒二聯(lián)

31、疫苗按程序免疫妊娠母豬，對妊娠毋豬安全，其仔豬獲得了良好的被動免疫。其對PEDV強(qiáng)毒、TGEV強(qiáng)毒和2種強(qiáng)毒混合攻擊的免疫效力分別達(dá)90.48%、93.75%和87.5%。用二聯(lián)弱毒疫苗免疫810日齡的哺乳仔豬證明安全，28日齡時（25日齡斷奶）分別用PEDV強(qiáng)毒.TGEV強(qiáng)毒和2種混合強(qiáng)毒攻擊，免疫效力分別為100%、99.9%和73.3%。結(jié)果表明，該弱毒二聯(lián)疫苗能夠安全地對妊娠母豬和哺乳仔豬進(jìn)行免疫，免疫后能有效地保護(hù)初生仔豬、斷奶豬和肥育豬抵抗TGEV和PEDV強(qiáng)毒的攻擊。該弱毒：聯(lián)疫苗在區(qū)域試驗(yàn)中能顯著降低豬病毒性腹瀉的發(fā)病率和死亡率。2.6.2PEDV、TGEV、RV三聯(lián)滅活苗上海

32、農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所錢永清等明采用豬流行性腹瀉病哉（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬輪狀病毒（RV）細(xì)胞培養(yǎng)物制備了三聯(lián)滅活疫苗。實(shí)驗(yàn)室免疫結(jié)果表明，妊娠母豬和育肥豬免疫后15d達(dá)到較高的免疫水平，免疫有效期超過6個月，妊娠母豬所產(chǎn)仔豬可獲得高水平的被動免疫保護(hù)。試驗(yàn)場應(yīng)用結(jié)果表明，母豬保護(hù)率達(dá)98%,仔豬被動免疫保護(hù)率達(dá)93%。綜上所述，PEDV的基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA。其中Pol基因在病毒感染早期發(fā)揮重要作用，S基因被認(rèn)為是發(fā)展有效抵抗冠狀病毒的主要靶抗原ORF3基因與病毒毒力有關(guān)，sM基因在病毒的自我組裝和出芽過程中起至關(guān)重要的作用，M基因編碼的M蛋白可以作為PE

33、DV基因工程疫苗的候選抗原，又鑒于冠狀病毒N蛋白保守性強(qiáng)，所以利用N基因編碼的N蛋白來建立PEDV分子生物學(xué)診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。但豬流行性腹瀉病毒全基因組結(jié)構(gòu)還需要深入研究。疫苗研制的最佳構(gòu)想應(yīng)該包括安全、有效果、多價、成本低及保存和使用方便等，但要達(dá)到上述目標(biāo)還需要一個漫長的過程。PED疫苗的研究已經(jīng)取得了一些可喜的進(jìn)展.隨著人們對病毒致病原認(rèn)識的不斷深入，研制的PED疫苗也在不斷完善，相信不久的將來科學(xué)家們會研制出特別有效的疫苗來控制PED疾病的發(fā)生。參考文獻(xiàn)（1BrianDA,BaricRS.CoronavirusgenomestructureandreplicationJ）.C

34、urrTopMicrobiolImniunol,2005,287:130.KnipcDM,HowleyPM,GriffinDE.eta1.Fieldsvirology（5thedXMj.Philadelphia：LippincottWilliams&WUkins,2007:707-736.3KangTJ,SeoJE,KimDH,etal.CloningandsequenceanalysisoftheKoreanstrainofspikegeneofPorcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplantsf

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