狂犬病口服疫苗研究進展.docx

1、狂犬屆口服匠苗GR禿迅展劉媽.王學(xué)林，郭恒，孫樹民(吉林大學(xué)人喜共患病研究所.吉林長春130062)狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染引起的-種人答共患急性傳染病?？袢≡谑澜绶秶鷥?nèi)廣泛流行。調(diào)杳表明，我國農(nóng)村地區(qū)犬只免疫率僅為10%20%,貓則幾乎沒有進行過免疫，形成不了免疫屏障。而旦，我國狂犬病病例多未進行暴露后處置或處置不規(guī)范。面對這種極為嚴峻的形勢，唯一簡便有效的方法就是研制口服疫苗建立免疫群，最終達到消除狂犬病的目的。一、口服狂犬病毒疫苗毒株隨若對殘犬病舉疫苗技術(shù)研究的深入，有許多種病毒被用來研究門服疫苗。ERA株活疫苗能有效刺激狗和浣族產(chǎn)生中和

2、抗體，具有很好的保護性，但對鼠等咽齒動物、貓、臭鼬具有致病性。SAD-Bem株疫苗對紅狐有很好的保護作用，但對咽齒動物和狒狒具有一定的致病性。SAD-BI9株在實驗室研究中，對狐貍和浣熊做口服試照結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清陽轉(zhuǎn)率很高，但SAD-BI9株疫苗對鼠有一定的致病性。SAD-P5/88疫苗主要對部分咽齒動物是致命的。源于SAD-Bem株的雙突變株SAGI株，均是無毒的，無論【I服、肌注、腦注和免疫削量如何，對成年小鼠和狐貍均無致病性，但對倉鼠是致病的。CTN-1株制備的口服狂犬病疫苗給家犬一次性口服，可獲得長達15個月的免疫力°1989年又將該毒株適應(yīng)Ver。細胞，制備的口服疫苗口服免疫

3、家鼠，抗體陽轉(zhuǎn)率達80%以上。1996年鄭海發(fā)等乂采用CTN-1株經(jīng)Vero細胞傳15代,制備狂犬口服疫苗，口服乳犬，結(jié)果表明該疫苗病逐對乳犬口服無致病性，而11疫苗抗體陽轉(zhuǎn)率很高。二、減毒活疫苗與滅活疫苗相比較，減毒活疫苗可以誘導(dǎo)強的細胞毒性T細胞(CTE)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而滅活疫苗不能誘導(dǎo)T細胞免疫。反向遺傳操作系統(tǒng)方法是新近發(fā)明的方法，應(yīng)用該方法通過修改狂犬病病毒糖蛋白與毒力相關(guān)的位點和蛋白的膜外區(qū)，"以重組出更安全、更有效的減毒活疫苗?？袢《镜姆聪蜻z傳學(xué)操作系統(tǒng)，迄今為止已經(jīng)程到弋速發(fā)展。艾軍等應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)拯救出重組病毒HEP-Flury(NIG2),獲得了適應(yīng)BH

4、K-21細胞的病毒克隆株，改組病毒的致病性已明顯降低、在BHK-21細胞中的病毒滴度逐漸升高。12等用RV強毒株，證明G基因是RV毒力決定基因，并通過實驗進一步證實糖蛋白333位氨基酸是毒力決定位點。郭宵峰等于2006年運用基因突變、反向遺傳技術(shù)的原理與方法成功地拯救已發(fā)生基因面排的狂犬病毒。郭利等于2009年采用負鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建減毒株ERAG6,減弱了其潛在的毒力歸的危險，為研制更加安全有效的狂犬病減毒活疫苗打下堅實的技術(shù)基礎(chǔ)。Dietzschold把編碼細胞凋亡蛋由基因插入到狂犬病病毒中，通過該蛋白刺激免疫或干預(yù)病毒的致病性來增強疫苗的效力和安全性。三、轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗表

5、達狂犬病病毒抗原蛋白的植物可能成為人或動物疫苗的廉價來源，特別對于發(fā)展中國家，這種疫苗更有推廣價值。目前報道有兩種方法能夠在植物中表達狂犬病病毒抗原基因。第一種方法是直接種植表達狂犬病病毒抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。McGarvey等于1995年通過這種方法率先在西紅柿中的葉片和果實中表達糖蛋白，但其相對較低的抗原蛋白表達最可能不足以避免動物受到病毒的攻擊。第二種方法是構(gòu)建重組植物病毒，然后用重組的植物病毒感染植物，用分離的病毒粒子免疫動物或直接用病毒感染的植物葉片飼喂動物就可起到免疫效果。Yusibov等于1997年成功構(gòu)建了帶有糖蛋白B細胞表位和核蛋白T細胞抗原表位的重組AIMV病毒。通過純化的

6、病毒粒子腹腔免疫小鼠，小鼠能產(chǎn)生中和抗體。Yusibov等又于2002年用重組病逐感染的液菜葉給受試者食用，結(jié)果表明植物病毒表達系統(tǒng)具有用作狂犬病口服加強免疫的潛力。但是，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表達水平還相當?shù)?，然而，表達水平方面的技術(shù)難題一旦攻破，將為生產(chǎn)安全廉價有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁榮的前景。四、重組活載體疫苗人們希望發(fā)展-種既保留狂犬病病毒完整的免疫原性而又不含狂犬病致病的疫苗，目前研究得最多的是重組活載體疫苗。故是當前認為最有開發(fā)和應(yīng)用前景的動物疫苗。該活載體疫苗克服了常規(guī)疫苗的缺點，兼有死疫苗和活疫苗的優(yōu)點,在免疫效力上有很強的優(yōu)勢。（一）桿狀病毒載體有資料

7、報道，具有免疫反應(yīng)性和保護性的狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白，已在桿狀病毒-昆蟲細胞系統(tǒng)獲得成功表達，并可大量生產(chǎn)，易于純化精制。桿狀病毒表達系統(tǒng)是比較理想的真核表達系統(tǒng)。狂犬病病毒G基因在異源宿主系統(tǒng)桿狀病毒中的高效表達，為大規(guī)模地制備亞單位疫苗提供了另一條可能的途徑。1990年P(guān)rehaud等將CVS株G基因插入苜蓿Y紋夜蛾核型多角體病毒轉(zhuǎn)移我體上，與ACNPVDNA共轉(zhuǎn)染Sf9,結(jié)果發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒糖蛋門表達產(chǎn)量高，而且有免疫原性。FuZF把ERA株G基因和N基因分別重組到桿狀病毒中，分別用純化表達的G蛋白和N蛋白免疫浣熊和小鼠，均能誘生抗狂犬病病毒的中和抗體和抵抗街毒致死削量的攻擊，從而顯示了

8、此種疫苗的口服使用前換。（二）痘病毒載體用痘苗病毒做載體具有許多優(yōu)點，比如：病毒栽體本身無毒性，對目標動物和非目標動物都是安全的；制備的疫苗具有很好的保護性,可以通過消化道免疫動物以及具有熱穩(wěn)定性，在野外可以存活一個月以上，其最先被用于狂犬病口服疫苗的構(gòu)建中。重組活裁體疫苗中以痕苗病毒為載體V2RG研究的最為清楚、應(yīng)用得也最廣泛。2（X）1年Blaso用表達G蛋白的重組痘苗病毒疫苗免疫雌狐，表明用跋組痘苗病雀載體有可能適合于幼狐的免疫。在痘病毒中插入狂犬病病毒ERA株的慵蛋白基因，研制出安全有效的vCP16重組病旄疫苗，重組CPV狂犬病病毒疫苗保護小鼠、貓和狗抵抗致死性狂犬病病毒攻擊所需的接種

9、劑最很低。用重組CPV狂犬病病誰疫苗，替代目前已有的狂犬病病毒疫苗能取得很好的效果。（三）腺病毒載體腺病毒基因重組活載體疫苗已成為當前開發(fā)研制經(jīng)濟、安全、有效，旦使用方便的新型疫苗中十分活躍的領(lǐng)域。目前，基干犬2型腺病毒、猴蹤病毒、腺相關(guān)病毒等的狂犬口服疫苗的研究也都在進行中，有的已進入臨床試凝階段，對載體病很的減毒及狂犬保護性抗原基因的修飾是研究的熱點問題。1990年加拿大Prevec等用基因重組技術(shù)將狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因表達狂犬病病毒糖蛋白的AdRGl。體內(nèi)外試騁均證實AdRGl均可誘生高水平的中和抗體，保護動物抵抗致死劑量狂犬病病毒的攻擊。1992年Charlton等以重組腺病毒

10、疫苗給臭鼬和紅狐貍口服免疫，證明安全有效可抵抗病毒的攻擊。ZhouD等構(gòu)建了表達狂犬病病毒精蛋白的黑猩猩腺病毒，該病毒可以作為服疫苗，保護機體免受狂犬病病也的感染。2005年張守峰等構(gòu)建出狂犬病病毒情蛋白的重組犬2型腺病毒，在細胞當中包裝出毒，通過采用各種接種途徑都伏得了令人滿意的效果。（四）細菌載體除了病毒作為載體的疫苗外，還可以利用細菌作為運栽體。對沙口氏菌為疫苗運載體的口服疫苗的免疫學(xué)基礎(chǔ)了解得比較全面，有很多資料顯示以鼠傷寒沙門氏菌為運載體構(gòu)建的其它疫苗都有報道，故有學(xué)者將沙門氏菌和狂犬病病毒疫苗緊密的結(jié)合在一起,目前這種新型的粘膜免疫的口服疫苗正在研究之中。其大致可能機理如下：將狂犬

11、病病毒G和N具有抗原性蛋白的外源基因，克隆到表達質(zhì)粒中，然后將該重組成粒電轉(zhuǎn)入減毒沙門氏菌。用此重組減毒沙門氏菌對動物和人進行粘膜免疫（口服或鼻腔免疫）。這種方法制備的口服疫苗廉價、接種方式簡便，毋需專門醫(yī)護人員，適用于大群體免疫，1L可避免因注射接種而感染血源傳播的疾病。此外，以減毒沙門氏菌為我體的疫苗抗原不需要提純、制備簡單、易于儲存和運輸，可顯著降低疫苗的制作成本。鑒于這些優(yōu)點，減毒取傷寒沙門氏常可成為狂犬疫苗的優(yōu)良載體，用于某些細萌、病毒、寄生蟲、腫瘤性疾病的預(yù)防或治療性疫苗。五、DNA疫苗在一些動物實驗?zāi)Ｐ椭?，DNA疫苗預(yù)防狂犬病有較好的效果。目前，傳統(tǒng)DNA疫苗存在的抗體應(yīng)答弱的缺

12、陷徘到很大改善，通過使用佐劑、對DNA質(zhì)粒的改造及免疫利量和次數(shù)的優(yōu)化，ManprcctKaur等構(gòu)建了一種有效的狂犬DNA疫蒞，動物保護率為100%,中和抗體滴度為4IU/ml。但是這種傳統(tǒng)的DNA疫苗接種，需要極高劑量的質(zhì)粒，在人體內(nèi)免疫原性很弱，使人們不得不考慮尋找有效的DNA疫苗的運我系統(tǒng)。近年來，DNA疫苗的運裁系統(tǒng)IIII毒混感多肽注射液的體外抑菌試驗及人工攻毒試驗研究向世忠商樹林？，張國紅3,劉利春4.郭世勤杜國清5（1四川省宣:漢縣畜牧獸醫(yī)協(xié)會.四川宣漢636150:2.四川省宙波縣畝牧獸醫(yī)局.四川荷波616550：3.四川西科晴尖獸藥飼料生物工程研究中心.四川綿陽621023

13、；4四川西呂學(xué)院動物科學(xué)系.四川西昌615000；5.四川精尖動物疫病研究中心.四川緝陽621023）組別大廊桿傷螺沙門氏殲血毒混感多肽注射液211718琥酸慶大尊素注射液171611鹽酸林可卷素注射液111210表1體外抑菌試驗結(jié)果（單位：mm）豬大腸桿聞病、傷寒沙門氏桿萌病、痢疾桿菌病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中比較常見11較多發(fā)的細菌性疾病病，危害較大。目前，在臨床中，由于抗生素的非合理使用，使得病原萌對一些抗生素產(chǎn)生較強的耐藥性。課題組采用脂質(zhì)體技術(shù)研制了由多雨組分制備的復(fù)方制劑一血茬混感多肽注射液，為臨床用藥增加了輪換、選擇的機會，可在一定程度上改善臨床因長期不規(guī)范、不合理使用抗生素而產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)

14、象?，F(xiàn)將該藥的體外抑慎情況和人工攻毒防治試驗結(jié)果報告如下。一、材料（一）供試藥物血毒混感多肽注射液的主耍成分為磺胺間甲氧喧璇鈉、硫酸慶大零素、林可密素等，各成分按一定比例，采用脂質(zhì)體技術(shù)和工藝制備的油相脂成體注射液，10ml/支，批號：20090709,由四川西科精尖獸藥飼料生物工程研究中心試制。硫酸安普霉素、硫酸慶大毒素、鹽酸林可毒素均購F綿陽天誠藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢測屬合格產(chǎn)品。（二）菌種豬大腸桿菌、傷寒沙門氏桿菌、詢疾桿菌，由四川精尖動物疫病研究中心從臨床自然病例中分離。（三）藥敏片硫酸慶大毒素-鹽酸林可族素、硫酸慶大容素、鹽酸林可霉素紙片，由四川精尖動物疫病研究中心提供。二、試驗方法（一

15、）菌液的制備將三種菌分別接種于適宜的培養(yǎng)基上，于37C培養(yǎng)使其活化。然后接種在營養(yǎng)肉湯中，置37C溫箱培養(yǎng)，取出后用肉湯稀釋到10KT，備用。（二）體外抑菌試驗采用藥敏紙片法。（三）人工攻毒防治試驗雙月齡斷奶健康仔豬390頭，分別進行豬大腸桿函、傷寒沙門氏桿菌、痢疾桿菌的攻毒防治試驗。將390頭仔豬隨機分成13組，每組30頭，設(shè)攻毒對照組、血毒混感多肽治療組、硫酸慶大容素組、鹽酸林可霉素組、健康對照組（共同對照）。健康對照組不攻毒不給藥，攻毒對照組只攻茬不給藥，血毒混感多肽預(yù)防組從攻毒前8h開始給藥（按0.2ml/kg給藥），硫酸慶大每索組按0.2ml/也有了更深入的研究，這為狂犬口服DNA疫苗的發(fā)展提供了廣闊的空間。利用沙門氏菌為DNA疫苗運載體的研究已有成功范例。沙門氏御作為活疫苗載體技術(shù)發(fā)展迅猛，以往激發(fā)免疫應(yīng)答偏弱的缺陷得以改善。當前沙門氏保i致弱手段非常成熟，而沙門氏菌進入體內(nèi)后被巨噬細胞吞噬進而在吞噬體內(nèi)溶解以及外源