狂犬病口服疫苗研究進(jìn)展.docx

1、狂犬屆口服匠苗GR禿迅展劉媽.王學(xué)林，郭恒，孫樹(shù)民(吉林大學(xué)人喜共患病研究所.吉林長(zhǎng)春130062)狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)感染引起的-種人答共患急性傳染病?？袢≡谑澜绶秶鷥?nèi)廣泛流行。調(diào)杳表明，我國(guó)農(nóng)村地區(qū)犬只免疫率僅為10%20%,貓則幾乎沒(méi)有進(jìn)行過(guò)免疫，形成不了免疫屏障。而旦，我國(guó)狂犬病病例多未進(jìn)行暴露后處置或處置不規(guī)范。面對(duì)這種極為嚴(yán)峻的形勢(shì)，唯一簡(jiǎn)便有效的方法就是研制口服疫苗建立免疫群，最終達(dá)到消除狂犬病的目的。一、口服狂犬病毒疫苗毒株隨若對(duì)殘犬病舉疫苗技術(shù)研究的深入，有許多種病毒被用來(lái)研究門(mén)服疫苗。ERA株活疫苗能有效刺激狗和浣族產(chǎn)生中和

2、抗體，具有很好的保護(hù)性，但對(duì)鼠等咽齒動(dòng)物、貓、臭鼬具有致病性。SAD-Bem株疫苗對(duì)紅狐有很好的保護(hù)作用，但對(duì)咽齒動(dòng)物和狒狒具有一定的致病性。SAD-BI9株在實(shí)驗(yàn)室研究中，對(duì)狐貍和浣熊做口服試照結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清陽(yáng)轉(zhuǎn)率很高，但SAD-BI9株疫苗對(duì)鼠有一定的致病性。SAD-P5/88疫苗主要對(duì)部分咽齒動(dòng)物是致命的。源于SAD-Bem株的雙突變株SAGI株，均是無(wú)毒的，無(wú)論【I服、肌注、腦注和免疫削量如何，對(duì)成年小鼠和狐貍均無(wú)致病性，但對(duì)倉(cāng)鼠是致病的。CTN-1株制備的口服狂犬病疫苗給家犬一次性口服，可獲得長(zhǎng)達(dá)15個(gè)月的免疫力°1989年又將該毒株適應(yīng)Ver。細(xì)胞，制備的口服疫苗口服免疫

3、家鼠，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)80%以上。1996年鄭海發(fā)等乂采用CTN-1株經(jīng)Vero細(xì)胞傳15代,制備狂犬口服疫苗，口服乳犬，結(jié)果表明該疫苗病逐對(duì)乳犬口服無(wú)致病性，而11疫苗抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率很高。二、減毒活疫苗與滅活疫苗相比較，減毒活疫苗可以誘導(dǎo)強(qiáng)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTE)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，而滅活疫苗不能誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫。反向遺傳操作系統(tǒng)方法是新近發(fā)明的方法，應(yīng)用該方法通過(guò)修改狂犬病病毒糖蛋白與毒力相關(guān)的位點(diǎn)和蛋白的膜外區(qū)，"以重組出更安全、更有效的減毒活疫苗?？袢《镜姆聪蜻z傳學(xué)操作系統(tǒng)，迄今為止已經(jīng)程到弋速發(fā)展。艾軍等應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)拯救出重組病毒HEP-Flury(NIG2),獲得了適應(yīng)BH

4、K-21細(xì)胞的病毒克隆株，改組病毒的致病性已明顯降低、在BHK-21細(xì)胞中的病毒滴度逐漸升高。12等用RV強(qiáng)毒株，證明G基因是RV毒力決定基因，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)糖蛋白333位氨基酸是毒力決定位點(diǎn)。郭宵峰等于2006年運(yùn)用基因突變、反向遺傳技術(shù)的原理與方法成功地拯救已發(fā)生基因面排的狂犬病毒。郭利等于2009年采用負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建減毒株ERAG6,減弱了其潛在的毒力歸的危險(xiǎn)，為研制更加安全有效的狂犬病減毒活疫苗打下堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。Dietzschold把編碼細(xì)胞凋亡蛋由基因插入到狂犬病病毒中，通過(guò)該蛋白刺激免疫或干預(yù)病毒的致病性來(lái)增強(qiáng)疫苗的效力和安全性。三、轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗表

5、達(dá)狂犬病病毒抗原蛋白的植物可能成為人或動(dòng)物疫苗的廉價(jià)來(lái)源，特別對(duì)于發(fā)展中國(guó)家，這種疫苗更有推廣價(jià)值。目前報(bào)道有兩種方法能夠在植物中表達(dá)狂犬病病毒抗原基因。第一種方法是直接種植表達(dá)狂犬病病毒抗原蛋白的轉(zhuǎn)基因植物。McGarvey等于1995年通過(guò)這種方法率先在西紅柿中的葉片和果實(shí)中表達(dá)糖蛋白，但其相對(duì)較低的抗原蛋白表達(dá)最可能不足以避免動(dòng)物受到病毒的攻擊。第二種方法是構(gòu)建重組植物病毒，然后用重組的植物病毒感染植物，用分離的病毒粒子免疫動(dòng)物或直接用病毒感染的植物葉片飼喂動(dòng)物就可起到免疫效果。Yusibov等于1997年成功構(gòu)建了帶有糖蛋白B細(xì)胞表位和核蛋白T細(xì)胞抗原表位的重組AIMV病毒。通過(guò)純化的

6、病毒粒子腹腔免疫小鼠，小鼠能產(chǎn)生中和抗體。Yusibov等又于2002年用重組病逐感染的液菜葉給受試者食用，結(jié)果表明植物病毒表達(dá)系統(tǒng)具有用作狂犬病口服加強(qiáng)免疫的潛力。但是，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表達(dá)水平還相當(dāng)?shù)?，然而，表達(dá)水平方面的技術(shù)難題一旦攻破，將為生產(chǎn)安全廉價(jià)有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁榮的前景。四、重組活載體疫苗人們希望發(fā)展-種既保留狂犬病病毒完整的免疫原性而又不含狂犬病致病的疫苗，目前研究得最多的是重組活載體疫苗。故是當(dāng)前認(rèn)為最有開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景的動(dòng)物疫苗。該活載體疫苗克服了常規(guī)疫苗的缺點(diǎn)，兼有死疫苗和活疫苗的優(yōu)點(diǎn),在免疫效力上有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。（一）桿狀病毒載體有資料

7、報(bào)道，具有免疫反應(yīng)性和保護(hù)性的狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白，已在桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)獲得成功表達(dá)，并可大量生產(chǎn)，易于純化精制。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是比較理想的真核表達(dá)系統(tǒng)?？袢〔《綠基因在異源宿主系統(tǒng)桿狀病毒中的高效表達(dá)，為大規(guī)模地制備亞單位疫苗提供了另一條可能的途徑。1990年P(guān)rehaud等將CVS株G基因插入苜蓿Y紋夜蛾核型多角體病毒轉(zhuǎn)移我體上，與ACNPVDNA共轉(zhuǎn)染Sf9,結(jié)果發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒糖蛋門(mén)表達(dá)產(chǎn)量高，而且有免疫原性。FuZF把ERA株G基因和N基因分別重組到桿狀病毒中，分別用純化表達(dá)的G蛋白和N蛋白免疫浣熊和小鼠，均能誘生抗狂犬病病毒的中和抗體和抵抗街毒致死削量的攻擊，從而顯示了

8、此種疫苗的口服使用前換。（二）痘病毒載體用痘苗病毒做載體具有許多優(yōu)點(diǎn)，比如：病毒栽體本身無(wú)毒性，對(duì)目標(biāo)動(dòng)物和非目標(biāo)動(dòng)物都是安全的；制備的疫苗具有很好的保護(hù)性,可以通過(guò)消化道免疫動(dòng)物以及具有熱穩(wěn)定性，在野外可以存活一個(gè)月以上，其最先被用于狂犬病口服疫苗的構(gòu)建中。重組活裁體疫苗中以痕苗病毒為載體V2RG研究的最為清楚、應(yīng)用得也最廣泛。2（X）1年Blaso用表達(dá)G蛋白的重組痘苗病毒疫苗免疫雌狐，表明用跋組痘苗病雀載體有可能適合于幼狐的免疫。在痘病毒中插入狂犬病病毒ERA株的慵蛋白基因，研制出安全有效的vCP16重組病旄疫苗，重組CPV狂犬病病毒疫苗保護(hù)小鼠、貓和狗抵抗致死性狂犬病病毒攻擊所需的接種

9、劑最很低。用重組CPV狂犬病病誰(shuí)疫苗，替代目前已有的狂犬病病毒疫苗能取得很好的效果。（三）腺病毒載體腺病毒基因重組活載體疫苗已成為當(dāng)前開(kāi)發(fā)研制經(jīng)濟(jì)、安全、有效，旦使用方便的新型疫苗中十分活躍的領(lǐng)域。目前，基干犬2型腺病毒、猴蹤病毒、腺相關(guān)病毒等的狂犬口服疫苗的研究也都在進(jìn)行中，有的已進(jìn)入臨床試凝階段，對(duì)載體病很的減毒及狂犬保護(hù)性抗原基因的修飾是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。1990年加拿大Prevec等用基因重組技術(shù)將狂犬病病毒ERA株糖蛋白基因表達(dá)狂犬病病毒糖蛋白的AdRGl。體內(nèi)外試騁均證實(shí)AdRGl均可誘生高水平的中和抗體，保護(hù)動(dòng)物抵抗致死劑量狂犬病病毒的攻擊。1992年Charlton等以重組腺病毒

10、疫苗給臭鼬和紅狐貍口服免疫，證明安全有效可抵抗病毒的攻擊。ZhouD等構(gòu)建了表達(dá)狂犬病病毒精蛋白的黑猩猩腺病毒，該病毒可以作為服疫苗，保護(hù)機(jī)體免受狂犬病病也的感染。2005年張守峰等構(gòu)建出狂犬病病毒情蛋白的重組犬2型腺病毒，在細(xì)胞當(dāng)中包裝出毒，通過(guò)采用各種接種途徑都伏得了令人滿意的效果。（四）細(xì)菌載體除了病毒作為載體的疫苗外，還可以利用細(xì)菌作為運(yùn)栽體。對(duì)沙口氏菌為疫苗運(yùn)載體的口服疫苗的免疫學(xué)基礎(chǔ)了解得比較全面，有很多資料顯示以鼠傷寒沙門(mén)氏菌為運(yùn)載體構(gòu)建的其它疫苗都有報(bào)道，故有學(xué)者將沙門(mén)氏菌和狂犬病病毒疫苗緊密的結(jié)合在一起,目前這種新型的粘膜免疫的口服疫苗正在研究之中。其大致可能機(jī)理如下：將狂犬

11、病病毒G和N具有抗原性蛋白的外源基因，克隆到表達(dá)質(zhì)粒中，然后將該重組成粒電轉(zhuǎn)入減毒沙門(mén)氏菌。用此重組減毒沙門(mén)氏菌對(duì)動(dòng)物和人進(jìn)行粘膜免疫（口服或鼻腔免疫）。這種方法制備的口服疫苗廉價(jià)、接種方式簡(jiǎn)便，毋需專(zhuān)門(mén)醫(yī)護(hù)人員，適用于大群體免疫，1L可避免因注射接種而感染血源傳播的疾病。此外，以減毒沙門(mén)氏菌為我體的疫苗抗原不需要提純、制備簡(jiǎn)單、易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸，可顯著降低疫苗的制作成本。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，減毒取傷寒沙門(mén)氏?？沙蔀榭袢呙绲膬?yōu)良載體，用于某些細(xì)萌、病毒、寄生蟲(chóng)、腫瘤性疾病的預(yù)防或治療性疫苗。五、DNA疫苗在一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，DNA疫苗預(yù)防狂犬病有較好的效果。目前，傳統(tǒng)DNA疫苗存在的抗體應(yīng)答弱的缺

12、陷徘到很大改善，通過(guò)使用佐劑、對(duì)DNA質(zhì)粒的改造及免疫利量和次數(shù)的優(yōu)化，ManprcctKaur等構(gòu)建了一種有效的狂犬DNA疫蒞，動(dòng)物保護(hù)率為100%,中和抗體滴度為4IU/ml。但是這種傳統(tǒng)的DNA疫苗接種，需要極高劑量的質(zhì)粒，在人體內(nèi)免疫原性很弱，使人們不得不考慮尋找有效的DNA疫苗的運(yùn)我系統(tǒng)。近年來(lái)，DNA疫苗的運(yùn)裁系統(tǒng)IIII毒混感多肽注射液的體外抑菌試驗(yàn)及人工攻毒試驗(yàn)研究向世忠商樹(shù)林？，張國(guó)紅3,劉利春4.郭世勤杜國(guó)清5（1四川省宣:漢縣畜牧獸醫(yī)協(xié)會(huì).四川宣漢636150:2.四川省宙波縣畝牧獸醫(yī)局.四川荷波616550：3.四川西科晴尖獸藥飼料生物工程研究中心.四川綿陽(yáng)621023

13、；4四川西呂學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系.四川西昌615000；5.四川精尖動(dòng)物疫病研究中心.四川緝陽(yáng)621023）組別大廊桿傷螺沙門(mén)氏殲血毒混感多肽注射液211718琥酸慶大尊素注射液171611鹽酸林可卷素注射液111210表1體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果（單位：mm）豬大腸桿聞病、傷寒沙門(mén)氏桿萌病、痢疾桿菌病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中比較常見(jiàn)11較多發(fā)的細(xì)菌性疾病病，危害較大。目前，在臨床中，由于抗生素的非合理使用，使得病原萌對(duì)一些抗生素產(chǎn)生較強(qiáng)的耐藥性。課題組采用脂質(zhì)體技術(shù)研制了由多雨組分制備的復(fù)方制劑一血茬混感多肽注射液，為臨床用藥增加了輪換、選擇的機(jī)會(huì)，可在一定程度上改善臨床因長(zhǎng)期不規(guī)范、不合理使用抗生素而產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)

14、象?，F(xiàn)將該藥的體外抑慎情況和人工攻毒防治試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。一、材料（一）供試藥物血毒混感多肽注射液的主耍成分為磺胺間甲氧喧璇鈉、硫酸慶大零素、林可密素等，各成分按一定比例，采用脂質(zhì)體技術(shù)和工藝制備的油相脂成體注射液，10ml/支，批號(hào)：20090709,由四川西科精尖獸藥飼料生物工程研究中心試制。硫酸安普霉素、硫酸慶大毒素、鹽酸林可毒素均購(gòu)F綿陽(yáng)天誠(chéng)藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢測(cè)屬合格產(chǎn)品。（二）菌種豬大腸桿菌、傷寒沙門(mén)氏桿菌、詢疾桿菌，由四川精尖動(dòng)物疫病研究中心從臨床自然病例中分離。（三）藥敏片硫酸慶大毒素-鹽酸林可族素、硫酸慶大容素、鹽酸林可霉素紙片，由四川精尖動(dòng)物疫病研究中心提供。二、試驗(yàn)方法（一

15、）菌液的制備將三種菌分別接種于適宜的培養(yǎng)基上，于37C培養(yǎng)使其活化。然后接種在營(yíng)養(yǎng)肉湯中，置37C溫箱培養(yǎng)，取出后用肉湯稀釋到10KT，備用。（二）體外抑菌試驗(yàn)采用藥敏紙片法。（三）人工攻毒防治試驗(yàn)雙月齡斷奶健康仔豬390頭，分別進(jìn)行豬大腸桿函、傷寒沙門(mén)氏桿菌、痢疾桿菌的攻毒防治試驗(yàn)。將390頭仔豬隨機(jī)分成13組，每組30頭，設(shè)攻毒對(duì)照組、血毒混感多肽治療組、硫酸慶大容素組、鹽酸林可霉素組、健康對(duì)照組（共同對(duì)照）。健康對(duì)照組不攻毒不給藥，攻毒對(duì)照組只攻茬不給藥，血毒混感多肽預(yù)防組從攻毒前8h開(kāi)始給藥（按0.2ml/kg給藥），硫酸慶大每索組按0.2ml/也有了更深入的研究，這為狂犬口服DNA疫苗的發(fā)展提供了廣闊的空間。利用沙門(mén)氏菌為DNA疫苗運(yùn)載體的研究已有成功范例。沙門(mén)氏御作為活疫苗載體技術(shù)發(fā)展迅猛，以往激發(fā)免疫應(yīng)答偏弱的缺陷得以改善。當(dāng)前沙門(mén)氏保i致弱手段非常成熟，而沙門(mén)氏菌進(jìn)入體內(nèi)后被巨噬細(xì)胞吞噬進(jìn)而在吞噬體內(nèi)溶解以及外源