器官移植術(shù)后的嵌合現(xiàn)象

1、    器官移植術(shù)后的嵌合現(xiàn)象        摘要為研究器官移植術(shù)后的嵌合現(xiàn)象，術(shù)后利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測(cè)3例接受男性供體器官的女性受者外周血及皮膚組織中的Y染色體特異性DNA片段。結(jié)果在1例小腸移植受者的外周血及皮膚組織中出現(xiàn)Y染色體特異性DNA片段；2例腎移植受者的外周血中也出現(xiàn)Y染色體特異性DNA片段。表明在器官移植術(shù)后存在著供體細(xì)胞向受體組織的移行嵌合。認(rèn)為促進(jìn)嵌合的出現(xiàn)及保持嵌合的平衡，將有利于防治排斥反應(yīng)和移植物抗宿主病。關(guān)鍵詞移植移植物生存Y染色體聚

2、合酶鏈反應(yīng) Study on organ transplantation chimerism by polymerase chain reaction techniqueJiang Zhiwei, Li Jieshou, Li Nin, et al. Nanjing General Hospital of Nanjing Command of PLA, Nanjing, 210002AbstractIn order to investigate the organ transplantation chimerism, 3 female patients receiving male donor

3、 grafts were selected to detect a Y chromosome specific DNA fragment to further identify the presence of donor cells based on sex difference between donor and recipient by using polymerase chain reaction (PCR). Y chromosome specific DNA fragment are found in peripheral blood and skin of one recipien

4、t undergoing small bowel transplantation, and in peripheral blood of 2 recipients undergoing renal transplantation. The results indicated that the donor cells migrated to the recipients tissue. It was suggested that chimerism and the maintainance of chimerism balance would be of benefit to the preve

5、ntion and treatment of rejection and graft versus host disease.Key wordsTransplantation Graft survival Y chromosome Polymerase chain reactionStarzl等1，2提出免疫耐受的嵌合(chimerism)理論，認(rèn)為器官移植術(shù)后供受體間存在著廣泛的細(xì)胞移行和嵌合，它是移植物長(zhǎng)期存活及產(chǎn)生免疫耐受的基礎(chǔ)。我們選擇了3例女性移植患者，她們均接受了男性供體器官，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增Y染色體特異性DNA片段，發(fā)現(xiàn)女性受者術(shù)后的外周血及皮膚組織中存在著含Y

6、染色體的供體細(xì)胞，表明在移植術(shù)后供體細(xì)胞向受體組織移行嵌合?，F(xiàn)將我們?cè)谛∧c移植及腎移植患者術(shù)后觀察到的嵌合現(xiàn)象報(bào)告如下。資料與方法一、 病例選擇：選擇接受男性移植物的女性移植受者3例，其中小腸移植1例3，31歲；腎移植2例，分別為28歲和32歲。二、 標(biāo)本留?。盒∧c移植患者分別于術(shù)后192天、200天、210天取外周血標(biāo)本1份，術(shù)后192天取皮膚活檢標(biāo)本1份。腎移植患者分別于術(shù)后9天、92天取外周血標(biāo)本1份。三、 PCR擴(kuò)增Y染色體特異性DNA序列： 1. 基因組DNA提取：取1.5ml乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，加入2×蔗糖-Triton-100溶液， 混勻至紅細(xì)胞溶血，1

7、500g離心15分鐘，在細(xì)胞沉淀中加入1.5ml EDTA-Na，勻漿液勻漿后，加入1/10體積10% SDS和蛋白酶K(終濃度100mg/L)，37水浴34小時(shí)，用等體積飽和酚、11酚-氯仿及氯仿分別抽提1次，加入1/10體積3mol/L NaCl及2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀DNA，75%(V/V)乙醇洗沉淀1次，適量三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸二鈉緩沖液(TE緩沖液)溶解DNA，4貯存?zhèn)溆谩?. 目的DNA序列擴(kuò)增：使用復(fù)旦大學(xué)產(chǎn)人性別PCR鑒定試劑盒，以Alu特異性DNA序列引物作對(duì)照，首先進(jìn)行試劑盒特異性及敏感性試驗(yàn)。隨機(jī)擴(kuò)增5男5女基因組DNA行特異性試驗(yàn)； 敏感性試驗(yàn)將男女總DN

8、A含量按11、12、14、18、116、132、164的比例稀釋后再擴(kuò)增。目的DNA擴(kuò)增總反應(yīng)體積為20l，內(nèi)含高純水、5×buffer、引物、dNTP、樣本DNA，92.5水浴7分鐘后加入1U Taq酶，92.5 30秒(變性)，55 30秒(退火)，70 90秒(延伸)，30個(gè)循環(huán)。3. 檢測(cè)：取10l擴(kuò)增產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，紫外燈下觀察結(jié)果及拍照。男性Y染色體特異DNA片段為446bp，女性總DNA不出現(xiàn)擴(kuò)增片段。Alu序列擴(kuò)增片段大小為130bp，無(wú)論是男性還是女性擴(kuò)增后都會(huì)出現(xiàn)。結(jié)果一、移植術(shù)后臨床及組織病理學(xué)觀察：3例患者在觀察期間均無(wú)排斥及移植物抗宿主

9、病(GVHD)發(fā)生。小腸移植患者術(shù)后4個(gè)月即停止了全胃腸外營(yíng)養(yǎng)， 恢復(fù)口服飲食， 營(yíng)養(yǎng)良好。腎移植患者術(shù)后2周血尿素氮、肌酐恢復(fù)正常水平。二、PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果：Alu序列為人體基因組中的中度重復(fù)序列，分布于所有人體細(xì)胞基因組中，作為對(duì)照以防假陰性。本研究中Alu序列無(wú)論是男性還是女性均為陽(yáng)性，而Y染色體特異性DNA序列僅見(jiàn)于男性。三、PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果：男女總DNA量按164稀釋時(shí)仍可見(jiàn)擴(kuò)增出Y染色體特異性DNA。四、移植患者的外周血及皮膚PCR擴(kuò)增結(jié)果：小腸移植術(shù)后192天、200天、210天外周血及192天的皮膚組織中均可檢出Y染色體特異性DNA片段；腎移植患者術(shù)后9天、92天時(shí)外周

10、血中檢出Y染色體特異性DNA片段，而術(shù)前各患者外周血PCR擴(kuò)增Y染色體均為陰性。討論Starzl等于1991年在小腸移植研究中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后供腸與受體之間存在著互相的細(xì)胞移居及共存的嵌合現(xiàn)象，臨床無(wú)排斥和GVHD的發(fā)生，于是他們首次提出了嵌合現(xiàn)象可能存在于所有成功的器官移植術(shù)后4。嵌合理論的核心是細(xì)胞移行嵌合是移植物存活及產(chǎn)生免疫耐受的基礎(chǔ)，其中參與嵌合的主要細(xì)胞是樹(shù)突狀細(xì)胞，移行主要通過(guò)血管途徑，嵌合發(fā)生的部位廣泛，在外周血、淋巴結(jié)、骨髓、皮膚、肝臟等處都可發(fā)生。我們?cè)谛∧c移植術(shù)后200天左右于受者的外周血及皮膚組織中都發(fā)現(xiàn)了供體的嵌合細(xì)胞。GVHD的發(fā)生與嵌合的失平衡有關(guān)。雖然在小腸等器官移植

11、術(shù)后存在著廣泛的供體細(xì)胞向受體的移行嵌合，但在有效免疫抑制下，并不發(fā)生GVHD，少數(shù)受體發(fā)生GVHD，主要是因?yàn)楣w細(xì)胞大量侵犯破壞受體組織，嵌合狀態(tài)失平衡所致，糾正了失衡狀態(tài)可逆轉(zhuǎn)GVHD。所以在小腸移植術(shù)后需警惕GVHD的發(fā)生，但沒(méi)有必要在術(shù)前對(duì)供體或供腸進(jìn)行放射線照射或去除腸系膜淋巴結(jié)等免疫預(yù)處理，預(yù)處理可能反而有害。本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目作者單位：210002南京軍區(qū)南京總醫(yī)院全軍普通外科研究所參考文獻(xiàn)1Starzl T, Demetris A, Truccco M, et al. Cell migration and chimerism after whole-organ transplantation: the basis of graft acceptance. Hepatology, 1993, 17:1127.2Starzl T, Demetris A, Murase N, et al. Donor cell chimerism permitted by immunosuppressive drugs: a new view of organ transplantation. Immuno Today, 1993, 14:326. 3李寧，黎介壽，李幼生，等. 首例臨