化氫對(duì)血管性癡呆大鼠的海馬CAl區(qū)細(xì)胞凋亡的作用

1、化氫對(duì)血管性癡呆大鼠的海馬CAl區(qū)細(xì)胞凋亡的作用【關(guān)鍵詞】 硫化氫 癡呆 大鼠1996年Abe等1首次證實(shí)人體內(nèi)源性硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）可能是一種神經(jīng)活性物質(zhì)，內(nèi)源性H2S可增強(qiáng)腦N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體調(diào)節(jié)的反應(yīng)，誘導(dǎo)海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（1ong term potentiate，LTP），對(duì)學(xué)習(xí)和記憶有重要的調(diào)節(jié)功能2。因此H2S被認(rèn)為是繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第3種內(nèi)源性氣體信號(hào)分子3。本實(shí)驗(yàn)旨在了解H2S對(duì)血管性癡呆大鼠的海馬CAl區(qū)細(xì)胞凋亡的作用。 1 材料與方法 11 動(dòng)物模型制作 參照 Pulsinelli 四血管阻斷法（4

2、-VO法）建立癡呆（VD）大鼠模型4。10%水合氯醛（3mikg體重）腹腔麻醉大鼠后，經(jīng)頸背部正中切口，暴露第一頸椎兩側(cè)翼孔，電凝走行其下方的椎動(dòng)脈，使其永久性閉塞。48h后，將大鼠用乙醚麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA），待動(dòng)物清醒后用無(wú)創(chuàng)傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5min，共夾閉3次，每次間隔1h，造成全腦缺血，再通后縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)，以再通時(shí)間作為再灌起始點(diǎn)。術(shù)后按再灌注的不同時(shí)間分別將大鼠處死。 12 實(shí)驗(yàn)分組 56只純系健康雄性Wistar大鼠，將動(dòng)物隨機(jī)分為7組，正常組（Normal group），即假手術(shù)組（Sham-operat

3、ed group）和VD模型組（VD group），VD模型組又分為大腦缺血再灌注2小時(shí)（IR 2h）組，大腦IR 8h組，大腦IR 24h組，大腦IR 72h組和大腦IR 168h組，每組8只動(dòng)物，假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過(guò)程與VD模型組相同，但不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈，不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈。 13 腦組織病理學(xué)指標(biāo) 腦組織切片，HE染色，光鏡下觀察腦組織病理變化情況；免疫組化染色觀察腦組織內(nèi)Bcl-2和Bax凋亡蛋白的分布情況。 14 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 將大鼠海馬組織制成單細(xì)胞懸液，EB染色后應(yīng)用美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的Epics-XL 型流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。 15 血清中H2S

4、含量的檢測(cè) 應(yīng)用亞甲藍(lán)分光光度法檢測(cè)血清中H2S含量。 16 外源性H2S對(duì)VD大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 大鼠再造模的同時(shí)，腹腔注射硫氫化鈉（NaHS）（14molkg體重），7天后處死動(dòng)物，經(jīng)主動(dòng)脈依次灌注生理鹽水100ml和4%多聚甲醛500ml，取出腦組織，石蠟包埋切片，免疫組化方法檢測(cè)Bcl-2、Bax，HE染色法觀察組織形態(tài)變化，亞甲藍(lán)分光光度法檢測(cè)血清中H2S含量。 17 統(tǒng)計(jì)方法 所有實(shí)驗(yàn)參數(shù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，P005為顯著性差異。 2 結(jié)果 21 VD大鼠病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 HE染色后，神經(jīng)細(xì)胞胞漿呈淡紅色，核呈藍(lán)黑色。假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列整齊、密集，細(xì)胞完整，結(jié)構(gòu)

5、正常，胞漿豐富，膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)增生：細(xì)胞核呈圓形、橢圓形，無(wú)變性，無(wú)固縮或溶解現(xiàn)象（圖1 A）。VD模型組海馬CAl區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，神經(jīng)元變性，體積變小，胞核與胞漿界限不清，核固縮成三角形或不規(guī)則形，而且隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，變性神經(jīng)元數(shù)目越多（圖1 BF）。 22 凋亡蛋白表達(dá)結(jié)果 221 VD大鼠海馬CAl區(qū)Bcl-2的表達(dá) VD模型組IR 2小時(shí)，Bcl-2蛋白平均光密度值開(kāi)始明顯上調(diào)，IR 8h達(dá)到高峰，之后隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)開(kāi)始下降，但I(xiàn)R 24h組仍高于假手術(shù)組（P005）。各組兩兩比較可見(jiàn)假手術(shù)組，缺血再灌注不同時(shí)間組間，海馬CA1區(qū)Bcl-2的表達(dá)情況均有顯著性差異（見(jiàn)表1

6、）。 222 VD大鼠海馬CAl區(qū)Bax的表達(dá) 缺血再灌注早期Bax在海馬CA1區(qū)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量不斷增加，IR（72168）h達(dá)高峰。各組兩兩比較可見(jiàn)假手術(shù)組，缺血再灌注不同時(shí)間組間，海馬CA1區(qū)Bax的表達(dá)情況均有顯著性差異（P005，見(jiàn)表2）。 223 VD大鼠海馬CAl區(qū)Bax的表達(dá) 缺血再灌注早期Bax在海馬CAI區(qū)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量不斷增加，IR72-168h達(dá)高峰。各組兩兩比較可見(jiàn)假手術(shù)組，缺血再灌注不同時(shí)間組間，海馬CAl區(qū)Bax的表達(dá)情況均有顯著性差異（P005，見(jiàn)表2）。 224 Bel-2Bax比率變化 缺血再灌注

7、2小時(shí)，Bcl-2Bax比率最高（IR 2h10631），隨后開(kāi)始下降，呈現(xiàn)隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低的趨勢(shì)。 225 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率結(jié)果 隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸增高，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)對(duì)數(shù)曲線上升趨勢(shì)（圖2），其中IR 168h組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率最高（1205%056%）。VD模型各組與假手術(shù)組比較，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯增加（P00）；缺血再灌注不同時(shí)間組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)：各組間海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率均有顯著性差異（P001，見(jiàn)表3）。 226 血清H2S含量檢測(cè)結(jié)果 隨著缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清H2S含量逐漸降低，血清H2S含量

8、呈現(xiàn)直線降低趨勢(shì)（見(jiàn)圖2），其中IR 168h組血清H2S含量最低（1351045）。VD模型各組與正常組和假手術(shù)組比較，血清H2S含量明顯減少（P001）；缺血再灌注不同時(shí)間組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，各組間血清H2S含量均有顯著性差異（P001）；正常組和假手術(shù)組血清H2S含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P005，見(jiàn)表4）。 237 血清H2S含量與海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率相關(guān)分析 隨著血清H2S含量的降低，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率逐漸升高，兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，回歸方程為：y-0135x+12068，相關(guān)系數(shù)r=-0.861（P001，見(jiàn)圖3）。 23.8 外源性H2S對(duì)VD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞病變和凋亡的影響 HE染色后發(fā)現(xiàn)，外

9、源性H2S應(yīng)用后，神經(jīng)元排列紊亂和變性程度明顯減輕（見(jiàn)圖4）。 3 討論 眾所周知，參與H2S合成的主要酶是胱硫醚-合酶（cystathionine-beta-synthase，CBS）和胱硫醚-裂解酶（cystathionine-gamma-lyase），而CBS主要分布于中樞系統(tǒng)的海馬、小腦、皮層和腦干，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)合成H2S的主要酶，因此CBS的活性直接關(guān)系到腦內(nèi)H2S的水平，CBS其C末端含有一個(gè)19個(gè)氨基酸殘基組成的調(diào)鈣蛋白區(qū)，在基礎(chǔ)狀態(tài)下CBS的C端彎向并覆蓋催化區(qū)域，此時(shí)該酶無(wú)活性，當(dāng)Ca2+/調(diào)鈣蛋白或S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合到該區(qū)后，CBS的立體構(gòu)像發(fā)生變化即可激活CBS5,6

10、。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注的早期（8小時(shí)）海馬CAl區(qū)的Bcl-2的密度明顯增加（表1），這可能與早期CBS酶活性增加有關(guān)，因?yàn)樵诩毙匀毖毖鯐r(shí)神經(jīng)細(xì)胞反饋性的增加了內(nèi)源性H2S的生成，究其原因可能與Ca2+內(nèi)流增加、代償性的谷氨酸釋放增加有關(guān)，但隨著缺血再灌注的時(shí)間延長(zhǎng)，這種代償機(jī)制不能克服細(xì)胞凋亡數(shù)的增加而逐漸消失。 而當(dāng)加入硫氫化鈉（NaHS）后，由于NaHS可解離成鈉離子（Na+）和硫氫根（HS-），硫氫根可與體內(nèi)氫離子（H+）結(jié)合生成H2S，從而使神經(jīng)細(xì)胞在形態(tài)和排列上的紊亂得以減輕 （圖4）7。 本實(shí)驗(yàn)可以明顯看到神經(jīng)細(xì)胞的凋亡與H2S之間呈負(fù)相關(guān)性，H2S的含量越低，細(xì)胞凋亡的現(xiàn)

11、象越嚴(yán)重，因此為我們探究減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、防止或減少血管性癡呆的途徑，引發(fā)了新的思考?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Abe K， Kimura H The possible role of hydrogen sulfide as an endogenous neuromodulatorJ Neurosci， 1996， 16：1066-10712 Em K， Ogasawara M， Umanura K， et al Hydrogen sulfide is produced in response to neuronal excitationJ J Neurosci，2002, 22（9）：3386-3

12、3913 Wang R Two?蒺s company, three?蒺s a crowd Can H2S be the third endogenous gaseous tranamitter？J.FASEB J，2002,16（13）：1792-17984 Pulsinelli WA， Brierley JB A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized ratJ SPoke，1979，10：267-2725 Kimura H.Hydrogen sulfide as a neuromodulatorJ Mol Neurobiol，2002，26（1）：13-196 Kimura Y， Kimura H Hydrogen sulfide protects neurons from oxidative stressJ FASEB J，2004，