醫(yī)學(xué)論文下載天參益智方對(duì)老年性癡呆模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用

1、醫(yī)學(xué)論文下載天參益智方對(duì)老年性癡呆模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用    【摘要】  目的研究天參益智方（TSYZ）對(duì)AD模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用和抗氧化作用。方法以慢性鋁中毒法復(fù)制老年性癡呆模型大鼠，用TUNEL法觀察模型大鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡水平，并檢測(cè)腦線粒體超氧化物歧化酶（SOD）活性以及丙二醛（MDA）含量。結(jié)果模型組大鼠海馬和皮質(zhì)具有典型的細(xì)胞凋亡特征，T-SOD活性降低，MDA含量升高；而天參益智方治療組海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)減少，T-SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論 天參益智

2、方具有明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用和抗氧化作用，其改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能可能是通過多個(gè)環(huán)節(jié)整體治療來實(shí)現(xiàn)的?！娟P(guān)鍵詞】  天參益智方 老年癡呆 細(xì)胞凋亡 超氧化物歧化酶 丙二醛Abstract：ObjectiveTo study the effect of TSYZ formula on neuronal apoptosis and anti-oxidation of aged dementia model mice.  MethodsThe aged dementia models were induced by long-term i.g AlCl3 . TUNEL wa

3、s used to detect neuronal apoptosis,and cerebral SOD and MDA were studied.ResultsTypical apoptosis characters were markedly caused in model group, meanwhile the abilities of SOD decreased and the quantities of MDA increased remarkably.The TSYZ formula groups obviously inhibited neuronal apoptosis, i

4、ncreased  the activity of SOD and lowered the quantities of MDA (P<0.05 or P<0.01). ConclusionIt is suggested that the inhibitory effects of TSYZ formula on neuronal apoptosis and anti-oxidation are remarkable. The machanisms maybe that the protective effects of TSYZ formula on the abilit

5、y of learning and memory of AD model mice.Key words：TSYZ formula;  Aged dementia;  Neuronal apoptosis;  SOD；  MDA    老年性癡呆（Alzheimer's disease, 簡稱AD）是一種嚴(yán)重影響老年人身心鍵康的，以進(jìn)行性智力減退為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，這種病的典型癥狀是記憶損傷,隨著病情惡化,會(huì)出現(xiàn)行為的紊亂和個(gè)性的變化。據(jù)統(tǒng)計(jì), 在我國60 歲以上人口中AD 的患病率占5%, 約600 萬1

6、，隨著我國人口老齡化，老年癡呆癥患者將日益增多，且發(fā)病年齡有提前趨勢(shì)，因而老年癡呆癥將成為本世紀(jì)威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，同時(shí)也將給我們帶來沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找治療老年性癡呆癥的有效藥物，已成為醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。天參益智方具有補(bǔ)脾益氣、補(bǔ)腎填精、養(yǎng)血安神、平肝熄風(fēng)、活血化淤、豁痰開竅等功效，其成分主要有天麻、人參、石菖蒲等。在先前的實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)天參益智方對(duì)AlCl3所致AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的改善作用，且能阻止A在海馬和皮質(zhì)中的合成和沉積，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究天參益智方對(duì)AD模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用及其抗氧化作用。1  器材1.1  藥

7、物天參益智方，棕褐色粉末，由本院分析教研室提供。1.2   動(dòng)物SD健康大鼠60只，體重（200±20）g，雌雄兼?zhèn)?，由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(黔)2002-0001。1.3  儀器與試劑Biomias99圖象分析系統(tǒng)（四川大學(xué)圖象圖形研究所產(chǎn)品）；EG1160石蠟包埋機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；RM2145輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；HI1210攤片機(jī)(德國Leica公司生產(chǎn))；721分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；XH-B漩渦混勻器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；三

8、氯化鋁（AlCl3·6H2O）（分析純，上海盛龍化工有限公司生產(chǎn)）；腦復(fù)康 (杭州民生藥廠生產(chǎn))；TUNEL法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、即用型SABC、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品）；SOD試劑盒、MDA試劑盒（南京建成生物工程有限公司產(chǎn)品）2  方法2.1  癡呆模型建立24，實(shí)驗(yàn)分組及藥物治療SD健康大鼠60只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n=10）和模型組（n=50）。模型組給AlCl3溶液，第1個(gè)月和第2個(gè)月按500 mg·kg-1·d-1灌胃，以后一直自由飲用1.6 g·L-1AlCl3溶液；正常對(duì)照組灌胃等容的蒸餾水

9、，用水迷宮法檢測(cè)其記憶改變情況。癡呆模型建立成功之后，模型組隨機(jī)分為5組，每組10只，即腦復(fù)康組，天參益智方高、中、低劑量組和癡呆模型組，以上藥量均配成0.6ml液體灌胃給藥,連續(xù)3個(gè)月，正常對(duì)照組、癡呆模型組灌以等體積的蒸餾水。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程避免與鋁制品接觸。2.2  標(biāo)本制備水迷宮測(cè)試結(jié)束24 h后，大鼠斷頭取腦，用10%中性緩沖液福爾馬林固定4 h以上，石蠟包埋作連續(xù)冠狀切片，片厚5 m。2.3  神經(jīng)細(xì)胞凋亡在海馬和皮質(zhì)的表達(dá)每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取1張切片，切片常規(guī)脫蠟、脫水后，進(jìn)行TUNEL染色：3 %H2O2 阻斷10  min ,用蛋白酶K處理后加入地高辛標(biāo)

10、記的dUTP,在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下反應(yīng)120 min,使之轉(zhuǎn)移到凋亡細(xì)胞斷裂的染色質(zhì)3'-OH末端，再加親和素過氧化酶SABC反應(yīng)30 min,最后DAB顯色。凋亡的細(xì)胞呈黃色，為陽性細(xì)胞5，6。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視場(chǎng)，視場(chǎng)面積為443 268 m2，每個(gè)視場(chǎng)選取5個(gè)陽性表達(dá)區(qū)域，在400×倍光學(xué)顯微鏡下，通過Biomias99圖像分析系統(tǒng)，檢測(cè)平均灰度值，并用鼠標(biāo)點(diǎn)擊法計(jì)數(shù)陽性表達(dá)細(xì)胞，檢測(cè)大鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)細(xì)胞凋亡水平。2.4  腦系數(shù)及腦線粒體SOD活性和MDA含量的測(cè)定水迷宮測(cè)試結(jié)束24 h后，處死大鼠，于冰浴中迅速取出腦組織，并精確稱取，分別采用黃嘌呤氧化

11、酶法測(cè)定SOD、硫代巴比妥酸（TBA）化學(xué)比色法測(cè)定MDA和考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白含量，具體按試劑盒說明操作。同時(shí)，按下列公式計(jì)算腦系數(shù)。    腦系數(shù)(%)=腦濕重/g體重kg×100%2.5   數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)處理采用±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析檢驗(yàn)。3  結(jié)果3.1  天參益智方對(duì)老年性癡呆模型大鼠海馬和皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響TUNEL法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)果表明：與正常組比較，模型對(duì)照組切片中神經(jīng)細(xì)胞核內(nèi)可見大量深染的棕黃色顆粒，即凋亡小體，平均灰度值明顯減少，陽性細(xì)胞數(shù)增加（P<0.01

12、），提示模型組神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加。與模型組比較，天參益智方組神經(jīng)細(xì)胞染色較淺，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較好，平均灰度值均明顯增高，陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01），提示天參益智方組神經(jīng)細(xì)胞凋亡減少，對(duì)AlCl3引起的大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有明顯的抑制作用。結(jié)果見表12。表1  TSYZ對(duì)老年性癡呆模型大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（略）與正常組比較，*P<0.05，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，#P<0.01；n=10表2  TSYZ對(duì)老年性癡呆模型大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響（略）與正常組比較，*P<0.05，*P<0.01；與模型組比較，

13、#P<0.05，#P<0.01；n=103.2  天參益智方對(duì)老年性癡呆模型大鼠腦線粒體SOD活性及MDA含量的影響表3表明，模型對(duì)照組腦線粒體SOD活性降低，MDA含量增加（P<0.05或P<0.01）。與模型組比較，天參益智方高、中劑量組SOD活性升高，MDA含量降低（P<0.05或P<0.01），提示天參益智方具有明顯的抗氧化作用，改善自由基在體內(nèi)的過量代謝。表3  TSYZ對(duì)老年性癡呆模型大鼠腦線粒體SOD活性及MDA含量的影響（略）與正常組比較，*P<0.05，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，#P

14、<0.01；n=103.3  腦系數(shù)的測(cè)定表4顯示，模型組腦指數(shù)較正常組顯著降低，而天參益智方高、中劑量組腦系數(shù)顯著增加（P<0.05 ），提示天參益智方有抗腦萎縮的作用。表4   TSYZ對(duì)老年性癡呆模型大鼠腦系數(shù)的影響（略）與正常組比較，*P<0.05，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，#P<0.01；n=104  討論    老年性癡呆已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康和生存質(zhì)量的重要因素。AD臨床表現(xiàn)為癡呆綜合癥，其病理改變主要為腦萎縮、神經(jīng)細(xì)胞和突觸大量丟失，特征性的細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)

15、纖維纏結(jié)（neurofibrilary tangle,NFT）、細(xì)胞外老年斑（senile plaque,SP）和腦血管淀粉樣變。病變區(qū)主要分布于海馬、皮質(zhì)和杏仁核等與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的關(guān)鍵部位。AD病因復(fù)雜，發(fā)病環(huán)節(jié)較多，目前認(rèn)為與神經(jīng)遞質(zhì)紊亂、基因突變、氧化應(yīng)激和自由基損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、免疫/炎癥反應(yīng)、-淀粉樣蛋白（A）和tau蛋白異常磷酸化等有關(guān)1。目前防治老年性癡呆的藥物研究主要是依據(jù)該藥能否對(duì)其病理發(fā)展有對(duì)抗和阻止作用，或?qū)ζ洳±戆l(fā)展有改善和逆轉(zhuǎn)作用。中醫(yī)認(rèn)為AD 的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)。本虛為腎精虧損、氣血不足; 標(biāo)實(shí)為痰濁阻竅、氣滯血淤。西醫(yī)治療AD 主要采用腦血管擴(kuò)張藥、腦代謝改善藥及

16、促智藥, 只能治療其精神癥狀，難以治愈其髓海不足與腦髓空虛導(dǎo)致的腦萎縮。祖國醫(yī)學(xué)采用標(biāo)本兼治法, 補(bǔ)腎益精, 健脾益氣, 活血祛淤, 豁痰開竅,辨證施治7。中藥是以復(fù)合成分的方式進(jìn)入體內(nèi)，通過多靶點(diǎn)、多途徑、多層次的綜合協(xié)調(diào)作用達(dá)到整體治療AD的目的，有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。    細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱細(xì)胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)，是生命的基本特點(diǎn)之一,是一種積極的不引起細(xì)胞炎癥的細(xì)胞死亡過程，與細(xì)胞增殖共同維持機(jī)體正常生長發(fā)育和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定， 細(xì)胞增殖和凋亡的失控會(huì)導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生。近年來的研究表明, 細(xì)胞凋亡參與

17、了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變8，9，臨床尸檢也發(fā)現(xiàn)AD 患者腦內(nèi)存在大量凋亡神經(jīng)元。神經(jīng)元過度凋亡，致腦萎縮,神經(jīng)細(xì)胞和突觸丟失,最后導(dǎo)致腦功能和結(jié)構(gòu)的破壞，對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和抑制已成為防治AD的一種重要模式。本實(shí)驗(yàn)研究表明，天參益智方組細(xì)胞染色較淺，細(xì)胞凋亡數(shù)顯著低于模型組，說明天參益智方具有較好的抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和抗腦萎縮的作用，從而改善AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。    眾多的實(shí)驗(yàn)研究已表明，自由基學(xué)說在衰老機(jī)制和AD病因中越來越顯示出重要性10，過多自由基的產(chǎn)生可引起不同程度的細(xì)胞毒性及瞬時(shí)的不可逆損傷。AD患者腦組織中脂質(zhì)發(fā)生嚴(yán)重過氧化，自由基增加，引起

18、細(xì)胞核和線粒體DNA損傷，導(dǎo)致腦細(xì)胞功能減退，不能有效地清除脂褐質(zhì)（老年色素和老年斑）11。清除自由基，降低體內(nèi)過氧化脂質(zhì)對(duì)延緩衰老和防治癡呆具有重要的作用。在正常生理情況下，線粒體是體內(nèi)自由基的主要來源之一，同時(shí)又具有有效的清除自由基的系統(tǒng)，SOD是線粒體主要防御物質(zhì)之一，維持體內(nèi)自由基的正常水平。但是隨著衰老，SOD活性降低，抗氧化能力下降，不能有效清除自由基，結(jié)果導(dǎo)致細(xì)胞損傷。同時(shí)，線粒體是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)5，12，凋亡的許多關(guān)鍵都集中在線粒體，如：細(xì)胞色素C，Ca2+，和凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）的釋放，在細(xì)胞凋亡的諸多誘因中，體內(nèi)代謝或外源性因素產(chǎn)生的自由基均被證實(shí)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，

19、細(xì)胞凋亡可能是機(jī)體氧化和抗氧化失衡的結(jié)果之一。表34表明，天參益智方能提高腦線粒體SOD 活性, 降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量, 減輕氧化應(yīng)激，清除自由基, 抑制神經(jīng)元凋亡，抗腦萎縮,本實(shí)驗(yàn)研究也為開發(fā)中藥及其提取物從多環(huán)節(jié)防治AD提供了客觀的理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 彭 穎,李曉波,楊靜玉,等.中藥抗阿爾茨海默病的研究進(jìn)展J.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2005,17(5)：63.2 Golloib LG.Behavioral changes in induced by aluminum in drinking waterJ.Dementia,1991,2(5):278.3 張魁華,賴世隆,王 奇，等. 補(bǔ)腎益智方對(duì)老年性癡呆模型動(dòng)物空間探索學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用J.中草藥,2002,33(12)：1093.4 Morris RG,Garrud P,Rawlins JN,et al. Place navigation impaired in rats with hippocampal lesionsJ.Nature,1982,