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文檔簡(jiǎn)介
1、從口腔脫落細(xì)胞中提取人類基因組DNA一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解從細(xì)胞中提取DNA的基本原理2、學(xué)習(xí)從口腔脫落細(xì)胞中提取高分子量DNA的基本操作步驟和會(huì)影響提取效果的注意事項(xiàng)。二.實(shí)驗(yàn)原理1.用蛋白酶K(使膜上蛋白變性分解和去污劑SDS(破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)共同消化細(xì)胞。2.然后酚、氯仿等有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提,進(jìn)行DNA的純化,去掉蛋白質(zhì)、RNA、多糖等生物大分子。3.最后用無水乙醇沉淀DNA,干燥后用TE溶解,在4下可保存一年。三.實(shí)驗(yàn)步驟1、先用清水漱口。然后用舌頭舔頰粘膜上顎、用牙刮頰部,嘬咀,用分泌出的唾液反復(fù)漱口;將唾液吐到杯中。用1ml生理鹽水洗滌,后將1.5ml液體轉(zhuǎn)入1個(gè)干凈的EP管中,2
2、000rpm離心5分鐘,倒掉上清。2、重復(fù)用1.0ml生理鹽水洗滌沉淀1次,離心,去上清。3、沉淀中加500l 1x細(xì)胞裂解液(STE,打散細(xì)胞團(tuán)、混勻,再加15l 20mg/ml蛋白酶K,充分混勻。 55水浴30min。4、加500l飽和酚,輕搖混勻,室溫12000rpm離心10min。5、上清(注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機(jī)相移至另一加入裝有500l氯仿的EP管,輕搖混勻,室溫12000rpm離心10min。6、吸取400l上清(注意不要吸到中間層白色絮狀物質(zhì)以及下層有機(jī)相至已裝有900 l預(yù)冷無水乙醇的離心管,混合均勻,可見白色絮狀沉淀, 10000rpm離心5min,DNA
3、沉淀在管底。7、去上清,加入70%乙醇1ml清洗沉淀,10000rpm離心5min,去上清(盡量用小槍頭將液體去干凈,但注意不要將沉淀也吸走,室溫干燥5min,再用50l TE buffer溶解沉淀,4儲(chǔ)藏備用。四.實(shí)驗(yàn)結(jié)果 五.結(jié)果分析編號(hào):100如圖所示,100號(hào)幾乎沒有提取出DNA,只有很弱的一條帶,如果量再多一些的話,應(yīng)該也看得到會(huì)有幾條帶。經(jīng)過分析后認(rèn)為主要以下幾點(diǎn)原因:【1】.唾液稀釋過度,導(dǎo)致取到的細(xì)胞很少?!?】.在破碎細(xì)胞的時(shí)候進(jìn)行的不徹底,沒有混勻,導(dǎo)致DNA抽提不完全?!?】.加入活性去污劑到加熱30min的間隔有些長(zhǎng)導(dǎo)致部分DNA被DNA水解酶降解。【4】.加入飽和酚的時(shí)候沒有搖勻,蛋白質(zhì)的去除不徹底,部分DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合,在分離DNA去除蛋白質(zhì)的時(shí)候損失了不少DNA。此外,不同的條帶代表提取出的DNA的大小不同,在實(shí)驗(yàn)過程中,可能由于劇烈震蕩,或DNA水解酶的緣故使得DNA鏈被打斷。因此出現(xiàn)了不同的幾個(gè)條帶。六.注意事項(xiàng)1.取唾液時(shí)既不能過分稀釋,也不能太粘稠,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不足時(shí)要及時(shí)補(bǔ)充。2.裂解細(xì)胞的時(shí)候,要充分混勻活性去污劑,但震蕩也不能太劇烈。最好及時(shí)放入水域鍋中加熱。3.加苯酚后要充分混勻,之后離心,盡可能多的將上清吸出,但注意不要取
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