呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)β淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響

1、    呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白基因表達(dá)的影響作者：岳啟安 趙淑梅 王紅艷 閻樂(lè)法1 汲 蕊 宮 英 尤敏 管福來(lái) 錢(qián)震雯 作者單位：(濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，山東 濰坊 261042) 【摘要】 目的 探討呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)淀粉樣前體蛋白(APP)基因表達(dá)的影響。方法 22月齡SD大鼠采用海人酸破壞腦基底核法造成學(xué)習(xí)和記憶功能障礙的癡呆動(dòng)物模型。造模后的大鼠隨機(jī)分為癡呆模型組、呆聰液(低、中、高劑量)組，同時(shí)設(shè)正常對(duì)照組，每組10只。呆聰液低、中、高劑量組每日呆聰液灌胃(低5 g/kg、中10 g/kg、高20 g/kg)，癡呆

2、模型組和正常對(duì)照組每天用生理鹽水(10 ml/kg)灌胃，共1個(gè)月。通過(guò)水迷宮法和反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)觀察呆聰液對(duì)癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和腦內(nèi)APP基因表達(dá)的影響。結(jié)果 老齡癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，腦內(nèi)APP基因表達(dá)增強(qiáng)。呆聰液高、中、低劑量組能明顯提高學(xué)習(xí)記憶能力，降低腦內(nèi)APP mRNA含量，并有一定的量效關(guān)系，與癡呆模型組比較差異有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 呆聰液能改善老齡癡呆大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，下調(diào)APP基因的表達(dá)。 【關(guān)鍵詞】 呆聰液;海人酸;動(dòng)物癡呆模型;淀粉樣前體蛋白;基因表達(dá) 研究表明，老年癡呆患者都有腦底動(dòng)脈硬化、海馬區(qū)額葉老年斑及神經(jīng)元纖維纏結(jié)的病理變化。

3、中樞meynert基底核神經(jīng)元缺失伴膽堿能神經(jīng)元功能障礙，海馬區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶活性降低，可出現(xiàn)不同程度的腦萎縮。因此，中樞膽堿能神經(jīng)功能障礙與癡呆程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步闡明呆聰液治療老年癡呆的作用機(jī)制，本文在研究呆聰液對(duì)老齡鼠癡呆模型腦M受體及免疫功能影響的基礎(chǔ)上1，探討呆聰液對(duì)老齡鼠癡呆模型腦M受體基因及淀粉樣前體蛋白(APP) mRNA，actin APP上游引物：(53)AATCCTGCAGTACTGCCAAG,下游引物：(53)TGGCAACAGTACTGCCAAG;actin上游引物：(53)CAACTTTACCTTGGCCACTACC，下游引物：(53)TACGACTGCAAACA

4、CTCTACACC，產(chǎn)物150 bp。RTPCRAPP的PCR循環(huán)條件：94變性30 s，62退火30 s，72延伸1 min;actin的PCR循環(huán)條件為94變性30 s，55 退火30 s，72延伸1 min，完成35個(gè)循環(huán)后，取PCR產(chǎn)物8 l在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳，5 V，45 min，用自動(dòng)成像儀(美國(guó)FOTODYNE公司)觀察拍照。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的電泳圖譜用STORM 860熒光掃描分析儀(美國(guó)DYNAMIC公司)分析，相對(duì)表達(dá)量根據(jù)各電泳區(qū)帶與內(nèi)對(duì)照actin的面積之比來(lái)計(jì)算。以actin為內(nèi)參照，按公式APP/actin計(jì)算APP mRNA水平。 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x&

5、#177;s表示，使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。 2 結(jié) 果 癡呆模型組APP mRNA的表達(dá)量(1.551±0.054)較對(duì)照組(1.483±0.005)明顯升高(P<0.05)，呆聰液低、中、高各劑量組APP mRNA表達(dá)量分別為1.476±0.007、1.380±0.005、1.382±0.004，與癡呆模型組比較明顯降低(P<0.05)。RTPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳結(jié)果顯示呆聰液中劑量組效果最佳(圖1)。 1.Marker 2.空白對(duì)照組 3.癡呆模型組 4.低劑量中藥組 5.中劑量中藥組 6.高劑量中藥組 圖1 RTP

6、CR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖 3 討 論 老年癡呆是一種記憶能力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常為特征的腦退行性疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境和基因突變導(dǎo)致APP代謝異常，在神經(jīng)元細(xì)胞外產(chǎn)生A沉積，并造成神經(jīng)元損傷2。Lin等3研究發(fā)現(xiàn)，大腦皮層膽堿能系統(tǒng)功能的完整性對(duì)保持正常的APP 水平和調(diào)節(jié)APP代謝有重要意義。APP 水平的升高與膽堿能活性下降有關(guān)，對(duì)那些大腦膽堿能系統(tǒng)核基質(zhì)受損的大鼠用N甲基D天門(mén)冬氨酸鹽處理，能提高APP的mRNA水平和合成APP的能力。許多研究還證實(shí)，老年癡呆與神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)，A可以增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生4,ROS又反

7、過(guò)來(lái)促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物，引起蛋白質(zhì)和DNA的功能改變，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡5。為了進(jìn)一步研究老年癡呆病的發(fā)病機(jī)制及臨床中藥混合制劑呆聰液的作用機(jī)制，本研究利用海人酸制備老齡大鼠癡呆模型進(jìn)行了中藥呆聰液對(duì)癡呆大鼠模型腦內(nèi)APP基因表達(dá)影響的探討，結(jié)果顯示癡呆模型組能明顯提高腦內(nèi)APP基因表達(dá)水平，使學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降。中藥呆聰液能顯著改善老齡大鼠的記憶力和學(xué)習(xí)功能。呆聰液的三個(gè)不同劑量組雖然都能抑制腦內(nèi)APP基因表達(dá)水平，但是中劑量組效果最佳。在改善學(xué)習(xí)記憶能力的同時(shí)，抑制了APP基因的轉(zhuǎn)錄，降低了APP mRNA的含量，并表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。 【參考文獻(xiàn)】 1 岳啟安，趙淑

8、梅，高敬宗，等.呆聰液對(duì)老齡大鼠癡呆模型腦M受體作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000;20(11)：8468. 2 劉建輝.早老性癡呆病淀粉樣蛋白A研究進(jìn)展J.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2003;20(2)：3714. 3 Lin L,Georgievska A,Mattson A,et al.Cognitive changes and modified processing of amyloid precursor protein in the cortical and hippocampal system after cholinergic synapse loss and muscarinic receptor activationJ.Proc Natl Acad Sci USA,1999;96(21):12108. 4 Butterfield DA,Martin L,Carney JM,et al.Amyloid peptide displays H2O2like reactivity towards aqueous Fe2+,nitroxide spin probes and synaptosomal membrane proteinsJ.Life Sci,1996;58:217. 5 Beckman JS,Chen J,Crow