農(nóng)桿菌介導(dǎo)Bt基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱_圖文

1、生 物 工 程 學(xué) 報 Chin J Biotech2009, March 25; 25(3: 418-423 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061cjb© 2009 Institute of Microbiology, CAS & CSM, All rights reserved 農(nóng)桿菌介導(dǎo) Bt 基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱張明洲 1, 唐喬 1, 陳宗倫 1, 劉軍 1, 崔海瑞 2, 舒慶堯 2, 夏英武 2, I. Altosaar31 中國計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 , 杭州 3100182 浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 ,

2、 杭州 3100293 渥太華大學(xué)生物化學(xué)系 , 加拿大摘 要 :高粱是全球僅次于小麥、水稻、玉米、大豆和馬鈴薯等的重要作物之一。以高粱幼穗愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體 , 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和含有抗潮霉素和 gus 基因的雙元載體將殺蟲晶體蛋白基因 cry1Ab 導(dǎo)入高粱品種 115、 ICS21B 和 5-27,經(jīng) Hyg 篩選共獲得 21個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系 , 52株轉(zhuǎn)基因植株 , 平均轉(zhuǎn)化率為 1.9%。經(jīng) PCR 、 Southern 雜交和 RT-PCR分析表明 cry1Ab 基因已整合入高粱基因組中并得到正確轉(zhuǎn)錄。 Bt 蛋白 Western blotting分析和 ELISA 定量測定顯示

3、 ,cry1Ab 基因在轉(zhuǎn)基因高粱植株中表達(dá) , 但不同轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量有差異。飼蟲試驗(yàn)表明 , 轉(zhuǎn)基因高粱對大螟 (Sesamiainferens 具有一定抗性。關(guān)鍵詞 :Bt 基因 , 農(nóng)桿菌 , 遺傳轉(zhuǎn)化 , 高粱Genetic transformation of Bt gene into sorghum (Sorghumbicolor L. mediated by Agrobacterium tumefaciensMingzhou Zhang1, Qiao Tang1, Zonglun Chen1, Jun Liu1, Hairui Cui2, Qingyao Shu2, Yingwu

4、 Xia2,and I. Altosaar31 College of Life Science, China Jiliang University, Hangzhou 310018, China2 Institute of Nuclear Agricultural Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China3 Department of Biochemistry, University of Ottawa, CanadaAbstract : Sorghum (Sorghum bicolor L. was one of the mo

5、st important crops in the world next to wheat, rice, maize, soybean andbarley. Using the callus derived from immature inflorescence as the recipients, we efficiently transformed sorghum varieties 115,ICS21B and 5-27 with the insecticidal Bacillus thuringiensis (Bt cry1Ab gene carried in the T-DNA of

6、 binary vectors which contained hygromycin resistance gene and gus gene via Agrobacterium tumefaciens. After gradient selection with hygromycin, a totalof 21 independent transgenic plant lines, 52 transgenic plants were regenerated, and the average stably transformation efficiency was1.9%. The integ

7、ration and transcription of cry1Ab gene in transgenic sorghum was confirmed by PCR analysis, Southern blotting andRT-PCR analysis. The Bt proteins were expressed in most transgenic plants with different level from plant to plant by Westernblotting and ELISA assay. According to insect bioassay in lab

8、oratory, the transgenic plants with a relatively high level of Bt gene expression displayed insect-resistance to pink rice borer (Sesamina inferens.Keywords : Bt gene, Agrobacterium tumefaciens, genetic transformatian, sorghumReceived :October 17, 2008; Accepted :December 30, 2008Supported by: Natio

9、nal Natural Science Foundation of China (No. 30270273, Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No. Y304463.Corresponding author: Hairui Cui. Tel: +86-571-86971405; Fax: +86-571-86971202; E-mail: hrcui國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 30270273, 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. Y304463資助。張明洲等 : 農(nóng)桿菌介導(dǎo) Bt 基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱419 J蟲害一直是制約農(nóng)作

10、物高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素 之一。 Bt 抗蟲基因潛在的應(yīng)用價值已引起世界各國 極大關(guān)注 , 農(nóng)作物 Bt 轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究已取得巨大進(jìn) 展 , Bt 玉米與 Bt 棉花等已商業(yè)化應(yīng)用 ; Bt 轉(zhuǎn)基因抗 蟲水稻的獲得也已有不少報道 1,2。高粱是全球僅次 于小麥、水稻、玉米、大豆和馬鈴薯等的重要作物 之一 , 每年由于蟲害造成的損失也很巨大 , 利用轉(zhuǎn) 基因技術(shù)改良高粱品種已引起各國學(xué)者的廣泛關(guān) 注 3,4。然而 , 大量高粱遺傳轉(zhuǎn)化研究工作主要為轉(zhuǎn) 化方法、標(biāo)記基因與報告基因?qū)氲难芯?, 在高粱 生產(chǎn)上的利用價值有限 310; 僅有 1例與高粱重要 農(nóng)藝性狀有關(guān)外源基因基因槍法成功轉(zhuǎn)化的報道

11、, 但轉(zhuǎn)化植株的抗蟲性狀不夠明顯 11。到目前為止 , 還未見有利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 Bt 基因?qū)敫吡坏难?究報道。在眾多植物轉(zhuǎn)基因方法中 , 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn) 化由于方法簡單、效率高和拷貝數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)倍受人 們關(guān)注。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 , 將殺蟲晶體蛋白基 因 cry1Ab 導(dǎo)入高粱幼穗誘導(dǎo)的愈傷組織中 , 獲得了 一批轉(zhuǎn)基因植株 , 對轉(zhuǎn)基因高粱植株進(jìn)行了 PCR 分 析、 Southern 雜交檢測和 RT-PCR 分析 , 并對部分 R 0代轉(zhuǎn)基因植株的 cry1Ab 基因表達(dá)產(chǎn)物的 Western blotting 、 ELISA 分析和室內(nèi)抗蟲性測定進(jìn)行了初步 研究 , 以期為進(jìn)一步

12、應(yīng)用基因工程技術(shù)改良高粱品 種奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 供試材料取不同基因型高粱 (Sorghum bicolor L.恢復(fù)系115、 5-27、 9198、 R011和保持系 ICS21B 、 21B(由 遼寧省農(nóng)科院提供 的劍葉期 23 cm幼穗 , 誘導(dǎo)并 篩選其胚性愈傷組織作為轉(zhuǎn)化受體。1.2 菌株與質(zhì)粒根 癌 農(nóng) 桿 菌 (Agrobacterium tumefaciens 菌 株EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存 , 帶 pKUB 質(zhì)粒。 pKUB 雙 元載體來自加拿大渥太華大學(xué)生物化學(xué)系 2,12, 其 T-DNA 區(qū)內(nèi)含玉米 ubiquitin 啟動子驅(qū)動的 cry1Ab 基因和

13、胭脂堿合成酶啟動子驅(qū)動的抗卡那霉素的 npt 基因與 CaMV35S 啟動子驅(qū)動的抗潮霉素的 hgh 基因和 gus 基因 (圖 1 。1.3 方法1.3.1 轉(zhuǎn)化、篩選與再生挑取生長良好的胚性愈傷組織 , 于侵染培養(yǎng)基 SA-I(OD 600=0.7的 農(nóng) 桿 菌 懸 浮 液 中 浸 泡 、 振 蕩 20 min后 , 棄菌液 , 用無菌濾紙吸干后接種于共培 養(yǎng)基 SA-C 上 , 25o C 避光培養(yǎng) 3 d; 用含有 500 mg/L 氨芐青霉素?zé)o菌水洗滌數(shù)次 , 用無菌濾紙吸干后于 培養(yǎng)基 SA-P 上 25o C 避光恢復(fù)培養(yǎng) 1周 ; 再轉(zhuǎn)入選 擇培養(yǎng)基 SA-S 上篩選 3輪 ,

14、 每輪 1周。 篩選獲得的 抗性愈傷于選擇培養(yǎng)基 SA-S 上 25o C 、 16 h光照 /8 h黑暗條件下培養(yǎng) 1周后 , 轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基 SA-R 上繼 續(xù)篩選和分化培養(yǎng) (25o C 、 16 h光照 /8 h黑暗 , 每周 繼代培養(yǎng) 1次 ; 待不定芽成 34 cm苗時 , 轉(zhuǎn)移到生 根培養(yǎng)基上生根、 狀苗后 , 轉(zhuǎn)移到蛭石過渡培養(yǎng) 12周 , 移栽大田生長至結(jié)實(shí)。使用的培養(yǎng)基見文獻(xiàn) 13。1.3.2 轉(zhuǎn)化植株的 PCR 檢測取對照與抗性愈傷組織再生植株 (R0代 葉片 0.2 g, CTAB 法微量提取高粱總 DNA 。用引物 F cry1Ab : 5-GCAACCATCAATA

15、GCCGTTACA-3, Rcry1Ab : 5-GTCAATGGGATTTGGGTGATTT-3擴(kuò)增導(dǎo)入的 cry1Ab 基因 , 目標(biāo)片段大小為 872 bp; 引物 F gus : 5-GGGATCCATCGGAGCGTAATG-3, Rgus : 5-GC CGACAGCAGCAGTTTCATC-3擴(kuò)增 gus 基因 , 目標(biāo)圖 1 用于高粱轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌中 pKUB 雙元載體 T-DNA 區(qū)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The T-DNA region of pKUB binary vector in Agrobacterium used for sorghum transformation. P

16、nos: nopaline synthase gene promoter; npt II: neomycin phosphotransferase gene, Pubi : maize ubiquityn gene promoter; cry1Ab: coding region of cry1Ab gene; P35S: cauliflower mosaic virus 35S promoter; hph : hygromycin phosphotransferase gene; gus : -glucuronidase gene; LB: left border; RB: right bor

17、der; H: Hind III; B: Bam H I; E: EcoR I.420 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2009 Vol.25 No.3片段大小為 563 bp。 擴(kuò)增程序?yàn)?94o C 4 min; 94o C 30 s, 62o C(cry1Ab 或 61o C(gus 60 s, 72o C 80 s, 30個循環(huán) ; 72o C 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用 1.2%電泳分離 , 觀察拍照。 1.3.3 轉(zhuǎn)化植株的 Southern blotting分析取對照與轉(zhuǎn)化植株 (R0代 葉片 1 g, CTAB法

18、提 取高粱總基因組 DNA, 用 Hin d III限制性內(nèi)切酶酶 切 , 以 32P 標(biāo)記的 cry1Ab 基因?yàn)樘结樳M(jìn)行 Southern blotting 分析 , 探針標(biāo)記采用 Amersham Pharmacia Biotech 公司生產(chǎn)的試劑盒方法進(jìn)行。1.3.4 轉(zhuǎn)化植株的 RT-PCR 檢測取對照與轉(zhuǎn)化植株 (R0代 葉片 0.1 g, Trizol提取 高粱總 RNA, DNAase消化后 , 用 Oligo-T 17為引物進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄 ; 2 µL 的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板 , 用 PCR 檢測 方法擴(kuò)增 cry1Ab 基因。1.3.5 Western blotting

19、分析蛋白質(zhì)提取與 Western blotting分析按吳剛等所 述方法 14進(jìn)行。1.3.6 轉(zhuǎn)基因高粱 cry1Ab 基因表達(dá)產(chǎn)物的測定 取高粱對照與轉(zhuǎn)化植株 (R0代 葉片 0.2 g, 采用 美國 ENVIROLOGIX 公司生產(chǎn)的 Cry1Ab/Cry1Ac ELISA 試劑盒方法 , 定量測定 Cry1Ab 蛋白。1.3.7室內(nèi)抗蟲性離體葉片測定以大螟 (Sesamia inferens 為供試蟲 , 參照葉恭 銀等 15的方法 : 取對照與轉(zhuǎn)化植株 34 cm葉片 (倒 1或 2葉 , 分別放入小玻管內(nèi) , 葉片兩端壓上經(jīng)保鮮 液浸漬過的脫脂棉花 , 并保持葉片平展 ; 每管接入

20、 3頭剛孵化的蟻螟 , 管口塞緊棉花 , 室溫放置培養(yǎng) ; 接蟲后第 2、 4、 6、 8、 10天分別考察、統(tǒng)計(jì)累積食 葉面積和幼蟲死亡率 , 每管重復(fù) 2次。2結(jié)果2.1轉(zhuǎn) cry1Ab 基因高粱植株的獲得生長良好的高粱幼穗誘導(dǎo)愈傷組織 , 經(jīng)農(nóng)桿菌 侵染后轉(zhuǎn)移到恢復(fù)培養(yǎng)基上 , 恢復(fù)培養(yǎng) 1周后轉(zhuǎn)入 含 50 mg/L Hyg選擇培養(yǎng)基進(jìn)行 3輪篩選 , 大部分愈 傷組織生長緩慢 , 顏色暗淡 , 甚至變褐腐死 , 少部 分生長旺盛、 顏色鮮嫩 , 不同基因型間差異明顯 , 其 中 21B 最少 , 只有 11.5%可產(chǎn)生抗性愈傷 , 篩選到 115抗性愈傷最多 , 達(dá)到 37.7%(表

21、 1穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率 A 。 篩選獲得的 253塊抗性愈傷經(jīng)再生、生根、狀苗后 , 蛭石過渡培養(yǎng)移栽大田。 最終共獲得了 21個獨(dú)立的轉(zhuǎn) 基因細(xì)胞系 , 52株 PCR 陽性植株 , 其中恢復(fù)系 5-27獲 得 5株 , 115獲得 40株 , 保持系 ICS21B 獲得 7株 , 平 均轉(zhuǎn)化率 1.9%(表 1穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率 B 。結(jié)果顯示 , 不同 基因型高粱的轉(zhuǎn)化頻率存在明顯差異 , 這可能與不同 基因型轉(zhuǎn)化受體自身的生長和生理狀態(tài)不同有關(guān)。 2.2轉(zhuǎn)基因植株的 PCR 分析PCR 檢測結(jié)果顯示 (圖 2、圖 352株檢測到 cry1Ab 基因 (目標(biāo)片段大小為 872 bp, 說明外源基 因 c

22、ry1Ab 已整合入轉(zhuǎn)基因高粱的基因組 DNA 中 ; cry1Ab 基因 PCR 陽性植株中有 41株檢測到 gus 基 因 (目標(biāo)片段大小為 563 bp, 推測處于同一 T-DNA 上的外源基因 gus 和 cry1Ab 基因在某些轉(zhuǎn)基因植株 中可能發(fā)生重排而未同時整合。表 1農(nóng)桿菌介導(dǎo)不同基因型高粱的轉(zhuǎn)化效率Table 1 Efficiency of Agrobacterium -mediated transformation for different genotypes in sorghumGenotypeNo. of totalcallusNo. of resistantcall

23、usNo. of transgeniccell systemaTransgenicplant bRate of stabletransformation A(%cRate of stabletransformation B (%d5-27 492 93 3 5 18.9 0.6 115257 97 13 40 37.7 5.1 919898 13 0 0 13.3 0RestoringlineR01172 11 0 0 15.3 0ICS21B 135 30 5 7 22.2 3.7Maintainerline 21B 78 9 0 0 11.5 0Total 1132253215222.31

24、.9 a: number of resistant callus which could be regenerated transgenic plant; b: number of PCR positive plant; c: rate of stable transgene A(%=(number of resistant callus/total of callus×100%; d: rate of stable transgene B(%=(number of resistant callus which could be regeneratedtransgenic plant

25、/ total of callus×100%.張明洲等 : 農(nóng)桿菌介導(dǎo) Bt 基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱 421 J 圖 2轉(zhuǎn)基因植株 cry1Ab 的 PCR 分析Fig. 2 PCR analysis of cry1Ab gene in different transgenicplants. M: marker; P: positive control-pKUB plasmid DNA; 19:transgenic plants; N: non-transgenic control plant.圖 3轉(zhuǎn)基因植株 gus 的 PCR 分析 (材料同上圖 Fig. 3 PCR analysis

26、 of gus gene in different transgenic plants.M: marker; P: positive control-pKUB plasmid DNA; 19:transgenic plants; N: non-transgenic control plant.2.3轉(zhuǎn)基因植株 Southern blotting分析為了進(jìn)一步確證 cry1Ab 基因是否整合到高粱基因組 DNA 中 , 對 115 PCR陽性植株進(jìn)行 Southernblotting 分析。 轉(zhuǎn)基因植株基因組 DNA 經(jīng) Hin d 酶切電泳 , 與含 cry1Ab 基因的探針雜交后顯示了特異的

27、 4.1 kb陽性條帶 , 而未轉(zhuǎn)化的對照植株無雜交信號 (圖 4 。結(jié)果證實(shí) cry1Ab 基因已整合到高粱基因組 DNA 中。圖 4轉(zhuǎn)基因高粱植株的 Southern blotting分析Fig. 4 Southern blotting of cry1Ab gene in transgenic sorghumplants. 13: transgenic plants; P: positive control-pKUBplasmid DNA; N: non-transgenic control plant 115.2.4轉(zhuǎn)基因植株的 RT-PCR 分析選取高粱 115 PCR陽性植株和對照植

28、株 , 提取葉片總 RNA 逆轉(zhuǎn)錄后用 PCR 檢測 cry1Ab 基因的轉(zhuǎn)錄。 結(jié)果顯示 , 對照植株沒有擴(kuò)增到目標(biāo)條帶 , 轉(zhuǎn)基因植株都可擴(kuò)增到 872 bp目標(biāo)片段 , 表明導(dǎo)入高粱基因組中的 cry1Ab 基因得到正確的轉(zhuǎn)錄 (圖 5 。圖 5轉(zhuǎn)基因高粱植株中 cry1Ab 基因的 RT-PCR 分析 Fig. 5 RT-PCR analysis of cry1Ab gene in transgenic sorghum plants. N: non-transgenic control plant 115; 110: transgenic plants.2.5Western blott

29、ing分析提取的蛋白 質(zhì)經(jīng) 10% SDS-PAGE 電泳分離 , Western blotting后 , 結(jié)果顯示 , 轉(zhuǎn)基因植株葉片蛋 白提取物在 68 kD處產(chǎn)生與預(yù)期的標(biāo)準(zhǔn) Cry1Ab 蛋白 大小一致的雜交條帶 , 而未轉(zhuǎn)化的高粱恢復(fù)系 115葉片蛋白提取物未出現(xiàn)特異雜交條帶 , 表明 cry1Ab 基因已在轉(zhuǎn)基因高粱植株葉片中正確表達(dá) (圖 6 。圖 6轉(zhuǎn)基因高粱植株 Cry1Ab 蛋白的 Western blotting分析Fig. 6 Western blotting analysis of Cry1Ab protein in transgenic sorghum plants

30、. M: protein marker; 16: transgenic plants; N: non-transgenic control plant 115; Cry1Ab: Cry1Ab standard protein.2.6轉(zhuǎn)基因植株 Bt 蛋白含量的測定提取轉(zhuǎn)基因植株倒 2葉葉片的 Bt 蛋白 , 用 ELISA 方法對轉(zhuǎn)基因植株抗蟲基因 cry1Ab 的表達(dá)產(chǎn) 物進(jìn)行了測定。在所測試的 20株轉(zhuǎn)基因植株中 , 有 11株可檢測到 Bt 蛋白 , 但 Bt 蛋白含量差異較大 , 最 高 的 為 SR25, 可 達(dá) 0.850 µg/g, 最 低 的 僅 為 0.015 &#

31、181;g/g(表 2; 而其余 9株未檢測到 Bt 蛋白的表 達(dá)。 結(jié)果表明 cry1Ab 基因在所獲得的一些轉(zhuǎn)基因高 粱中能正常表達(dá) , 但不同植株間表達(dá)量存在差異 , 而另一些轉(zhuǎn)基因植株中不能表達(dá) , 推測與轉(zhuǎn)基因沉 默有關(guān)。2.7轉(zhuǎn)基因植株室內(nèi)離體抗蟲性生物測定表 2列出了接蟲 10 d后葉片受損情況和幼蟲平 均死亡率。結(jié)果表明 , 轉(zhuǎn)基因植株的平均累積食葉 面積均低于對照 ; 部分轉(zhuǎn)基因植株 (SR16、 SR20、 SR22、 SR25和 SR26 對大螟表現(xiàn)出一定的抗性 , 幼 蟲平均死亡率為 16.7%40%, 此結(jié)果與 Bt 蛋白表達(dá)422 ISSN1000-3061 CN1

32、1-1998/Q Chin J Biotech March 25, 2009 Vol.25 No.3表 2轉(zhuǎn)基因植株葉片的 Bt 蛋白含量及對大螟 (Sesamia inferens 抗性的生物離體測定Table 2 Detecion of the Bt toxin content and in vitro bioassay on the resistance to pink rice borer (Sesamia inferens for transgenic sorghum leafCode of plants Bt content (µg/ga Reduction in lea

33、f feeding (%b Mean larval weight (mg Mean larval mortality (%CK 0 / 205.0±21.0 0SR04 0.015±0.00140.6±1.2 121.7±13.1 0SR16 0.044±0.00647.2±0.9 108.3±9.020.0±0.5 SR17 0.015±0.00140.5±0.7 122.0±17.5 0SR18 0.082±0.00550.7±1.1 101.0±11

34、.3 0SR19 0.106±0.00750.9±1.5 100.7±9.8 0SR20 0.181±0.01165.7±0.8 70.4±7.6 16.7±0.2SR21 0.051±0.00449.5±0.9 103.6±10.1 0SR22 0.170±0.00860.0±1.1 82.0±7.340.0±0.5 SR24 0.017±0.00140.7±0.9 122.5±6.7 0SR25 0.850±0.

35、02156.7±1.3 88.8±7.640.0±0.7 SR26 0.738±0.02260.4±0.9 81.2±8.833.3±0.3 a: Bt content(µg/g= Bt detected value/fresh weight of leave; b: reduction in leaf feeding(%=(leaf feeding of non-transgenic control plant-leaf feeding of transgenic plants/leaf feeding of n

36、on-transgenic control plant×100%.測定結(jié)果相一致。但總體上轉(zhuǎn)基因高粱對水稻大螟 的抗性還不夠強(qiáng) , 而且不同轉(zhuǎn)基因高粱植株對大螟 幼蟲的致死率差異較大 , 可能與轉(zhuǎn)基因 cry1Ab 的表 達(dá)水平低有關(guān) , 也可能大螟或不同個體對 Bt 蛋白的 敏感性存在差異有關(guān) , 這方面工作及對不同靶標(biāo)害 蟲抗性測定工作等還需做進(jìn)一步深入研究。3討論在重要的禾谷類作物中 , 高粱是被公認(rèn)為外源 基因?qū)胱铍y的作物之一。從為數(shù)不多的成功轉(zhuǎn)化 實(shí)例來看 , 導(dǎo)入的外源基因主要是報告基因如 gus 基因、 GFP 基因 , 標(biāo)記基因如 bar 基因以及幾丁質(zhì) 酶基因等

37、310, 在高粱生產(chǎn)上的利用價值有限。 本研 究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法 , 以高粱幼穗誘導(dǎo)愈傷組織為 轉(zhuǎn)化受體 , 將 Bt 殺蟲晶體蛋白質(zhì)基因 cry1Ab 導(dǎo)入高 粱恢復(fù)系 115、 5-27和保持系 ICS21B 中 , 從 21個 獨(dú)立轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系篩選獲得了 52株轉(zhuǎn)基因植株 , 穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化頻率平均為 1.9%, 與 Zhao 等 (2.1%報道的農(nóng) 桿菌介導(dǎo)法類似 , 卻高于基因槍法介導(dǎo)高粱遺傳轉(zhuǎn) 化的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化頻率 3,10。 但與玉米等其他重要禾谷類 作物相比 , 高粱的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化頻率仍然偏低 , 這也是 高粱遺傳轉(zhuǎn)化重要障礙之一。本研究獲得的轉(zhuǎn)抗蟲 基因高粱 , 對于豐富高粱的抗蟲資源

38、, 解決高粱生 產(chǎn)中的螟蟲危害 , 將具有重大的意義。植物基因型也是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)高粱遺傳轉(zhuǎn)化 成功與否的關(guān)鍵因素之一。在 Zhao 等的報道中 , 所 采用的 2種基因型存在著差異 , 5890個 P8980112基 因型未成熟胚中獲得了 115株轉(zhuǎn)基因植株 , 平均穩(wěn) 定轉(zhuǎn)化率為 2.0%, 從 285個 PHI391未成熟胚中最終 獲得 16株轉(zhuǎn)基因植株 , 平均穩(wěn)定轉(zhuǎn)化率為 5.6%。 本 研究中也觀察到這一現(xiàn)象 , 所采用的 6種基因型中 , 僅從 115、 5-27、 ICS21B 中最終獲得轉(zhuǎn)基因植株 , 且 它們也存在著差異 (表 1 。因此 , 在農(nóng)桿菌介導(dǎo)高粱 的遺傳轉(zhuǎn)化中

39、應(yīng)注意選擇基因型。PCR 分析、 Southern blotting和 RT-PCR 檢測表 明 , cry1Ab 基已整合入高粱基因組中并得到正確轉(zhuǎn) 錄。但有部分 cry1Ab 基因 PCR 陽性植株中檢測不 到 gus 基因的整合 , 這與 GUS 活性的組織化學(xué)染色 分析結(jié)果 (另文報道 一致 , 這說明處于同一 T-DNA 上的 gus 基因、 cry1Ab 基因在某些轉(zhuǎn)基因株系中并 非同時整合 , 可能發(fā)生了 T-DNA 的不完全整合事 件、重排 ; 另外 , Bt蛋白含量的測定結(jié)果表明 , 轉(zhuǎn)基 因高粱植株中 cry1Ab 基因表達(dá)強(qiáng)度上存在一定差異 , 而某些轉(zhuǎn)基因植株 (如 S

40、R02、 SR05 雖可檢測到 cry1Ab 基因的整合 , 但檢測不到 Bt 蛋白的表達(dá) , 這 可能發(fā)生了轉(zhuǎn)基因的沉默 (Transgene silence, 與 Zhu 等 5、 Zhao 等 3、 Girijashankar 等 11和 Nguyen 等 6觀察到的基因沉默現(xiàn)象類似 , 其機(jī)理有待進(jìn)一 步深入研究。轉(zhuǎn)基因植株離體抗蟲性生物測定結(jié)果 表明 , 部分轉(zhuǎn)基因植株對大螟表現(xiàn)出一定的抗性 , 此結(jié)果與 Bt 蛋白表達(dá)測定結(jié)果是一致的。但總體 上轉(zhuǎn)基因高粱對水稻大螟的抗性還不夠強(qiáng) , 而且張明洲等: 農(nóng)桿菌介導(dǎo) Bt 基因遺傳轉(zhuǎn)化高粱 423 不同轉(zhuǎn)基因高粱植株對大螟幼蟲的致死率差

41、異較大, 這可能與轉(zhuǎn)基因 cry1Ab 的表達(dá)水平低或不表達(dá)有關(guān), 也可能大螟或不同個體對 Bt 蛋白的敏感性存在差異 有關(guān)。 已有研究表明, 在轉(zhuǎn)基因水稻中, Bt 蛋白對鱗 翅目螟蛾科害蟲的致死作用一般強(qiáng)于夜蛾科害蟲, 但目前差異性機(jī)理尚不清楚 16 9 Howe A, Sato S, Dweikat I, et al. Rapid and reproducible Agrobacterium-mediated transformation of sorghum. Plant Cell Rep, 2006, 25: 784791. 10 Nguyen T-Van, Thu TT, Clae

42、ys M, et al. Agrobacteriummediated transformation of sorghum (Sorghum bicolor (L. Moench using an improved in vitro regeneration system. Plant Cell Tiss Organ Cult, 2007, 91(11: 155164. 11 Girijashankar V, Sharma HC, Sharma KK, et al. Development of transgenic sorghum for insect resistance against s

43、potted stem borer (Chilo partellus. Plant Cell Rep, 2005, 24: 513522. 12 Zhang MZ, Cui HR, Shu QY, et al. Regeneration system and influencing factors for genetic transformation of sorghum shoot apex. J Nucl Agri Sci, 2006, 20(1: 2326, 5. 張明洲, 崔海瑞, 舒慶堯, 等. 高粱莖尖再生體系及其 遺 傳 轉(zhuǎn) 化 影 響 因 子 的 研 究 . 核 農(nóng) 學(xué) 報 ,

44、 2006, 20(1: 2326, 5. 13 Xiang YB, Liang ZQ, Gao MW, et al. Agrobacterium mediated transformation of insecticidal Bacillus thuringiensis cryIA(b and cryIA(c genes and their expression in rice. Chin J Biotech, 1999, 15(4: 494500. 項(xiàng)友斌, 梁竹青, 高明尉, 等. 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蘇云金桿 菌抗蟲基因 cryIA(b和 cryIA(c在水稻中的遺傳轉(zhuǎn)化及 蛋白表達(dá). 生物工

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46、ield evaluation of resistance of transgenic rice containing a synthetic cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis Berliner to two stem borers. Entomol Soc Aver, 2001, 94(1: 271276. 16 Gao YL, Fu Q, Wang F, et al. Effects of transgenic rice harboring cry1Ac and Cp TI genes on survival of Chilo suppressalis and Sesamia inferens and field composition of rice stemborers. Chinese J Rice Sci, 2006, 20