凍干乙型腦炎滅活疫苗(Vero細胞)

1、凍干乙型腦炎滅活疫苗（Vero細胞）Donggan Yixing Naoyan Miehuoyimiao (Vero Xibao) Japanese Encephalitis Vaccine（Vero Cell），Inactivated, Freeze-dried 本品系用乙型腦炎(以下簡稱乙腦)病毒接種于Vero細胞, 經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒、濃縮、純化后，加入穩(wěn)定劑凍干制成，用于預(yù)防乙腦。1. 基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原材料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合 “凡例”有關(guān)要求。 2. 制造 2.1 生產(chǎn)用細胞 生產(chǎn)用細胞為Vero細胞。 細胞庫的管理及檢定應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)和檢定用

2、動物細胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程”規(guī)定。各種子批代次應(yīng)不超過批準(zhǔn)的限定代次，取自同批工作細胞庫的1支或多支細胞管，經(jīng)復(fù)蘇、擴增后的細胞僅用于一批疫苗的生產(chǎn)。 細胞制備取工作細胞庫中的1支或多支細胞管，細胞復(fù)蘇、 擴增至接種病毒的細胞為1批。將復(fù)蘇后的單層細胞用胰蛋白酶或其他適宜的消化液進行消化， 分散成均勻的細胞， 加入適宜的培養(yǎng)液混合均勻，置3537培養(yǎng)形成致密單層細胞。2.2 毒種名稱及來源生產(chǎn)用毒種為乙腦病毒P3株。種子批的建立應(yīng)符合 “生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”規(guī)定。乙腦病毒P3株原始種子應(yīng)不超過第53代， 主種子批和工作種子批的代次應(yīng)不超過批準(zhǔn)的限定代次。種子批毒種的檢定主種子批應(yīng)

3、進行如下全面檢定，工作種子批至少應(yīng)進行5項檢定。 .1鑒別試驗將毒種10倍系列稀釋，取10-110-5稀釋度的病毒液與乙腦特異性免疫血清等量混合作為試驗組，取10-410-8稀釋度的病毒液與乙型腦炎非特異性血清等量混合作為對照組，于37水浴中和90分鐘，試驗組和對照組每個稀釋度分別接種體重為7-9g 昆明鼠或其他品系小鼠20只，每只腦內(nèi)注射0.03ml，逐日觀察，3日內(nèi)死亡不計，觀察14天，計算中和指數(shù)應(yīng)不低于500。 .2無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。.3支原體檢查 依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。 .4 病毒滴定 將毒種10倍系列稀釋，取10-610-9稀釋度病

4、毒液腦內(nèi)接種體重為79g 昆明鼠或其他品系小鼠，每稀釋度注射小鼠4只，每只0.03ml，逐日觀察，3日內(nèi)死亡者不計，觀察14天，病毒滴度應(yīng)不低于8.0 Lg LD50/ml。.5 病毒外源因子檢查 依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。 .6免疫原性檢查用主種子批毒種制備原疫苗，腹腔免疫體重為1214g NIH小鼠10只，每只0.3ml，免疫2次，間隔7天，初免后第14天， 對免疫組和未經(jīng)免疫的對照組小鼠用不低于10 000 LD50病毒量的非生產(chǎn)用乙腦病毒P3株進行腹腔攻擊，同時各組小鼠每只腦腔注射0.03ml稀釋液。21天后免疫組應(yīng)100%保護，對照組死亡率應(yīng)不低于80%。 毒種保存凍干

5、毒種保存于-20以下，液體毒種保存于- 60以下。2.3 原液 細胞制備 按項進行。 培養(yǎng)液 培養(yǎng)液為含有適宜濃度滅能新生牛血清的199或其他適宜培養(yǎng)液。新生牛血清的質(zhì)量應(yīng)符合要求（附錄XIII D），且乙腦抗體應(yīng)為陰性。 對照細胞病毒外源因子檢查 依法檢查（附錄XII C），應(yīng)符合規(guī)定。 病毒接種和培養(yǎng) 細胞生長成致密單層時，棄去細胞培養(yǎng)液，用Earles液或其他適宜的洗滌液充分沖洗細胞,除去牛血清后,加入MEM維持液。工作種子批毒種按0.050.3MOI接種（同一批工作種子批應(yīng)按同一MOI接種）。 置適宜溫度下培養(yǎng)。 病毒收獲 經(jīng)培養(yǎng)60-84小時，澄清過濾后收獲病毒液。根據(jù)細胞生長情況，

6、可加入新鮮維持液繼續(xù)培養(yǎng)， 進行多次病毒收獲。同一細胞批的同一次病毒收獲液檢定合格后可合并為單次病毒收獲液。2.3.6 單次病毒收獲液檢定按3.1項進行。 2.3.7 病毒滅活 應(yīng)在規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍內(nèi)進行病毒滅活。單次病毒收獲液中加入終濃度為200ug/ml甲醛，置適宜溫度滅活一定時間。病毒滅活到期后，每個病毒滅活容器應(yīng)立即取樣， 分別進行病毒滅活驗證試驗。2.3.8 超濾濃縮 同一細胞批制備的多個單次病毒收獲液經(jīng)病毒滅活后， 進行適宜倍數(shù)的超濾濃縮至規(guī)定的蛋白質(zhì)含量范圍。 2.3.9 純化 濃縮后的病毒液采用蔗糖密度梯度區(qū)帶離心法或其他適宜的方法進行純化。2.3.10脫糖將收集液以截留分

7、子量100kD的膜進行超濾脫糖后，可加入適宜濃度的穩(wěn)定劑，即為原液。 2.3.11 原液檢定 按3.2 項進行。 2.4半成品 配制用疫苗稀釋液將原液按同一蛋白質(zhì)含量和抗原含量進行稀釋，總蛋白質(zhì)含量不得超過20ug/ml，加入適宜的穩(wěn)定劑即為半成品。 半成品檢定按3.3項進行。2.5成品 分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。 分裝及凍干應(yīng)符合“生物制品分裝凍干規(guī)程”規(guī)定。 規(guī)格 復(fù)溶后每瓶0.5ml，每1次人用劑量0.5ml。 包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定。 3檢定 3.1 單次病毒收獲液檢定 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。支原體檢查 依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符

8、合規(guī)定。病毒滴定按.4項進行，應(yīng)不低于7.0 Lg LD50/ml。3.2 原液檢定無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。3.2.2 病毒滅活驗證試驗 將病毒滅活后供試品腦內(nèi)接種體重1214g小鼠8只，每只0.03ml，同時腹腔接種0.5 ml， 為第1代； 7天后將第1代小鼠處死3只，取腦制成10%腦懸液，同法腦內(nèi)接種1214g小鼠6只，為第2代；7天后將第2代小鼠處死3只，同法腦內(nèi)接種1214g小鼠6只為第3代， 接種后逐日觀察，3日內(nèi)死亡者不計， 觀察14天，全部健存為合格。（動物死亡數(shù)量應(yīng)不超過試驗用動物總數(shù)的20% ）。3.2.3 蛋白質(zhì)含量應(yīng)按附錄VI B第二法進行測定

9、，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.2.4 抗原含量采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.3 半成品檢定 無菌檢查 依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。 抗原含量采用酶聯(lián)免疫法，應(yīng)按批準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。3.4 成品檢定除水分測定外， 應(yīng)按標(biāo)示量加入滅菌注射用水， 復(fù)溶后進行以下各項檢定。 鑒別試驗 采用酶聯(lián)免疫法檢測， 應(yīng)證明含有乙型腦炎病毒抗原。 外觀應(yīng)為白色疏松體，復(fù)溶后應(yīng)為無色澄明液體，無異物。 3.4.3水分 應(yīng)不高于3.0%（附錄 VII D）。 3.4.4 游離甲醛含量 應(yīng)不高于10g/ml（附錄VI L）。3.4.5 效價測定采用免疫小鼠中和抗體測定法， 以蝕斑減少中和試驗測定中和抗體。

10、 參考疫苗（RA和RB）以及中和試驗陽性血清由國家藥品檢定機構(gòu)提供。將被檢疫苗(T)和參考疫苗(R)分別稀釋成1：32，腹腔免疫體重為1214g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，間隔7天。第2次免疫后第7天采血，分離血清，同組小鼠血清等量混合，于56滅活30分鐘。稀釋陽性血清、被檢苗血清和參考苗血清，分別與稀釋病毒(約200PFU/0.4ml)等量混合，同時將稀釋后的病毒再1：2稀釋作為病毒對照，置37水浴90分鐘，接種6孔細胞培養(yǎng)板BHK21細胞，每孔0.4 ml，置37培養(yǎng)90分鐘，加入含甲基纖維素的培養(yǎng)基覆蓋物，于37培育5天，染色，蝕斑計數(shù)，病毒對照組的蝕斑平均數(shù)應(yīng)在50150之間

11、。計算被檢疫苗和參考疫苗組對病毒對照組的蝕斑減少率。 蝕斑減少率=（1S/ CV）100% S 為被檢苗平均斑數(shù) CV 為病毒對照組平均斑數(shù) 按以下公式計算被檢苗效力T 值。 T=（Y50）/ 47.762 Lg X T= 被檢苗引起50%蝕斑減少的抗體稀釋度的對數(shù) Y為被檢苗的蝕斑減少數(shù) X 為蝕斑中和試驗時所用的血清稀釋倍數(shù) 結(jié)果判定： （1）合格： T （RA+RB）/ 2 0.33 （2）重試：（RA+RB）/2 0.66 T（RA+RB）/ 2 0.33 （3）不合格： T（RA+RB）/ 2 0.66 3.4.6 熱穩(wěn)定性試驗 疫苗出廠前應(yīng)進行熱穩(wěn)定性試驗， 于37放置7天，按3.4.5項進行效價測定，仍應(yīng)合格。如合格， 視為效價測定合格。 3.4.7牛血清白蛋白殘留量應(yīng)不高于50ng/劑（附錄VIII F）。無菌檢查依法檢查（附錄XII A），應(yīng)符合規(guī)定。 3.4.9 異常毒性檢查依法檢查（附錄XII B），應(yīng)符合規(guī)定。 細菌內(nèi)毒素含量測定應(yīng)不高于50EU/ml（附錄XII E 凝膠限量試驗） 抗生素殘留量測定細胞制備過程中加入抗生素的應(yīng)進行該項檢查， 采用ELISA法，應(yīng)不高于10ng/ml。 Vero細胞DNA殘留量應(yīng)不高于100pg/劑（附錄IX B）。