人牙本質(zhì)磷蛋白對(duì)小型豬修復(fù)性牙本質(zhì)形成作用的實(shí)驗(yàn)研究

1、人牙本質(zhì)磷蛋白對(duì)小型豬修復(fù)性牙本質(zhì)形成作用的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】目的觀察人牙本質(zhì)磷蛋白（dentin phosphoprotein，DPP）對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步研究DPP的功能。方法用人DPP粉作蓋髓劑，對(duì)小型豬健康恒牙進(jìn)行蓋髓實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組采用氫氧化鈣和空白對(duì)照（氧化鋅丁香油糊劑蓋髓），通過組織病理學(xué)觀察牙本質(zhì)橋的形成。結(jié)果DPP蓋髓術(shù)后2周，穿髓孔下固有牙髓細(xì)胞分化為類造牙本質(zhì)細(xì)胞，分布在已形成的修復(fù)性牙本質(zhì)團(tuán)塊周圍；術(shù)后1個(gè)月有完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成；術(shù)后3個(gè)月修復(fù)性牙本質(zhì)橋增厚且結(jié)構(gòu)致密，主要是管樣牙本質(zhì)，其下方排列分化好的造牙本質(zhì)細(xì)胞。氫氧化鈣蓋髓組，術(shù)后2周界面有炎癥壞

2、死區(qū)，只有少量的鈣質(zhì)團(tuán)塊形成，13個(gè)月逐漸形成完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋，但較DPP蓋髓后形成修復(fù)性牙本質(zhì)的速度慢且量較少。結(jié)論人DPP對(duì)牙髓刺激性小，可以直接誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞分化及修復(fù)性牙本質(zhì)形成，提示DPP在牙本質(zhì)發(fā)育和修復(fù)的生物礦化中起重要作用。【關(guān)鍵詞】磷蛋白類牙髓覆蓋術(shù)牙本質(zhì)，繼發(fā)性豬，雛型 Experimental study on the effect of restorative dentin formation with human dentin phosphoprotein in immature permanent teeth of minipigOUYANG Yong?, LI

3、Yujing, LIU Xiaoyong, et al.?School of Stomatology, Sun Yat-Sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510060【Abstract】ObjectiveTo investigate the function of human dentin phosphoprotein（DPP） on dentine mineralization in vivo. Methods Pulp capping with human DPP was made in the permanent teeth of

4、 minipigs with calcium hydroxide and zinc oxide eugenol cement as controls. The minipigs were sacrificed at intervals of 14,30,90 days respectively after operation.ResultsThe histopathological results revealed that pulp cells had developed into odontoblastoid cells around the major restorative denti

5、n body after two weeks. There was complete restorative dentin bridge a month later. The bridge became thick and dense, and mainly was tubular dentin in 3 month. There were well developed odontoblasts under the bridge. In the calcium hydroxide capping group, inflammatory cytonecrosis zone was found i

6、n the surface of dental pulp and only a little calcial bodies formed in two weeks. Complete restorative dentin bridge was formed in 1 to 3 months, the speed of dentin bridge formation was not as quick as that of DPP group. ConclusionDPP can induce pulp cells to develop into odontoblasts and formatio

7、n of dentin bridge with little stimulation to the dental pulp. This study suggests that DPP plays an important role in the biomineralization of dentin development and restoration.【Key words】Phosphoproteins Dental pulp capping Dentin，secondarySwine，miniature 牙本質(zhì)磷蛋白（dentinphos phoprotein,DPP）是非膠原蛋白的重要

8、成分，它在牙本質(zhì)形成過程中的生物誘導(dǎo)作用已被許多研究所證實(shí)1，2。體外實(shí)驗(yàn)表明，DPP與Ca2+有很高的親和力3；在飽和磷酸鈣溶液中能夠誘導(dǎo)羥磷灰石晶體的形成，尤其是當(dāng)其與固相支持物結(jié)合后能夠明顯誘導(dǎo)礦物形成1，但對(duì)其在體內(nèi)的研究卻很少。我們?cè)谕瓿蓪?duì)人DPP的提取、純化及對(duì)其性質(zhì)分析的基礎(chǔ)上，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察DPP對(duì)修復(fù)性牙本質(zhì)的誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步探討DPP的功能。材料與方法1牙本質(zhì)磷蛋白的提取與純化：將經(jīng)過充分洗滌的人牙本質(zhì)粉用0.6mol/LHCl脫礦，使用DEAE-SepharoseCL6B離子交換層析柱分離純化DPP，并凍干成粉。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選擇健康1周歲齡中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬5只，體重14

9、26kg，雄性3只，雌性2只，由北京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。實(shí)驗(yàn)選擇上、下頜第一恒磨牙，共20顆，雙側(cè)下頜側(cè)切牙共10顆。實(shí)驗(yàn)分組：按蓋髓術(shù)后觀察時(shí)間不同分為2周組（2只）、1個(gè)月組（2只）及3個(gè)月組（1只）。將每只小型豬的4顆第一恒磨牙隨機(jī)分配，2顆牙做DPP蓋髓，1顆牙做氫氧化鈣蓋髓，1顆牙做對(duì)照（氧化鋅丁香油糊劑蓋髓）。同時(shí)隨機(jī)選擇下頜側(cè)切牙分別做DPP或氫氧化鈣蓋髓。3其他試劑：氫氧化鈣（化學(xué)純，北京市朝陽區(qū)旭東化工廠）；復(fù)方噻胺酮（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所提供）；氧化鋅（分析純，上海化學(xué)試劑廠）；丁香油（化學(xué)純，北京化學(xué)試劑公司）；磷酸鋅水門汀（上海齒科材料廠）。4實(shí)驗(yàn)步驟：(1)實(shí)驗(yàn)用小

10、型豬用復(fù)方噻胺酮按1ml/10kg耳后肌肉注射麻醉，充分清潔口周及口腔。2碘酊消毒實(shí)驗(yàn)牙及牙周組織，用帶有完善冷卻裝置的高速渦輪機(jī)裂鉆在實(shí)驗(yàn)?zāi)パ?面?zhèn)涠矗骂M側(cè)切牙分別備類洞，謹(jǐn)慎穿髓，穿髓孔23mm,生理鹽水反復(fù)沖洗，充分止血。(2)蓋髓處理：每只小型豬隨機(jī)選2顆恒磨牙，用凍干的DPP粉覆蓋于穿髓孔，其上用氧化鋅丁香油糊劑墊底，磷酸鋅水門汀充填。選1顆恒磨牙，用氫氧化鈣糊劑蓋髓，氧化鋅丁香油糊劑墊底，磷酸鋅水門汀充填。選1顆恒磨牙直接用氧化鋅丁香油糊劑蓋髓，磷酸鋅水門汀充填。下頜側(cè)切牙隨機(jī)分別用氫氧化鈣和DPP覆蓋，氧化鋅水門汀墊底，磷酸鋅水門汀充填。術(shù)中嚴(yán)格無菌操作。(3)分別于術(shù)后2周、

11、4周及3個(gè)月處死動(dòng)物，迅速取下實(shí)驗(yàn)用牙和對(duì)照牙、編號(hào)、10%福爾馬林固定。固定前去除充填物，或遠(yuǎn)離手術(shù)區(qū)、側(cè)向穿髓。(4)組織病理學(xué)觀察：鹽酸、甲酸、氯化鈉混合脫鈣液微波脫鈣，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，片厚5m。HE染色，光鏡下觀察。結(jié)果1DDP蓋髓2周組：蓋髓劑下方牙髓纖維細(xì)胞增生，有修復(fù)性牙本質(zhì)形成，呈粉染團(tuán)塊狀，相互連接，部分團(tuán)塊基質(zhì)較致密，部分團(tuán)塊中有少數(shù)細(xì)胞，呈骨樣牙本質(zhì)。團(tuán)塊周圍有整齊排列的單層方形或矮柱狀的類造牙本質(zhì)細(xì)胞。修復(fù)性牙本質(zhì)下方及根髓內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并有少量炎癥細(xì)胞（1）。1DPP蓋髓術(shù)后2周，有不完整的修復(fù)性牙本質(zhì)形成(HE13)2DPP蓋髓1個(gè)月組：可

12、見大量修復(fù)性牙本質(zhì)團(tuán)塊，呈橋形分布，部分牙齒已形成完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋封閉穿髓孔。其修復(fù)性牙本質(zhì)基質(zhì)均勻、致密，并可見牙本質(zhì)小管，個(gè)別牙修復(fù)性牙本質(zhì)內(nèi)可見少量細(xì)胞埋入。修復(fù)性牙本質(zhì)周圍有排列整齊的柱狀造牙本質(zhì)細(xì)胞，其下方可見牙髓除有纖維母細(xì)胞及毛細(xì)血管增生外基本正常。個(gè)別穿髓孔未完全封閉，有明顯的修復(fù)性牙本質(zhì)從兩側(cè)向中心生長(zhǎng)的趨勢(shì)，修復(fù)性牙本質(zhì)與牙本質(zhì)結(jié)合部連接緊密。3DPP蓋髓3個(gè)月組：均有完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，將穿髓孔封閉；牙本質(zhì)橋結(jié)構(gòu)致密，大部分為管狀牙本質(zhì)，橋下方可見排列整齊的造牙本質(zhì)細(xì)胞，其下牙髓正常，偶見輕度毛細(xì)血管擴(kuò)張（2）。2DPP蓋髓術(shù)后3個(gè)月，牙本質(zhì)橋髓側(cè)造牙本質(zhì)細(xì)胞排

13、列整齊，修復(fù)性牙本質(zhì)內(nèi)牙本質(zhì)小管較規(guī)則(HE33)4氫氧化鈣蓋髓術(shù)后2周牙齒，穿髓孔下方可見薄層牙髓壞死，其下纖維母細(xì)胞增生，偶見少量鈣化團(tuán)塊形成，周圍有方形類造牙本質(zhì)細(xì)胞，牙髓內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，組織內(nèi)有少量血管增生、充血。蓋髓術(shù)后1個(gè)月的牙齒，可見修復(fù)性牙本質(zhì)團(tuán)塊形成，結(jié)構(gòu)較致密，呈管樣牙本質(zhì)，周圍有柱狀造牙本質(zhì)細(xì)胞，但無完整的牙本質(zhì)橋形成，修復(fù)性牙本質(zhì)下方牙髓充血，有少量炎癥細(xì)胞。蓋髓術(shù)后3個(gè)月，可見完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成，形態(tài)不規(guī)則，呈管樣牙本質(zhì)，與原發(fā)性牙本質(zhì)結(jié)合緊密，牙髓正常。5對(duì)照組：術(shù)后2周的牙齒，穿髓孔下方炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管擴(kuò)張，部分牙髓壞死，無修復(fù)性牙本質(zhì)形成；術(shù)后1

14、個(gè)月，髓腔內(nèi)可見少量不規(guī)則鈣化團(tuán)塊，周圍有類造牙本質(zhì)細(xì)胞，無完整牙本質(zhì)橋形成；術(shù)后3個(gè)月，修復(fù)性牙本質(zhì)形成，形態(tài)不規(guī)則，周圍有造牙本質(zhì)細(xì)胞，仍未完全封閉穿髓孔。討論修復(fù)性牙本質(zhì)與原發(fā)性牙本質(zhì)形成過程相似，包括細(xì)胞分化、造牙本質(zhì)細(xì)胞分泌膠原基質(zhì)及生物礦化4。目前認(rèn)為這一過程有很多因素參與調(diào)控，如特異性蛋白、BMP及多種生長(zhǎng)因子。近年來許多研究表明，牙本質(zhì)非膠原蛋白（尤其是DPP）與牙本質(zhì)的形成有密切關(guān)系。DPP作為牙本質(zhì)非膠原蛋白的最重要組成成分，占非膠原蛋白的50%左右，是牙本質(zhì)中最具礦化活性的基質(zhì)蛋白質(zhì)之一，在牙本質(zhì)礦化過程中起重要作用5。本研究結(jié)果顯示，2周時(shí)DPP蓋髓牙就出現(xiàn)了大片鈣化組

15、織基質(zhì)團(tuán)塊，形成不完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋，術(shù)后1個(gè)月，DPP組即出現(xiàn)了完整的修復(fù)性牙本質(zhì)橋，封閉穿髓孔。術(shù)后3個(gè)月所形成的修復(fù)性牙本質(zhì)橋完整，結(jié)構(gòu)致密，且形成大量的管樣牙本質(zhì)，并與原發(fā)性牙本質(zhì)結(jié)合緊密，周圍造牙本質(zhì)細(xì)胞排列整齊。其誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的速度超過氫氧化鈣及對(duì)照組。這表明DPP有顯著的誘導(dǎo)牙本質(zhì)細(xì)胞分化及誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的能力。很多研究已證明，牙髓創(chuàng)傷或切除后，在無菌條件下會(huì)形成牙本質(zhì)橋4。氫氧化鈣本身具有誘導(dǎo)或加速修復(fù)性牙本質(zhì)橋形成的作用，是目前所公認(rèn)并已廣泛在臨床上應(yīng)用的良好蓋髓劑之一。但本研究結(jié)果充分說明，DPP與氫氧化鈣比較，更具有組織不良刺激性小，促進(jìn)細(xì)胞迅速分化和膠原

16、分泌及較強(qiáng)的誘導(dǎo)礦化作用。國(guó)外一些研究認(rèn)為，DPP可誘導(dǎo)固有牙髓細(xì)胞分化為造牙本質(zhì)細(xì)胞并參與牙髓細(xì)胞代謝，促進(jìn)基質(zhì)分泌及礦化過程6。DPP富含磷酸化絲氨酸和天門冬氨酸，與Ca2+的結(jié)合能力很強(qiáng)3。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)DPP與膠原基質(zhì)結(jié)合后，能誘導(dǎo)羥磷灰石晶體的形成，并促進(jìn)礦物晶體的生長(zhǎng)，從而誘導(dǎo)礦化形成7，8。另外，Lussi及Linde9將DPP與AH-Sepharose結(jié)合后，植入小型豬皮下觀察，發(fā)現(xiàn)DPP能誘導(dǎo)礦物形成；vandenBos和Beertsen10將鼠牙DPP與脫鈣牛皮質(zhì)骨膠原片結(jié)合后植于Wistar鼠的顱骨皮下，發(fā)現(xiàn)結(jié)合DPP的脫鈣骨膠原片誘導(dǎo)礦化的速度較未結(jié)合DPP的快許多，

17、且面積廣泛。從本研究DPP蓋髓的組織學(xué)變化也可以看出，穿髓孔下牙髓細(xì)胞在DPP誘導(dǎo)下較早分化為類造牙本質(zhì)細(xì)胞，后逐漸分化為造牙本質(zhì)細(xì)胞，膠原基質(zhì)分泌逐漸增加，礦化時(shí)先形成骨樣牙本質(zhì)，再逐漸形成管樣修復(fù)性牙本質(zhì)。在此過程中，DPP不象Ca(OH)2有較明顯的炎癥、壞死過程，而是在接觸牙髓后直接發(fā)揮誘導(dǎo)作用。因此，DPP誘導(dǎo)修復(fù)性牙本質(zhì)形成的作用可能是多方面的，其確切機(jī)制目前尚待進(jìn)一步探討。本研究將有助于我們深入了解和認(rèn)識(shí)DPP在牙本質(zhì)乃至整個(gè)牙齒生長(zhǎng)發(fā)育過程中的作用，以及在預(yù)防、治療齲病和牙髓病，尤其是在活髓保存方面的意義。北京市自然科學(xué)基金資助課題作者單位：100050首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔

18、醫(yī)院（歐陽勇現(xiàn)在中山醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，510060）參考文獻(xiàn)1Linde A, Lussi A, Crenshaw MA. Mineral induction by immobilized polyanionic proteins. Calcif Tissue Int, 1989,44:286-295.2Lussi A, Crenshaw MA, Linde A. Induction and inhibition of hydroxyapatite formation by rat dentine phosphoprotein in vitro. Arch Oral Biol, 1988,3

19、3:685-691.3Lee SL, Veis A ,Glonek T. Dentin phosphoprotein: an extracellular Calcium-binding protein. Biochemistry, 1977,16:2971-2979.4吳海珍. 牙本質(zhì)橋的研究概況. 國(guó)外醫(yī)學(xué)口腔醫(yī)學(xué)分冊(cè), 1991,18:86-90.5Linde A. Dentin matrix proteins: composition and possible function in calcification. Anat Rec, 1989,224:154-166.6Robey PG. Vertebrate mineralized matrix proteins: structure and function. Connect Tissue Res,1