人原代晶體上皮細(xì)胞bFGF多肽和mRNA的表達(dá)

1、    人原代晶體上皮細(xì)胞bFGF多肽和 mRNA的表達(dá)        【摘要】目的為研究后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生機理，檢測生長中人晶體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells,HLECs)自身是否表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)。方法體外培養(yǎng)人晶體上皮細(xì)胞，用免疫細(xì)胞化學(xué)和原位核酸分子雜交的方法，檢測HLECs中bFGF多肽和其mRNA的表達(dá)。結(jié)果用免疫細(xì)胞化學(xué)和原位核酸分子雜交

2、方法，可檢測到生長中的人晶體上皮細(xì)胞自身表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長因子。結(jié)論結(jié)合堿性成纖維細(xì)胞生長因子促進(jìn)人晶體上皮細(xì)胞生長的作用，推測人晶體上皮細(xì)胞自身表達(dá)的bFGF，參與促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞生長增殖過程?！娟P(guān)鍵詞】晶體白內(nèi)障上皮細(xì)胞生長因子Expression of bFGF in primary human lens epithelial cellsLiu Dongling,Wu Jingan. Department of Ophthalmology,First Hospital,Beijing Medical University,Beijing 100034【Abstract】Objecti

3、veTo study the mechanism of after cataract formation and investigate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) in primary human lens epithelial cells(PHLECs). MethodsHuman lens epithelial cells were cultured in vitro, and the expression of bFGF was detected with immunohistochemistry and

4、 in situ hybridization.ResultsPHLECs express bFGF in protein and mRNA levels.ConclusionBased on bFGF promoting PHLEC growth and differentiation,the results suggest that bFGF from PHLECs take part in promoting such cell growth and differentiation. 【Key words】LensCataractEpithelial cellsGrowth factor后

5、發(fā)性白內(nèi)障(簡稱后發(fā)障)因其高發(fā)生率和明顯影響白內(nèi)障囊外摘除術(shù)的術(shù)后效果，已引起眼科學(xué)界廣泛關(guān)注。后發(fā)障形成的主要原因，是晶體囊袋內(nèi)殘留上皮細(xì)胞生長、增殖、遷移和纖維分化，在后囊表面形成混濁薄膜。細(xì)胞生長增殖與多種因素有關(guān)，成纖維細(xì)胞生長因子在多種因素中起著重要作用。自70年代從牛腦垂體中分離純化出堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，以后又在同樣組織中分離純化了酸性成纖維細(xì)胞生長因子。此后，有學(xué)者確認(rèn)了人房水中有bFGF的存在1；bFGF對人晶體上皮細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖和分化的作用2；人白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞內(nèi)有bFGF及其受體3；在后

6、發(fā)障形成中，晶體上皮細(xì)胞自身是否表達(dá)bFGF，對研究和預(yù)防后發(fā)障的形成有很重要意義。資料和方法一、人晶體上皮細(xì)胞的培養(yǎng)1.取材：眼球取自出生后至2歲死者15例(30只眼)，于死后12小時內(nèi)無菌取材，0.25%氯霉素紗布包裹，置冰壺內(nèi)送回實驗室。2.操作方法：將眼球浸泡于75%酒精30秒鐘后，用生理鹽水洗6次，移至超凈工作臺內(nèi)；自角膜緣后2 mm處環(huán)行剪開鞏膜，分離去除玻璃體、角膜及虹膜。以D-Hanks液洗一次；在解剖顯微鏡下剪除晶體周圍懸韌帶，自晶體赤道后約1 mm環(huán)行剪開后囊膜，將前囊膜等分為四部分，揭下附著上皮細(xì)胞的前囊膜，接種于25 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)預(yù)置的蓋玻片上，置于37、5%CO2培養(yǎng)

7、箱中，待組織塊貼壁4小時后，加入含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液2.5 ml，繼續(xù)培養(yǎng)1周后，換液一次，以后每3天換液一次。二、人原代晶體上皮細(xì)胞內(nèi)bFGF多肽的檢測1.試劑：第一抗體為兔抗人bFGF特異性多克隆抗體，美國Sanata Cruz Biotechnology 公司產(chǎn)品。第二抗體為生物素化羊抗兔IgG，特異復(fù)合物為辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，以及DAB等其它試劑均購自北京中山生物制品公司。2.操作方法：采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法。取出原代培養(yǎng)匯合60%70%的細(xì)胞爬片，D-Hanks液洗3次，依次經(jīng)過10%中性福馬林液固定30分鐘，分別以3%H2O2 30分鐘、110正常羊血清40分鐘

8、封閉內(nèi)源性過氧化物酶；第一抗體(1100)結(jié)合，置濕盒內(nèi)4過夜，第二抗體結(jié)合30分鐘，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素結(jié)合30分鐘；新鮮配制DAB顯色液，顯色510分鐘，每一步驟間以0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3分鐘。蘇木素(pH 8.0)復(fù)染5分鐘，自來水沖洗3分鐘，脫水，透明，封片。3.對照組設(shè)置：陰性對照組分別以PBS代替第一抗體、第二抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，陽性對照為人血管平滑肌細(xì)胞爬片。4.生物顯微鏡觀察：陽性信號表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)黃色、淡黃色點網(wǎng)狀著色。三、人原代晶體上皮細(xì)胞內(nèi)bFGF的mRNA檢測1.試劑：人bFGF的mRNA全長cDNA序列探針由軍事醫(yī)

9、學(xué)科學(xué)院提供。地高辛-DNA標(biāo)記及檢測試劑盒為德國 Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品。其它試劑嚴(yán)格按照RNA原位雜交要求配制，包括焦磷酸二乙酯(DEPC)水，0.3% Triton X-100，蛋白酶K，PBS，標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽-氯化鈉液(SSC)，硫酸葡聚糖，緩沖液，預(yù)雜交液(內(nèi)含50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、Denhart液、12 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl、30 mmol/L NaCl、0.5 mg/ml酵母tRNA)，0.2 mol/L HCl，RNA酶(RNase)等。2.操作方法：將cDNA探針標(biāo)記后，-20保存?zhèn)溆?。取原代培養(yǎng)匯合60

10、%70%的細(xì)胞爬片，經(jīng)4%多聚甲醛固定1015分鐘，0.3% Triton X-100洗片5分鐘，0.2mol/L HCl酸化5分鐘，蛋白酶K消化37，5分鐘，每步驟間用PBS洗3次。梯度酒精脫水，預(yù)雜交37，1小時；以1.5 ng/l探針濃度的雜交液滴于細(xì)胞爬片，43雜交17小時，順序以2×、1×、0.5×SSC洗片，120正常羊血清封閉20分鐘，15 000抗地高辛抗體結(jié)合，37，1小時；以新鮮配制硝基藍(lán)四氮唑(NBT)與5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)顯色液滴片，室溫下避光顯色2小時，自來水沖洗，番紅復(fù)染，自然干燥。3.對照組設(shè)置：分別用PBS代替

11、bFGF的cDNA探針以及RNase預(yù)處理細(xì)胞爬片作為陰性對照。4.生物顯微鏡觀察：bFGF的cDNA探針與細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)mRNA雜交的陽性信號，表現(xiàn)為紫藍(lán)色顆粒，大部分陽性信號于胞漿內(nèi)，部分信號與胞核重疊。結(jié)果一、bFGF免疫細(xì)胞化學(xué)檢測實驗組全部染片中，晶體上皮細(xì)胞內(nèi)均可見陽性信號，染色部位位于細(xì)胞膜還是細(xì)胞漿，抑或兩部位均存在，細(xì)胞核內(nèi)是否有所表達(dá)，此次免疫細(xì)胞化學(xué)檢測尚不能確定。陰性對照片內(nèi)未見陽性信號(1，2)。1 原代培養(yǎng)人晶體上皮細(xì)胞bFGF免疫細(xì)胞化學(xué)，細(xì)胞內(nèi)可見黃色、淡黃色點網(wǎng)壯陽性信號（免疫組化染色×600）2 免疫細(xì)胞化學(xué)陰性照組，細(xì)胞內(nèi)無陽性信號，蘇木精復(fù)染（免疫

12、組化染色×400）二、bFGF的mRNA原位核酸分子雜交檢測實驗組全部細(xì)胞爬片中，可見細(xì)胞漿內(nèi)bFGF的mRNA陽性雜交信號顆粒，陰性對照片細(xì)胞內(nèi)未見陽性信號顆粒(3，4)。4 原位雜交陰性對照組，細(xì)胞內(nèi)未見陰性信號，番紅復(fù)染（原位雜交染色×400）討論細(xì)胞分子生物學(xué)已經(jīng)證實，細(xì)胞受損傷后引起的細(xì)胞增殖行為，是細(xì)胞對損傷的反應(yīng)，在這一反應(yīng)過程中有許多介質(zhì)參與，多肽生長因子在這些介質(zhì)中起著重要的作用。它們由細(xì)胞自分泌/旁分泌，或者釋放產(chǎn)生，作用于靶細(xì)胞，表現(xiàn)為強效的促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖作用。促進(jìn)晶體上皮細(xì)胞增殖的因子包括bFGF、EGF、IGF、TGF-以及IL-1等。生長因子

13、通過促使G0期和G1期細(xì)胞跨越限制點，進(jìn)入增殖狀態(tài)，其中bFGF被認(rèn)為是誘導(dǎo)這一過程的啟動因子，在時間和效應(yīng)上與其它因子連續(xù)、協(xié)同作用，使細(xì)胞完成有絲分裂。以往有關(guān)晶體上皮細(xì)胞bFGF的研究進(jìn)行了一些工作。Namiki4將家兔分成晶體超聲乳化吸出術(shù)組和聯(lián)合人工晶體植入術(shù)組，手術(shù)前后用ELISA方法檢測房水中bFGF含量變化，結(jié)果兩組間無差異。人工晶體植入組房水bFGF含量，術(shù)前在10 pg/ml以下，術(shù)后第1天增至300±280 pg/ml，術(shù)后1周達(dá)高峰，為450 pg/ml，術(shù)后8周仍維持在100200 pg/ml。Sculz等5用Northern blot法檢測到牛晶體上皮細(xì)胞

14、中有bFGF的表達(dá)。Lovicu等6用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測到大鼠的新生鼠、乳鼠及成年鼠晶體前囊膜內(nèi)存在bFGF。McAvoy等7向大鼠晶體上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度bFGF，呈現(xiàn)不同的作用，最大半數(shù)有效量在150 pg/ml、30 ng/ml和40 ng/ml時，分別起促增殖、促遷移和促分化作用。曾有報道培養(yǎng)人晶體上皮細(xì)胞，用ELISA法動態(tài)檢測培養(yǎng)液中bFGF含量變化，結(jié)果培養(yǎng)1天為470 pg/ml，2天為310 pg/ml，1周為269 pg/ml。Nishi等8培養(yǎng)人晶體上皮細(xì)胞，加入bFGF后，用H3-TdR摻入法計數(shù)其摻入量，結(jié)果顯示H3-TdR的摻入量在實驗組明顯高于對照組，

15、表明bFGF對晶體上皮細(xì)胞起促進(jìn)增殖的作用。 Reddy等2以含10 ng/ml bFGF的培養(yǎng)液培養(yǎng)人晶體上皮細(xì)胞，觀察對上皮細(xì)胞的作用，同時還用免疫電鏡的方法觀察bFGF受體數(shù)目的變化，結(jié)果顯示bFGF受體數(shù)目有變化，以及bFGF對晶體上皮細(xì)胞起促進(jìn)增殖和分化作用。隨著培養(yǎng)時間的延長，bFGF受體數(shù)目減少，其促增殖作用也明顯減弱。Majima等3報道，用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到原位人白內(nèi)障晶體上皮細(xì)胞有bFGF及其受體存在?；赽FGF對晶體上皮細(xì)胞促增殖作用比較明顯，為深入探討它在人類晶體上皮細(xì)胞生長過程中有無自身bFGF表達(dá)，本實驗在多肽和mRNA水平，以免疫細(xì)胞化學(xué)和原位核酸分子雜交方法

16、，檢測原代生長中人晶體上皮細(xì)胞bFGF表達(dá)情況。免疫細(xì)胞化學(xué)的方法是根據(jù)抗原抗體特異結(jié)合的原理，利用已知抗體檢測組織細(xì)胞中特異蛋白質(zhì)的方法。SP法在免疫細(xì)胞化學(xué)方法中是一種較新的、特異性強且穩(wěn)定可靠的方法，其結(jié)果可以顯示有無被檢多肽或蛋白質(zhì)的存在。原位核酸分子雜交的方法是根據(jù)核酸分子堿基互補結(jié)合的原理，用已知核酸片段探測細(xì)胞中相應(yīng)核酸的存在。地高辛-DNA標(biāo)記檢測法，具有高度靈敏性和特異性，安全穩(wěn)定，可避免內(nèi)源性干擾。以上兩種方法結(jié)合，在蛋白(多肽)和mRNA水平檢測，可以從兩個不同角度說明靶物質(zhì)的表達(dá)與否。本實驗應(yīng)用特異性兔抗人bFGF多克隆抗體和人bFGF全長序列cDNA探針，檢測生長中人

17、晶體上皮細(xì)胞bFGF多肽及其mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示兩者均有表達(dá)。與1997年較新報道9用RT-PCR法所做的結(jié)果相吻合。根據(jù)其他研究者的報告和本實驗結(jié)果，我們認(rèn)為在人晶體上皮細(xì)胞生長過程中，其自身仍表達(dá)堿性成纖維細(xì)胞生長因子，后者亦參與啟動晶體上皮細(xì)胞生長、增殖及分化。如進(jìn)一步實驗，可以從抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子的表達(dá)，對晶體上皮細(xì)胞增殖的影響中觀察到相應(yīng)的結(jié)果。參考文獻(xiàn)1Tripathi RC,Borisuth NSC,Tripathi BJ.Detection, quantification, and significance of basic fibroblast growth fa

18、ctor in the aqueous humor of man,cat,dog and pig.Exp Eye Res,1992,54:447-454.2Reddy VN,Ibaraki N ,Lin LR.Changes of fiber differentiation in human lens epithelial cells exposed to growth factors in several subcultures.Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36(Suppl):S260.3Majima K,Kousaka M.The existence of

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