加味失笑散對家兔心肌缺血再灌注損傷保護作用機制的研究

1、加味失笑散對家兔心肌缺血再灌注損傷保護作用機制的研究                    作者：曹志然，王蓓，申文增，戎瑞雪，潘穎，張秋燕，唐志遠, 馮天鑄【摘要】  目的研究加味失笑散對心肌缺血再灌注損傷保護的作用機理。方法將日本大耳白家兔40只隨機分為5組：假手術組、模型組、加味失笑散低劑量組、加味失笑散中劑量組和加味失笑散高劑量組。采用結扎左冠狀動脈前降支的方法制備缺血和再灌注模

2、型，通過檢測缺血前、缺血30min和再灌注60min時血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和血清肌酸激酶（CK）的變化，探討加味失笑散對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制。結果缺血30min和再灌注60min 時模型組實驗動物的SOD活力較假手術組明顯降低而MDA和CK明顯增高（P<0.01），各用藥組動物血清中的SOD活力明顯高于模型組，MDA和CK活力明顯低于模型組（P<0.01），且呈明顯的劑量依賴性。結論加味失笑散對心肌缺血再灌注的損傷有保護作用，其作用機制是通過增強SOD的活力，清除自由基而減輕心肌的損傷。 【關鍵詞】  加味失笑散； 缺血再灌注； 超

3、氧化物歧化酶； 丙二醛； 血清肌酸激酶Abstract：ObjectiveTo study the protective mechanism of Jiawei Shixiaosan in isocheimmia-reperfusion injury of myocardia in rabbits.MethodsForty rabbits were divided randomly into 5groups: sham operation group, model group, low dose group of Jiawei Shixiaosan, middle dose group of

4、Jiawei Shixiaosan and high dose group. The isocheimmia and isocheimmia-reperfusion models were made by ligating the left anterior descending branch of coronary artery. SOD, MDA and Ck in serum of the experimental rabbits were detected separately before isocheimmia, after isocheimmia 30min and reperf

5、usion 60min. ResultsIn 30min after isocheimmia and 60min after reperfusion the activities of the serum SOD in the model group were decreased significantly compared with those in sham operation, and the serum MDA, CK in the model group were increased significantly compared with those in sham operatio

6、n.The activities of the serum SOD in every experimental group given Jiawei Shixiaosan were significantly higher than those in model group, and the serum MDA, CK in the experimental group given Jiawei Shixiaosan were significantly lower than those in model group. The change of the content of the seru

7、m SOD, MDA, CK were significantly associated with the dose of Jiawei Shixiaosan. ConclusionJiawei Shixiaosan has protective effect against ischemia-reperfusion injury of myocardia in rabbits through reducing the activity of SOD and removing oxyradical.Key words：Jiwei Shixiaosan;  Ischemia-reper

8、fusion;  SOD;  MDA;  CK    失笑散來源于和劑局方，由五靈脂、蒲黃二味藥組成，具有活血行痹、散結止痛的作用。近年來用此方加味各種疾病均收到良好的效果1。各地報告應用多種加味失笑散治療冠心病心絞痛均取得一定療效，但有關加味失笑散對心肌缺血再灌注損傷作用機制的研究還未見報道。本文觀察了加味失笑散對家兔心肌缺血再灌注模型血清中超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和血清肌酸激酶（CK）等指標的影響，初步探討了其對心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制，為該方用于臨床冠心病、心絞痛的治療提供實驗依據(jù)。1  材料

9、與儀器1.1  動物日本大耳白家兔40只，體重（2.5±0.2）kg，購自于河北省實驗動物中心。1.2  藥物加味失笑散由蒲黃6 g，五靈脂6 g，川芎6 g，紅花6 g，桃仁9 g，赤芍9 g，郁金9 g，冰片0.05 g組成。藥材購自保定市中藥材公司，經(jīng)專家鑒定均為真品。將上述藥物按比例組成10劑，水煎煮提取3次，提取液合并，4層紗布過濾，濾液濃縮至適量。冰片用適量乙醇溶解，與濃縮液混合，調整濃度為100%，即1ml相當于1g生藥。1.3  試劑與儀器SOD，CK，MDA試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，Bradford蛋白質定量試劑盒購自TIAN

10、GEN BIOTECH(BEIJING )，紫外分光光度計，TU1901(上海棱普儀器儀表有限公司)；電熱恒溫水浴箱，SSW-420-2S（上海博迅實業(yè)有限公司）；組織勻漿器，PRO200（美國）。2  方法2.2  心肌缺血再灌注損傷模型的制備實驗動物用1%的戊巴比妥鈉（3.5 ml/kg）耳緣靜脈注射麻醉，仰位固定，常規(guī)記錄肢體導聯(lián)，分離右側頸動脈并插管用于取血。沿胸骨左緣剪斷23肋軟骨，用乳突牽開器撐開切口，并保持胸膜完整。剪開心包，用止血鉗提起左心耳，用小彎針在冠狀動脈左前降支根部穿一0號絲線，放置1 cm長、直徑為1 mm的硅膠管并結扎，根據(jù)心電圖檢測S-T段的抬

11、高，作為心肌缺血模型建立的標準。假手術組只穿線不結扎，余操作同造模組。觀察30 min后，剪斷結扎線，開始心肌再灌注，觀察60 min。2.3  血清中SOD，CK，MDA的檢測在缺血前、缺血30 min和再灌注60 min分別從頸總動脈取血1.5 ml，分離血清，按試劑盒說明檢測血清中的SOD、CK活性和MDA含量。2.4   統(tǒng)計學處理應用SPSS統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學數(shù)據(jù)分析，結果以±s表示，主要統(tǒng)計學方法采用方差分析后進行兩兩比較（LSD法）。1         3&#

12、160; 結果3.1  加味失笑散對實驗動物血清中SOD活力的影響結果見表1。表1  加味失笑散對實驗動物血清中SOD活力的影響（略）    結果表明，缺血前各組實驗動物血清SOD活力沒有顯著性差異（P>0.05）,缺血30 min時，模型組和各用藥組動物血清中的SOD活力均較假手術組降低（P<0.01），但各用藥組實驗動物血清SOD活力明顯高于模型組（P<0.01）；再灌注60 min時各組實驗動物血清SOD活力與再灌注前比較均明顯下降（P<0.05），說明缺血再灌注進一步降低了SOD活力，而各用藥組實驗動物血清SOD

13、活力明顯高于模型組，且有劑量依賴性，表明加味失笑散能改善心肌缺血導致的SOD活力的降低。3.2  加味失笑散對實驗動物血清中MDA的影響結果見表2。表2  加味失笑散對實驗動物血清中MDA的影響（略）    結果表明,缺血前各實驗組動物血清MDA沒有顯著性差異（P>0.05），缺血30 min和再灌注60 min時模型組的MDA均顯著高于假手術組，而各用藥組血清MDA值均顯著下降（P<0.01）。3.3  加味失笑散對實驗動物血清中CK活力的影響結果見表3。表2  加味失笑散對實驗動物血清中CK活力的影響（略）&

14、#160;  結果表明，缺血前各組實驗動物血清CK活力無顯著性差異（P>0.05），缺血30 min和再灌注60 min時模型組的CK活力均顯著高于假手術組，而各用藥組動物血清CK活力值均顯著下降（P<0.01）。4  討論    冠心病屬于中醫(yī)學的“胸痹”，臨床大多數(shù)屬于氣虛血瘀型。失笑散是歷代活血化瘀的代表方劑，由蒲黃和五靈脂組成。本實驗所用的加味失笑散由蒲黃，五靈脂，川芎，紅花，桃仁，赤芍，郁金，冰片組成，在臨床上冠心病心絞痛療效明顯。藥理研究表明方中的蒲黃具有提高機體免疫力、抗缺氧、抗心肌缺血、抗炎止痛、降低全血粘稠度、減少

15、血小板的聚集等作用；五靈脂可擴張血管，降低血管阻力，增加冠脈血流量，并能緩解平滑肌痙攣2；桃仁、紅花、赤芍、川芎具有活血祛淤、抑制血小板和紅細胞的聚集、穩(wěn)定紅細胞膜、降低血黏度的的作用；同時紅花、赤芍也具有清除氧自由基的作用35，此為本方治療心絞痛提供了藥理依據(jù)。心肌缺血再灌注損傷的機制目前認為與心肌的能量代謝障礙、氧自由基的大量產(chǎn)生、細胞內鈣離子的超載、血管內皮細胞分泌的一系列內皮因子等因素有關。氧自由基的大量產(chǎn)生使心肌組織的脂質體(LPO)增多,心肌組織MDA的含量增加,從而引起心肌細胞膜結構的改變,心肌細胞受到損傷，導致大量CK的釋放，因此，MDA和CK是反映心肌氧自由基損傷的直接指標，

16、SOD是清除氧自由基的重要酶類，可減輕氧自由基對心肌細胞的損傷作用。本研究結果顯示,心肌缺血30 min后模型組實驗動物血清SOD活性較對照組明顯降低，MDA和CK明顯增高，再灌注60 min后SOD活性較缺血期降低更顯著，MDA和CK進一步增高，說明缺血再灌注加劇了心肌的損傷，與以前報道結果一致6。加味失笑散各劑量組SOD活性均顯著高于模型組，且有劑量依賴性,用藥組的MDA和CK水平明顯低于模型組，結果表明，加味失笑散可通過提高SOD的活性，降低氧自由基的產(chǎn)生，抑制了脂質體的氧化，從而對心肌缺血再灌注損傷起到了保護作用?！尽?#160; 1祝光禮，周凡，陳鐵龍.黃芪失笑散抗心肌缺血的實驗研究J.中華中藥學刊，2007，25（11）:2232.2章偉明，張衛(wèi)，曾佳. 中藥免疫生脈瓜萎失笑散治療冠脈內支架植