初探可能與珠蛋白表達調(diào)節(jié)相關(guān)的兩個新基因

1、初探可能與珠蛋白表達調(diào)節(jié)相關(guān)的兩個新基因    1.引言人-珠蛋白基因簇位于第11 號染色體上，由、G、A、 和 五個功能基因按照發(fā)育階段順序依次排列組成，基因的表達限制在紅細胞鏈系內(nèi)并且由發(fā)育程序精確控制。在人的正常個體發(fā)育過程中，紅細胞中珠蛋白的表達存在著明顯的發(fā)育階段特異性，存在著胚胎型（）到胎兒型（）、胎兒型（）到成人型（）兩個開關(guān)過程。鐮刀形細胞貧血癥（SCD）及重型-地中海貧血是兩種最為常見的單基因遺傳病，在包括中國在內(nèi)的世界范圍有著很高的發(fā)病率。該病是由于-珠蛋白基因缺失或突變使蛋白合成受阻或結(jié)構(gòu)異常而引起的慢性溶血性貧血。已有證據(jù)表明，如

2、果在成人期已經(jīng)關(guān)閉的-珠蛋白基因能夠重新活化，表達的-珠蛋白能夠代償-地中海貧血患者中-珠蛋白的不足，貧血癥狀會明顯改善。目前用藥物活化成人-珠蛋白基因表達的方法已被廣泛研究，但僅對部分病例有效，而且有較多負作用，長期治療效果差。因此尋找內(nèi)在的-珠蛋白基因活化因子并運用于臨床成為研究熱點。如果-珠蛋白基因特異活化子能被確定，則可能為發(fā)展通過轉(zhuǎn)移-珠蛋白活化因子基因重新活化成人紅細胞中-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，治療鐮刀形細胞貧血癥和重型-地中海貧血癥的新方法奠定基礎(chǔ)。人-珠蛋白基因作為最早克隆的基因之一，人們對于-珠蛋白基因簇的珠蛋白基因的啟動子、增強子及位于基因簇上游的位點控制區(qū)（LCR）等順式調(diào)控

3、元件已經(jīng)研究得相對清楚。關(guān)于-珠蛋白基因在胎兒期被競爭性關(guān)閉，而 -珠蛋白基因則在成人期自主沉默的機制也已被廣泛接受。特異活化 -珠蛋白基因的重要反式作用因子如EKLF 也已經(jīng)確認，并有進一步實驗表明其存在轉(zhuǎn)錄后修飾和從胞質(zhì)到胞核的定位轉(zhuǎn)移是其參與激活 -珠蛋白的關(guān)鍵。關(guān)于特異活化 -珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活化因子，陸續(xù)報告了NF-E4、FKLF、FKLF2、NF-Y、SAR等潛在的活化子，研究結(jié)果顯示其過量表達可顯著提高紅細胞中-珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄水平，但對于其在正常個體發(fā)育過程中對 -珠蛋白基因的活化作用以及作用的特異性仍不能確定。也有很多參與成人紅細胞中-珠蛋白沉默的因子被確定，如DRED復(fù)合物

4、，研究證明其可與 -及 -珠蛋白啟動子區(qū)結(jié)合，參與 -及 -珠蛋白在成人期的沉默。NF-E4的異構(gòu)體可通過使轉(zhuǎn)錄激活因子CP2與-珠蛋白啟動子區(qū)的脫離參與-珠蛋白成人期沉默。另一方面，人們發(fā)現(xiàn)各珠蛋白啟動子區(qū)的甲基化水平和組蛋白乙酰化水平均存在明顯的發(fā)育階段特異性，說明表觀遺傳學修飾在珠蛋白開關(guān)中也具有重要作用。盡管多年來的研究取得了很大進展，但由于珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律遠比人們所認識的復(fù)雜，至今尚未能完全闡明其調(diào)控機制。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合癥（HPFH）是一種在成人階段胎兒血紅蛋白（HbF）持續(xù)高表達的遺傳病，通常是由于-珠蛋白基因簇內(nèi)序列的缺失或-珠蛋白基因啟動子突變所引起，而本

5、組此前鑒定到一個HPFH 家系，其中兩個成員均為HPFH 患者，通過Southern雜交及DNA 序列分析均未發(fā)現(xiàn)上述改變。據(jù)此推測，此家系成員HbF 與F 細胞水平升高很可能涉及到-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的變化。而人臍帶血中主要是胎兒血紅蛋白的高表達，其中也很可能存在-珠蛋白基因活化因子的高表達，因此我們通過差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR（DDRT-PCR）方法比較了此家系成員的骨髓同正常成人骨髓紅細胞及人臍帶血來源的紅細胞間的基因表達情況，鑒別得到了大量在人臍帶血或HPFH 患者骨髓中表達高于正常成人骨髓的基因。K562 細胞是一種白血病細胞系，能夠在hemin 的誘導下向紅系分化，主要表達-珠蛋白

6、基因簇中的-、-珠蛋白，基本檢測不到-珠蛋白的表達，可以作為研究-、-珠蛋白調(diào)節(jié)機制的很好細胞模型。而小鼠的紅白血病細胞系MEL585 則主要表達-珠蛋白基因，且可向誘導向紅系分化。在這里，我們著重研究了在臍帶血紅細胞內(nèi)表達水平較高的ZF 基因和在HPFH 成員的骨髓紅細胞中表達較高的SH3GLB1 基因的差異表達情況，以及其在細胞內(nèi)的定位情況，并在人紅白血病細胞系K562 細胞以及小鼠紅白血病細胞系MEL585 中初步研究了其對于珠蛋白的調(diào)節(jié)作用。初步確定了ZF 對于人-珠蛋白啟動子的活化作用和對于小鼠-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用，以及SH3GLB1 對于小鼠-珠蛋白基因轉(zhuǎn)錄的促進作用。2.材

7、料及方法2.3 脂質(zhì)體介導的真核細胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細胞株的篩選轉(zhuǎn)染前一天，以適當密度傳代細胞，使細胞在轉(zhuǎn)染時處于對數(shù)生長期。將0.81.2g 質(zhì)量良好的質(zhì)粒DNA 加入50l 無血清培養(yǎng)基中混勻，然后將2l 脂質(zhì)體2000（Invitrogen）也加入50l 無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5min。將DNA 和質(zhì)?；旌虾?，室溫靜置20min。將混合物直接加入24 孔板的細胞中，輕輕搖晃使其混勻，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2448h。如要構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株，按照體積比1:101:20 的比例用新鮮完全培養(yǎng)基稀釋轉(zhuǎn)染細胞，轉(zhuǎn)移至10cm 培養(yǎng)皿，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)兩天后，加入終濃度為500 g/ml 的G418（ME

8、L585 細胞），繼續(xù)培養(yǎng)。約715d 后，光鏡下可觀察到有細胞克隆出現(xiàn)，在顯微鏡下挑取細胞克隆于96孔的細胞培養(yǎng)板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至一定數(shù)量，進行擴大培養(yǎng)。2.4 雙熒光報告基因檢測在轉(zhuǎn)染后2448h 檢測熒光素酶活性，使用威格拉斯的雙報告基因系統(tǒng)進行檢測。即首先將5x 的細胞裂解液稀釋至1x，細胞用PBS 漂洗一次，24 孔板每孔加入100l 的細胞裂解液，晃動數(shù)次使混勻，并將細胞及所有液體移至離心管中，置于冰上。漩渦震蕩510s，然后離心15s2min 鐘，轉(zhuǎn)移上清。在熒光光度計測量管中每管加入100 l 檢測液和20l細胞裂解液，進行讀數(shù)。再加入100l stop&Glo

9、 溶液進行第二次讀數(shù)。3.結(jié)果及討論3.1 ZF 和SH3GLB1 基因差異表達的驗證DDRT-PCR 顯示ZF 基因在臍帶血紅細胞（CB）中的表達高于正常成人骨髓（NB）及HPFH患者骨髓（PB）紅細胞（如圖1A）。同樣分別以3 種誘導培養(yǎng)獲得的紅細胞cDNA 為模板進行Real-time PCR 擴增，根據(jù)得到的標準曲線方程，計算得出在誘導培養(yǎng)的臍帶血紅細胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓紅細胞中ZF 的表達水平，之后使用同時擴增的內(nèi)參照GAPDH進行歸一化，再進行比較。ZF 的表達水平如圖1B 所示，結(jié)果顯示其在誘導培養(yǎng)的臍帶血紅細胞內(nèi)的表達水平為正常成人骨髓紅細胞內(nèi)的3.8 倍，另外

10、為HPFH 患者骨髓紅細胞內(nèi)的8.34 倍。與DDRT-PCR 結(jié)果基本一致，說明其可能參與胎兒珠蛋白表達的活化。DDRT-PCR 顯示SH3GLB1 基因在HPFH 患者骨髓（PB）紅細胞中的表達高于臍帶血紅細胞（CB）中的以及正常成人骨髓（NB） （如圖1C）。以3 種誘導培養(yǎng)獲得的紅細胞cDNA 為模板進行real-time PCR 擴增，根據(jù)標準曲線方程，計算得出在誘導的臍帶血紅細胞、正常成人骨髓及HPFH 患者骨髓紅細胞中SH3GLB1 的表達水平，以同時擴增的相應(yīng)內(nèi)參照GAPDH進行歸一化后再比較。SH3GLB1 在不同來源紅細胞內(nèi)的表達水平如圖1D 所示，結(jié)果顯示其在誘導的HPF

11、H 患者骨髓紅細胞內(nèi)的表達水平為人臍帶血紅細胞內(nèi)的2 倍，為正常成人骨髓紅細胞內(nèi)的1.6 倍。與DDRT-PCR 結(jié)果基本一致，說明其可能與HPFH 患者骨髓紅細胞中胎兒珠蛋白高相關(guān)。3.2 ZF 和SH3GLB1 真核表達載體構(gòu)建及亞細胞定位分別使用構(gòu)建好的含ZF和SH3GLB1的pEGFP-N1 載體，轉(zhuǎn)染小鼠成纖維細胞NIH3T3，表達ZF 和SH3GLB1 與EGFP 的融合蛋白。轉(zhuǎn)染48h 后置熒光顯微鏡下觀察，ZF 和SH3GLB1基因產(chǎn)物均定位于細胞核內(nèi)，而對照pEGFP-N1 質(zhì)粒在所轉(zhuǎn)染NIH3T3 細胞內(nèi)在胞核與胞質(zhì)中均有分布。這些提示這兩個基因可能在細胞核中行使功能，可能

12、參與DNA 復(fù)制及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。3.3 ZF 和SH3GLB1 對人-珠蛋白基因啟動子的調(diào)節(jié)作用為了實驗這兩個基因?qū)τ谌?珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用，我們用人-珠蛋白啟動子啟動的螢火蟲熒光素酶載體（Luci）與這兩個基因的真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染K562 細胞。以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，雙報告基因檢測系統(tǒng)檢測螢火蟲熒光素酶的相對活性。結(jié)果如圖3 所示，ZF+Luci 組熒光素酶的相對活性較對照組Luci 以及Luci+pc3.1 有明顯升高，提高大約1倍，而SH3GBL1+Luci 組熒光素酶的相對活性較對照組Luci 以及Luci+pc3.1 無明顯改變。初步說明ZF 對于人-珠蛋白基因啟動子具有一定的促進作

13、用。其對K562 細胞內(nèi)源的-珠蛋白基因的促進作用還需進一步證明。3.4 ZF 和SH3GLB1 MEL585 穩(wěn)定表達株的建立與鑒定為了進一步實驗這兩個基因?qū)τ?珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用，我們用構(gòu)建得到的以pcDNA3.1 為載體并分別插入了ZF 和SH3GLB1 基因的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠紅白血病細胞系MEL585，經(jīng)G418 篩選得到了穩(wěn)定過表達ZF 和SH3GLB1 的細胞株。RT-PCR 檢測了兩個基因的過表達情況，結(jié)果在MEL/ZF 細胞株中ZF mRNA 水平較高，而在作為陰性對照的MEL585 轉(zhuǎn)染空載體的細胞MEL/pc3.1 內(nèi)未檢測到ZF 表達。在MEL/SH3GLB1細胞株

14、中檢測到SH3GLB1 mRNA較高水平表達，在陰性對照MEL/pc3.1 細胞內(nèi)低水平表達，說明小鼠細胞內(nèi)存在與其同源的基因序列。以上結(jié)果均顯示兩個基因在各自的穩(wěn)定細胞株中過表達成功，可用于下一步的功能分析。3.5 ZF 和SH3GLB1 過表達對于小鼠珠蛋白基因的調(diào)節(jié)作用用DMSO 誘導ZF 和SH3GLB1 MEL585 穩(wěn)定表達細胞株向紅系分化后，檢測小鼠-珠蛋白以及-珠蛋白基因的表達。結(jié)果說明ZF 基因過量表達使得小鼠-珠蛋白基因的表達明顯下調(diào)，僅為轉(zhuǎn)入空載體的陰性對照內(nèi)的表達水平的50%，而SH3GLB1 基因的過量表達則使小鼠-珠蛋白基因的表達明顯升高，約為對照組的3 倍。而這兩個基因過量表達對于小鼠-珠蛋白基因的表達水平影響均不明顯，說明了ZF 和SH3GLB1 對于小鼠-珠蛋白基因表達的影響具有一定特異性。SH3GLB1 過表達細胞株內(nèi)-珠蛋白基因表達較對照細胞有明顯提高，而-珠蛋白基因表達水平無明顯區(qū)別。ZF 過表達細胞株內(nèi)-珠蛋白基因表達較對照細胞有明顯降低，-珠蛋白基因表達水平無明顯區(qū)別。4. 結(jié)論本文鑒別了兩個在人臍帶血、正常成人骨髓和異細胞型HPFH 患者骨髓中差異表達的基因，ZF 和SH3GLB1。在K5