農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立_圖文

1、收稿日期:2007-04-30基金項(xiàng)目:“948”資助項(xiàng)目(2003-3Q 作者簡(jiǎn)介:王昌濤(1975-,男,山東菏澤人,講師,博士,主要從事生物工程方面的研究通訊作者:張世煌(1948-,男,北京人,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事玉米遺傳育種工作。農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立王昌濤1,趙玉錦2,李坤遠(yuǎn)1,張世煌2(1.北京工商大學(xué),北京100037;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)所玉米研究中心,北京100081摘要:本研究借鑒經(jīng)典農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,成功地建立了一個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系。轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)PCR ,PCR 2S outhern ,RT 2PCR 分子檢測(cè),結(jié)果表明外源

2、目的基因已被插入玉米染色體基因組中,并在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。采用此方法可省去組織培養(yǎng)過程,取材方便,可操作性強(qiáng)。關(guān)鍵詞:農(nóng)桿菌;玉米;萌動(dòng)胚;遺傳轉(zhuǎn)化中圖分類號(hào):S513.01文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1000-7091(200705-0110-04The Establishment of a N e w G enetic Transformation System by Agrobacterium tumefaciens 2mediated in G erminating Embryo of MaizeWANG Chang 2tao 1,ZHAO Y u 2jin 2,LI K un 2yuan

3、 1,ZHANG Shi 2huang 2(1.Beijing T echnology and Business University ,Beijing 100037,China ;2.C AAS ,The Institute of Crop Sciences ,Maize Research Center ,Beijing 100081,China Abstract :A new genetic trans formation system by Agrobacterium tumef aciens 2mediated in germinating embry o of maize was e

4、stablished.The result showed that integration of foreign gene into the genome of transgenic maize plants was con firmed by PCR ,PCR 2S outhern and RT 2PCR analysis.The foreign gene was expressed at transcription level.According to this method ,the procedure of plant tissue culture was av oided and t

5、he germinating embry o of maize was obtained conve 2niently.It will provide an efficient way for genetic trans formation of maize.K ey w ords :Agrobacterium tumef aciens ;Maize ;G erminating embry o ;G enetic trans formation玉米是重要的糧食作物之一,在糧食生產(chǎn)中占有極為重要的地位1。為了提高玉米的產(chǎn)量和改善玉米的品質(zhì),國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)把外源基因轉(zhuǎn)入玉米中。農(nóng)桿菌

6、介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法具有能夠轉(zhuǎn)移較大片段的DNA ,外源基因重排少且多以單或寡拷貝的形式整合等優(yōu)點(diǎn),因此農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化是比較理想的方法2。選擇和建立良好的植物受體系統(tǒng)是基因轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵因素之一。迄今已建立了多種有效的受體系統(tǒng)(如原生質(zhì)體,愈傷組織等,但是受體系統(tǒng)的建立要經(jīng)過繁瑣的植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)過程3,4。為了尋求更加快捷方便的轉(zhuǎn)化方法,本研究借鑒經(jīng)典農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法,以玉米萌動(dòng)成熟胚為轉(zhuǎn)化受體,成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚遺傳轉(zhuǎn)化體系,獲得了轉(zhuǎn)基因植株。經(jīng)分子檢測(cè)證明外源基因已整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因玉米基因組中,而且在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。應(yīng)用該轉(zhuǎn)化體系,可以省去大量繁瑣的組織培養(yǎng)過程,且取

7、材方便不受時(shí)間的限制,可操作性強(qiáng)?，F(xiàn)將本試驗(yàn)方法介紹如下。1材料和方法1.1菌株和質(zhì)粒根癌農(nóng)桿菌為C58C1和LBA4404,所用的植物表達(dá)載體為pC AM BI A 21300。選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾鼗虿⑶規(guī)в心康耐庠椿蚱巍?.2試驗(yàn)材料本試驗(yàn)所用材料玉米自交系R18紅系四川農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。1.3萌動(dòng)胚制備玉米種子用70%酒精浸泡10min ,0.1% 升汞消華北農(nóng)學(xué)報(bào)2007,22(5:1102113毒10min,無菌水沖洗35次,在超凈臺(tái)里用解剖刀在玉米胚上小心的劃開約13mm的口子,然后將種子浸泡在無菌水中,置于37水浴中約45 h,備用。1.4農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚轉(zhuǎn)化從平板中挑取單

8、菌落C58C1或LBA4404(攜帶質(zhì)粒pC AM BI A21300接種到5m L YE B液體培養(yǎng)基中,28,220r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,離心后重懸菌體。重懸菌體按150的比例加入新的YE B 液體培養(yǎng)基。把準(zhǔn)備好的玉米萌動(dòng)胚放入YE B液體培養(yǎng)基中,28,220r/min繼續(xù)振蕩24h,然后把種子放在MS固體培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3d,再轉(zhuǎn)入帶有潮霉素的篩選培養(yǎng)基710d,經(jīng)過篩選后的幼苗移栽到溫室中。1.5轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)2結(jié)果與分析2.1影響農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚的因素為了提高農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚的轉(zhuǎn)化率,我們對(duì)轉(zhuǎn)化過程中潮霉素篩選濃度,不同菌株和乙酰丁香酮(AS對(duì)轉(zhuǎn)化的影響,浸

9、染時(shí)間和劃胚深度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響等幾個(gè)因素分別進(jìn)行了研究。從表1可以看出,當(dāng)潮霉素濃度為75mg/L時(shí),基本上玉米種子都喪失了發(fā)芽能力,由于劃胚的深度和其他因素的影響,對(duì)照的種子發(fā)芽率也大大下降,綜合考慮各種因素,我們選擇了50mg/L作為抗性篩選濃度,這樣既可避免假陽性植株的再生,又可使抗性植株正常發(fā)育生長(zhǎng)。表1培養(yǎng)基中不同濃度潮霉素對(duì)玉米種子發(fā)芽率的影響T ab.1The influence of hygromycin concentration ongermination rate of m aize seeds潮霉素濃度/(mg/LHygromycin concentration025*種

10、子發(fā)芽率/%G ermination rate7823100試驗(yàn)結(jié)果表明,在相同試驗(yàn)條件下菌株C58C1與LBA4404相比具有更強(qiáng)的浸染(表2。在菌液和共培養(yǎng)基中加入AS,可以提高轉(zhuǎn)化率得到更多的抗性植株(表3。表2不同菌株對(duì)玉米轉(zhuǎn)化率的影響T ab.2 The influence of different Agrobacterium tumefaciensstrain on m aize transform ation rate菌株Agrobacterium tume faciens strainC58C1LBA4404每千粒種子獲得抗性苗數(shù)Resistant plants getting

11、 from onethousand seeds2419表3乙酰丁香酮(AS對(duì)玉米轉(zhuǎn)化率的影響T ab.3The influence of AS on m aize transform ationrate during infecting and co2cultivation菌株Agrobacterium tume faciens strainC58C1加入AS不加AS每千粒種子獲得抗性苗數(shù)Resistant plants gettingfrom one thousand seeds2811從表4可以看出浸染時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化率的一個(gè)重要因素。浸染時(shí)間過長(zhǎng)過短都不利于萌動(dòng)胚的轉(zhuǎn)化,浸染24h轉(zhuǎn)化率最

12、高。在試驗(yàn)操作中我們發(fā)現(xiàn)劃胚不能太深,否則將影響轉(zhuǎn)化效果。2.2轉(zhuǎn)基因植株T0的分子檢測(cè)萌動(dòng)胚在抗性篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)710d后,移栽到花盆置溫室中,幼苗成活后提取DNA和RNA進(jìn)5期王昌濤等:農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米萌動(dòng)胚遺傳轉(zhuǎn)化新體系的建立111行分子檢測(cè)。本研究共轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚4000個(gè),獲得抗性植株91株,移栽后成活58株,經(jīng)PCR 檢測(cè)獲得11株陽性植株,現(xiàn)有6株陽性植株已經(jīng)結(jié)實(shí)。表4浸染時(shí)間對(duì)玉米轉(zhuǎn)化率的影響T ab.4The influence of infecting time on transform ationrate of m aize seeds浸染時(shí)間/h In fecting

13、time612182430每千粒種子獲得抗性苗Resistant plants getting from one thousand seeds9142029 21圖1劃胚 Fig.1Cut embryo圖2在篩選培養(yǎng)基上的成熟胚Fig.2 Embryo on selection medium圖3轉(zhuǎn)基因植株的PCR 檢測(cè)Fig.3Identification by PCR of transgenic plants圖4轉(zhuǎn)基因植株的PCR 2Southern 檢測(cè)Fig.4Identification by PCR 2Southern of transgenic plants通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T 0的

14、分子生物學(xué)檢測(cè),證明外源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到T 0植株中,RT 2PCR 檢測(cè)結(jié)果表明外源基因在RNA 水平上也有表達(dá)。圖5轉(zhuǎn)基因植株的RT 2PCR 檢測(cè)Fig.5Identification by RT 2PCR of transgenic plants3討論轉(zhuǎn)化體種胚是一幼小植物雛形,具有天然的形態(tài)建成能力。吸水種子胚內(nèi)的酶活動(dòng)加強(qiáng),呼吸作用驟然上升,糖類,蛋白質(zhì)以及核酸的合成和轉(zhuǎn)變也迅速的進(jìn)行。此時(shí)萌動(dòng)種胚對(duì)外界因子的作用十分敏感,胚性細(xì)胞開始處于分裂狀態(tài),子葉對(duì)胚芽的包裹不再嚴(yán)密。此時(shí)利用高活力的農(nóng)桿菌浸染萌動(dòng)胚進(jìn)而與之共培養(yǎng)7,8,將有利于對(duì)種胚生長(zhǎng)點(diǎn)的轉(zhuǎn)化。萌動(dòng)種胚的微傷處理有利于農(nóng)桿

15、菌附著和進(jìn)入宿主細(xì)胞。乙酰丁香酮(AS 可誘導(dǎo)TI 質(zhì)粒VIR 區(qū)基因活化。總之,高的轉(zhuǎn)化率得益于農(nóng)桿菌生物轉(zhuǎn)化,AS 的誘導(dǎo)及萌動(dòng)胚感受態(tài)這三者綜合作用的結(jié)果。本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化玉米萌動(dòng)胚,獲得了轉(zhuǎn)基因植株,并在轉(zhuǎn)錄水平上表達(dá)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化是較為普遍的方法,但是受體系統(tǒng)的建立要經(jīng)過繁瑣的植物細(xì)胞及組織培養(yǎng)過程且耗時(shí)費(fèi)工。利用萌動(dòng)胚作為轉(zhuǎn)化的受體,可以很快得到轉(zhuǎn)基因植株,試驗(yàn)操作相對(duì)簡(jiǎn)單,對(duì)試驗(yàn)條件要求不是很高,不依賴組織培養(yǎng)技術(shù),是非常方便可行的遺傳轉(zhuǎn)化方法。本方法同其他直接轉(zhuǎn)化方法的比較也有一定的優(yōu)勢(shì),玉米遺傳轉(zhuǎn)化中基因槍法應(yīng)用比較廣泛,但是存在著拷貝數(shù)多,遺傳不穩(wěn)定等缺

16、點(diǎn),另外基因槍轉(zhuǎn)化法價(jià)格較貴。其他花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、胚囊、子房注射法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化在玉米遺傳轉(zhuǎn)化過程中也有應(yīng)用,但是這些方法轉(zhuǎn)化機(jī)理不明確,轉(zhuǎn)化效率很低,隨著農(nóng)桿菌介導(dǎo)法研究的深入和方法的逐漸成熟,采用這些方法進(jìn)行玉米遺傳轉(zhuǎn)化也逐漸減少。本轉(zhuǎn)化方法受到諸多因素的影響,AS 可以提高轉(zhuǎn)化率。浸染時(shí)間最好控制在 24h 左右,時(shí)間太短112華北農(nóng)學(xué)報(bào)22卷則使轉(zhuǎn)化效率降低,過長(zhǎng)將影響種子的萌發(fā),幼苗生長(zhǎng)弱,移栽后很難成活。劃胚的深度對(duì)轉(zhuǎn)化也有很大影響,切的過深會(huì)使胚喪失活性,而過淺則減少農(nóng)桿菌感染的機(jī)會(huì)。雖然這種轉(zhuǎn)化方法具有很多優(yōu)點(diǎn),但是也存在一些問題,這種方法的轉(zhuǎn)化植株可能是嵌合體,會(huì)不會(huì)

17、穩(wěn)定的進(jìn)行遺傳,需要進(jìn)一步研究。同時(shí)這種方法的轉(zhuǎn)化效率還是比較低,我們轉(zhuǎn)化了幾千粒種子僅僅得到不足十棵可育陽性植株,需要繼續(xù)研究影響轉(zhuǎn)化的因素,提高轉(zhuǎn)化效率。參考文獻(xiàn):1周洪生.玉米種子大全M.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2000.2吳乃虎.基因工程原理M.北京:科學(xué)出版社,2002.3Smith R ,H ood E E.Agrobacterium of m onocotyledons J .Crop Science ,1995,35:301-309.4Miller I ,T agliani L ,Wang N ,et al .High efficiency transgenesegregatio

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