微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證

1、GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證題目微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培 養(yǎng)基的配制、火困和貯存效期驗證類另U技術(shù)標準編碼STP-WJ001-02版次第1版制定人審核人批準人制定日期審核日期批準日期頒發(fā)部門質(zhì)量部發(fā)布日期生效日期分發(fā)部門制定依據(jù)藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010年修訂）變更歷史起草 修訂口原編碼：變更原因藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范變更目的：本試驗通過對微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制方法、滅菌程序以及配制后貯存條件和貯存效期進行驗證，確保每次配制的培養(yǎng)基質(zhì)量均滿足2010年版中國藥典要求。適用范圍：適用于微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基。責任人

2、：質(zhì)監(jiān)部經(jīng)理、QC主任、QC人員內(nèi) 容：1. 概述：3次獨立試驗中確定了培養(yǎng)基的配制方法、滅菌參數(shù)、貯存條件（2-25 C）及貯存時間（30天），并對貯存0天、7天、15天和30天的培養(yǎng)基進行適用性檢查（包括促生長能力、抑制能力、指示能力和無菌性）。培養(yǎng)基是否合格，對微生物的生長、分離、鑒定及檢驗結(jié)果的正確與否起著至關(guān)重要的作用， 因此，對培養(yǎng)基的質(zhì)量控制十分必要。適宜的培養(yǎng)基制備方法，合理存放，以及質(zhì)量控制試驗，是 提供優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)基的保證。2005年版中國藥典還沒有規(guī)定對培養(yǎng)基進行適用性檢查，經(jīng)過修訂，2010年版中國藥典不但規(guī)定了培養(yǎng)基需進行適用性檢查，而且在2010年版中國藥典（一部 附錄

3、）中規(guī)定： 若采用已驗證的配制和滅菌程序制備培養(yǎng)基且過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的適用性檢查實驗可只 進行一次，如果培養(yǎng)基的制備過程未經(jīng)驗證，那么每一批培養(yǎng)基均要進行適用性檢查試驗”。本次驗證試驗的目的就是通過驗證規(guī)范培養(yǎng)基的配制和滅菌過程，使培養(yǎng)基的整個配制和滅菌過程受控，同時確定培養(yǎng)基的貯存條件和貯存效期。2. 材料與儀器設(shè)備Q A 拉圭苴2.1 培養(yǎng)基2.1.1. 試驗用培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（批號 121010）、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號1302172）、胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（批號1112092 ）、膽鹽乳糖培養(yǎng)基（批號 1209162 ）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（批號120912）、四硫磺

4、酸鈉亮綠培養(yǎng)基（批號130124）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸培養(yǎng)基（批號 121023）均由北京三藥科技開發(fā)公司生產(chǎn)；2.1.2. 對照培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基（批號 135003-201103 ）、玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基（批號135005-201002 ）、胰酪胨大豆瓊脂對照培養(yǎng)基（批號 135025-201101 ）、膽鹽乳糖對照培養(yǎng)基（批號 135006-201203 ）、營養(yǎng)肉湯對照培養(yǎng)基（批號 135004-201103 ）、四硫磺酸鈉亮綠對照培養(yǎng)基（批號135020-201101）、4-甲基傘形酮葡糖苷酸對照培養(yǎng)基（批號 135012-201001 ）均中國藥品生物制品 檢定所提供

5、。22 菌種 大腸埃希菌（Escherichia coli ） CMCC（ B）44102；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ） CMC（ B） 26003 丨；乙型副傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B） CMCQ B） 50094；枯草芽孢桿菌 （Bacillus subtilis ） CMCQB） 63501 丨；白色念珠菌 （Candida albicans ） CMC（ F） 98001；黑曲霉（Aspergillus niger ） CMCQF） 98003 以上菌種均購自貴州省食品藥品檢驗所。2.3. 儀器設(shè)備醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇州安

6、泰空氣技術(shù)有限公司）；標準型潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠） ；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠）；生化培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；JJ200型電子天平（常熟雙杰測試儀器廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；電熱恒溫水浴鍋（天津市泰特儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；格蘭仕微波爐（順德市微波爐電器有限公司）；電冰箱（河南新飛電器有限公司）。3. 方法和結(jié)果3.1. 試驗環(huán)境試驗在潔凈度為A級的單向流空氣的潔凈操作臺進行，其環(huán)境潔凈度為C級。檢驗過程嚴格遵守無菌操作。3.2. 培養(yǎng)基的配制方法和滅菌參

7、數(shù)3.2.1. 培養(yǎng)基的選擇：分別隨機抽取接近效期的脫水培養(yǎng)基各3瓶，按照2010年版中國藥典培養(yǎng)基適用性檢查中規(guī)定的方法， 試驗分別進行3次獨立試驗，每次從培養(yǎng)基中各選取 1瓶進行試驗。3.2.2 .配制方法：按照培養(yǎng)基包裝上的配制說明配制，將培養(yǎng)基分別分裝在錐形瓶中，用硅膠塞塞 緊瓶口，并用硫酸紙包扎。四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）分裝于試管中，10ml/管，包扎；MU分裝于試管中，5ml/管，包扎。2.2.3滅菌參數(shù)：配制、包扎好的培養(yǎng)基，裝入立式壓力蒸氣滅菌器中，以驗證的滅菌程序進行滅 菌，滅菌后測pH直。3.3. 滅菌后培養(yǎng)基的貯存和貯存后使用方法3.3.1. 貯存條件：滅菌后的培養(yǎng)

8、基放冷后，置于2-25 C冷藏柜密閉貯存 30天，每天記錄冷藏柜溫度。3.3.2. 貯存后的使用方法：滅菌貯存后的已經(jīng)凝固的固體培養(yǎng)基，使用前，先于微波爐中融化，待培養(yǎng)基完全融化后，置于 45 C左右的恒溫水浴鍋中，待培養(yǎng)基溫度達到45 C后使用；火菌貯存后的液體培養(yǎng)基可直接使用。3.3.3. 貯存時間、適用性檢查項目和試驗菌種：分別選取滅菌后貯存0天（即剛滅菌后未凝固的培養(yǎng)基）、7天、15天、30天后的培養(yǎng)基進行適用性檢查，檢查項目和試驗菌種見表1。表1各類培養(yǎng)基的適用性檢查項目培養(yǎng)基名稱檢查項目（英文縮寫）無菌性促生長能力抑制能力指示能力營養(yǎng)瓊脂培 養(yǎng)基 （NA）玫瑰紅鈉瓊脂培 養(yǎng)基 （R

9、BA）試驗菌種大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌大腸埃希菌大腸埃希菌大腸埃希菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSAVVxx曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)VVxVMU培養(yǎng)(MUG)VVxV乳糖膽鹽培養(yǎng)基（BL）VVVx營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基VVxx四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTBVVVx注：V為考察項；x為不考察項。34菌懸液的制備參照2010年版中國藥典附錄中的方法制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉和乙型副傷寒沙門菌的菌懸液，用無菌的0.9%氯化鈉溶液制成1ml含菌數(shù)為5

10、0100cfu的菌懸液。并用營養(yǎng)瓊脂對照培養(yǎng)基測定各試驗組中加入的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和乙型副傷寒沙門菌的數(shù)量。用玫瑰紅鈉瓊脂對照培養(yǎng)基測定各試驗組中加入白色念 珠菌、黑曲霉的數(shù)量。3.5.培養(yǎng)基適用性檢查的試驗方法及結(jié)果 3.5.1.營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基促生長能力檢查:按照表1中的檢查項目，取上述制備的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念凝固后，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基置 28C培養(yǎng)72h;培養(yǎng)結(jié)束后各平板平均菌落數(shù)。從表 瓊脂培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基上的平均菌落數(shù)和 均菌落數(shù)均不小于相應(yīng)對照培養(yǎng)基上菌落平均

11、數(shù)的3035C培養(yǎng)48h;玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基置 232可以看出，3次試驗中3種試驗菌在被檢營養(yǎng)2種試驗菌在被檢玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基的平70%且菌落形態(tài)大小與對照培養(yǎng)基上的菌落一珠菌、黑曲霉的菌懸液各 1ml （含菌數(shù)50100cfu ）,分別注入無菌平皿中，立即傾注對應(yīng)的被檢培 養(yǎng)基和和對照培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備4個平皿（2個被檢培養(yǎng)基和 2個對照培養(yǎng)基），混勻,第4頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證第#頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證致。EMB固體選擇性培養(yǎng)基促生長能力和指示能力檢查:第#頁共8頁

12、GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證分別取大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的菌懸液O.ImL （含菌數(shù)1O-1OOcfu，測定結(jié)果見表3）涂布于被檢EMB平板上，在3035C培養(yǎng)18h。從表4可以看出，3次試驗中試驗菌在被檢培養(yǎng)基 上生長良好，其菌落大小、形態(tài)特征、指示反應(yīng)情況均符合大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的典型 特征。3.5.2. MUG液體培養(yǎng)基促生長能力和指示能力檢查：取大腸埃希菌菌懸液1mL （含菌數(shù)不大于100cfu，測定結(jié)果見表 3）接種到5ml被檢MUGKMUG在 3035C培養(yǎng)5h后觀察現(xiàn)象，結(jié)果3次試驗中試驗菌在兩種被檢液體培養(yǎng)基中生長良好

13、，培養(yǎng)基變渾濁，于365nm紫外光下呈現(xiàn)熒光反應(yīng)，見表4。3.5.3. BL 液體培養(yǎng)基促生長能力和抑制能力檢查：取大腸埃希菌菌懸液 1mL（含菌數(shù)不大于100cfu，測定結(jié)果見表3）接種到1瓶100ml被檢BL 中，置3035C培養(yǎng)18h后觀察現(xiàn)象；取金黃色葡萄球菌菌懸液2ml （不少于100cfu，測定結(jié)果見表3）接種到另1瓶100ml被檢BL中，置3035C培養(yǎng)24h后觀察現(xiàn)象，結(jié)果（見表 4）。3次試驗 中大腸埃希菌在被檢培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)基變渾濁；金黃色葡萄球菌在被檢培養(yǎng)基中被抑制， 不生長，培養(yǎng)基澄清。3.5.5 .營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基促生長能力檢查：取乙型副傷寒沙門菌菌懸液 1mL

14、（含菌數(shù)不大于 100cfu ,測定結(jié)果見表 3）分別接種到100ml 被檢營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和對照營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置3035C培養(yǎng)18h后，與對照培養(yǎng)基比較； 3次試驗中乙型副傷寒沙門菌在被檢培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)基變渾濁；培養(yǎng)48h后，空白培養(yǎng)瓶澄清。3.5.6. 四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基（TTB）促生長能力和抑制能力檢查：取5支（10ml/支）的對照TTB培養(yǎng)基，分別接種乙型副傷寒沙門菌和金黃色葡萄球菌菌懸液 1mL （含菌數(shù)不大于100cfu，測定結(jié)果見表3）各2支，另一支不接種菌作為空白對照；被檢培養(yǎng)基 同法操作，置3035C培養(yǎng)18h后，與對照培養(yǎng)基比較；3次試驗中乙型副傷寒沙門菌在被檢

15、培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)基變渾濁；培養(yǎng)24h，空白的培養(yǎng)管和接種金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)管澄清。3.5.7. 無菌檢查試驗：培養(yǎng)基滅菌后，不接種任何樣品，在對應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。從表3和表4中各培養(yǎng)基的無菌性可以得出，固體培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基和EMB無菌落生長；液體培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯、BL、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基和MUG澄清，與空白對照一致，均滿足無菌要求。第5頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證表2 宮養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基和大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基大豆酪蛋白瓊脂

16、培養(yǎng)基組次貯存時間促生長能力檢查無菌促生長能力檢查被檢培養(yǎng)基平均菌落數(shù)無困AU-.-LA 【宀AA*促生長能力檢查被檢培養(yǎng)基平均菌落數(shù) (cfu)/對照培養(yǎng)基平被檢培養(yǎng)基丨均 困落數(shù)(CTU)/對照培養(yǎng)基丨均 困無困均菌落數(shù)(cfu)/菌液回收率性檢查(CTU)/ 對照培養(yǎng)基平均困 落數(shù)(cfu) /菌液回收率性檢查落數(shù)(cfu)/菌液回收率性檢查大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌0天81/84/96%70/73/96%83/84/99%(-)63/67/94%51/54/94%(-)81/86/94%74/75/99%74/75/99%(

17、-)17天64/71/90%78/84/93%70/72/97%(-)62/73/85%59/64/92%(-)81/86/94%80/81/99%80/81/99%(-)15天70/73/96%81/86/94%74/75/99%(-)55/56/98%53/59/90%(-)94/95/99%68/60/113%65/70/93%(-)30天83/92/90%74/81/91%81/86/94%(-)69/73/95%62/63/98%(-)82/78/105%71/74/96%76/77/99%(-)0天70/77/91%79/83/95%73/75/97%(-)74/82/90%56/

18、63/89%(-)80/79/101%68/72/94%84/93/90%(-)27天62/69/90%71/75/95%72/78/92%(-)65/66/98%67/70/96%(-)85/90/94%76/80/95%90/91/99%(-)15天76/80/95%68/72/94%62/72/86%(-)57/61/93%58/62/94%(-)80/78/103%68/71/96%84/91/92%(-)30天75/79/95%59/67/88%58/66/88%(-)57/62/92%59/66/89%(-)64/64/100%77/74/104%88/89/99%(-)0天80/

19、81/99%74/77/96%80/82/98%(-)57/62/92%52/55/95%(-)61/65/95%76/77/99%90/91/99%(-)37天77/82/94%79/83/95%67/72/93%(-)67/73/92%60/62/97%(-)85/89/96%66/70/94%81/85/95%(-)15天66/67/99%77/80/96%68/71/96%(-)66/70/94%57/59/97%(-)72/79/91%90/90/100%82/90/91%(-)30天63/67/94%78/82/95%72/75/96%(-)55/58/95%55/59/93%(-

20、)78/78/100%82/84/98%59/63/94%(-)注：(+)表明無菌性檢查平板上有菌落生長；(-)表示無菌落生長;表3 BL、MUG EMB營養(yǎng)肉湯和四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基各試驗組加入的試驗菌測定結(jié)果組次貯存時間BLMUG稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)大腸埃希菌EMB稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)營養(yǎng)肉湯稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基 稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)稀釋度平均菌落數(shù)(cfu)大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌萄金黃色葡球菌0天10-78410-713710-78410-67310-78810-76810-71427天10-7711

21、0-715610-77110-68210-77810-77710-7156115天10-77310-716210-77310-67010-79010-77210-7172-7-7-7-6-7-7-730天1092101591092108710921080101800天10-77710-716210-77710-66910-78410-78610-7162o7天10-76910-714610-76910-67010-76910-77810-7155215天10-78010-714510-78010-67510-78610-76910-713830天10-77910-713710-77910-67

22、410-77210-76810-71370天10-78110-714910-78110-68210-79610-77210-7150-7-7-7-6-7-7-77天1082101631082107810821069101783-7-7-7-6-7-7-715天10671014610671074108310771014030天10-76710-715910-76710-66910-79410-77510-7166第7頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證表4 BL、MUG EMB營養(yǎng)肉湯和四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基適用性檢查結(jié)果EMB營養(yǎng)肉湯四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)

23、基組貯存促生長能力抑制能力次時間大腸埃希菌金黃色葡萄球菌BL0天（+）（-）1 7天（+）（-）15天（+）（-）30天（+）（-）0天（+）（-）7天（+）（-）215天（+）（-）30天（+）（-）0天（+）（-）7天（+）（-）315天（+）（-）30天（+）（-）無菌性檢查促生長能力大腸埃布菌指示能力大腸埃希菌（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)（-）(+)(+)MUG無菌性檢查大腸埃布菌乙型副傷寒沙門菌(-)(+)(+)(-

24、)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)(-)(+)(+)促生長能力無菌性檢查促生長能力大腸埃布菌無菌性檢查(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)促生長能力乙型副 傷寒沙門菌抑制能力金黃色葡萄球菌無菌性檢查(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(

25、-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)(+)(-)(-)第8頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證注：（+ ）試驗菌生長良好，培養(yǎng)基渾濁；（-）試驗菌被抑制，不生長，培養(yǎng)基澄清;第#頁共8頁GMP文件一微生物限度檢查用及環(huán)境監(jiān)測用培養(yǎng)基的配制、滅菌和貯存效期驗證4. 結(jié)論按照3.2.2.項下方法配制營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、BL、 MUGEMB營養(yǎng)肉湯和四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基， 以相應(yīng)程序和滅菌參數(shù)進行滅菌后， 貯存于225C 的冷藏柜中，分

26、別在貯存 0天、7天、15天和30天時對培養(yǎng)基的適用性進行考察，試驗結(jié)果表明 3 次獨立試驗中，貯存 30天內(nèi)的培養(yǎng)基，無菌性、促生長能力、指示能力和抑制能力均符合2010年版中國藥典規(guī)定，為了更有把握地確保培養(yǎng)基的質(zhì)量，確定以上培養(yǎng)基的貯存有效期為15天。5. 討論.5.1. 人員對培養(yǎng)基貯存效期驗證的影響不同實驗人員的操作，特別是配制過程和貯存過程的操作，會對每批培養(yǎng)基質(zhì)量的一致性產(chǎn)生 影響。驗證之后將配制、滅菌、貯存和使用的操作方法詳細規(guī)定在培養(yǎng)基配制、滅菌、貯存和使 用的標準操作規(guī)程文件中，指導操作；驗證中的 3次獨立操作由不同的實驗人員來進行；為確保 驗證方法操作的一致性，對相關(guān)人員進行培訓