α-淀粉酶的生產(chǎn)工藝

1、-淀粉酶的發(fā)酵生產(chǎn)工藝摘要：-淀粉酶廣泛分布于動物、植物和微生物中，能水解淀粉產(chǎn)生糊精、麥芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最為廣泛的酶制劑之一。目前，-淀粉酶已廣泛應(yīng)用于變性淀粉及淀粉糖、焙烤工業(yè)、啤酒釀造、酒精工業(yè)、發(fā) 酵以及紡織等許多行業(yè)。1.菌種的選育 1. 1 細(xì)菌的分離與初步鑒定：將土壤系列稀釋，把10-3 、 10-4、10-5分別涂布到淀粉培養(yǎng)基上，27倒置培養(yǎng)2天，將長出的菌落接入斜面。將細(xì)菌從斜面接種到淀粉培養(yǎng)基培養(yǎng)2天，用碘液染色，記錄透明圈大小和菌落直徑，計算D/d值。保菌供下次實驗用。 12 紫外線誘變育種：取活化后的菌種配成菌懸液、稀釋；倒淀粉培養(yǎng)基平板，將菌

2、懸液涂布其表面；用紫外線處理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每個處理2次重復(fù)；放到黑暗中倒置培養(yǎng)，37培養(yǎng)48h，分別計數(shù)誘變組和對照組平板上的菌落數(shù)，并計算致死率；加入碘液，分別測量誘變組和對照組菌落的透明圈直徑和菌落直徑，計算D/d值；將D/d值最大的菌種保存到斜面培養(yǎng)基上。1.3 誘變方法以及變異菌株的篩選誘變出發(fā)菌株在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期。以NTG為誘變劑，按一定處理劑量 (g/ml)，在一定pH值的緩沖液中30恒溫振蕩處理14 h。經(jīng)高速離心分離，移植于液體完全培養(yǎng)基進(jìn)行后培養(yǎng)。經(jīng)稀釋涂布在含有1%淀粉BY固體培養(yǎng)基上，經(jīng)24 h培養(yǎng)形成小菌落

3、。把單菌落分別移植于含2%淀粉BY液體培養(yǎng)基中，30培養(yǎng)36 h。用2#定性濾紙制成5 mm disc(小圓紙片)，并用2%瓊脂BY培養(yǎng)基滅菌后加入較大劑量青霉素(抑菌)。倒入200 mm×300mm長方形不銹鋼玻璃培養(yǎng)皿中，冷卻凝固。然后把5 mm disc紙順序放在培養(yǎng)基表面。用微量注射器分別吸取培養(yǎng)液，移植到相應(yīng)的disc上。把disc培養(yǎng)皿經(jīng)37，24h分別培養(yǎng)。把KI-I2液用噴霧器均勻分布在disc培養(yǎng)皿培養(yǎng)基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相對應(yīng)的1 ml培養(yǎng)液接種搖瓶，進(jìn)行發(fā)酵測定酶活力。把各種斜面菌株經(jīng)活化培養(yǎng)，接種于1%淀粉培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖瓶比較

4、實驗。將菌株作逐一對比，從中篩選出酶活較高的產(chǎn)酶菌株。經(jīng)菌種誘變選育-淀粉酶高產(chǎn)菌株為誘變的出發(fā)菌株，經(jīng)NTG反復(fù)多次處理，并經(jīng)淀粉水解圈初篩和搖瓶復(fù)篩，來選育-淀粉酶高產(chǎn)菌株。 經(jīng)NTG反復(fù)多次處理，-淀粉酶活力有較大幅度提高。在經(jīng)5次NTG處理之后，其變異株-淀粉酶活達(dá)到34 200 (U/ml)，較出發(fā)菌株提高了4.2倍以上，說明該誘變處理及選育方法是行之有效的。經(jīng)NTG處理所得的變異菌株的產(chǎn)酶穩(wěn)定性較差,必須經(jīng)反復(fù)多次單菌落分離和搖瓶比較，逐漸篩選出產(chǎn)酶穩(wěn)定性好的菌株。 2 培養(yǎng)基的優(yōu)化配制2.1培養(yǎng)基的制作 （1）培養(yǎng)基的類型 培養(yǎng)基的種類很多，可以根據(jù)組成、狀態(tài)和用途等進(jìn)行分類，按

5、照用途可以分成孢子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基。微生物大規(guī)模發(fā)酵設(shè)計主要用到孢子,種子和發(fā)酵培養(yǎng)基這三種類型。（2）孢子培養(yǎng)基 孢子培養(yǎng)基配制的目的是供菌體繁殖孢子的，常采用的是固體培養(yǎng)基，對這類培養(yǎng)基的要求是能使菌體生長快速，產(chǎn)生數(shù)量多而優(yōu)質(zhì)的孢子，并且不會引起菌體變異。對孢子培養(yǎng)基的要求：營養(yǎng)不要太豐富；所用無機(jī)鹽的濃度要適量；注意培養(yǎng)基的pH和濕度。 -淀粉酶的孢子培養(yǎng)基配置如下：將麩皮5、豆餅粉3、蛋白胨0.25%、瓊脂2%（pH 7.1）制成斜面培養(yǎng)基，在0.1MPa蒸汽滅菌20 min 。（3）種子培養(yǎng)基 種子培養(yǎng)基是供孢子發(fā)芽、生長和大量繁殖菌絲體，并使菌絲體長得粗壯成為活力強(qiáng)

6、的種子。對于種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求比較豐富和完全，氮源和維生素的含量也比較高些，濃度以稀薄為好，可以達(dá)到較高的溶解氧，供大量菌體生長和繁殖。 -淀粉酶的種子培養(yǎng)基的配置：將豆餅1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化鈉0.05%配置成種子培養(yǎng)基(pH 7.17.2)，在0.1MPa蒸汽滅菌20 min。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的要求是營養(yǎng)要適當(dāng)豐富和完全適合于菌種的生理特性和要求，使菌種迅速生長、健壯，能在比較短的周期內(nèi)充分發(fā)揮產(chǎn)生菌合成發(fā)酵產(chǎn)物的能力，但要注意成本和能耗。-淀粉酶的發(fā)酵培養(yǎng)基配方是：麩皮70、小米糠20、木薯粉10%、燒堿0.5%，加水使水量達(dá)60，常壓蒸汽滅菌1h.本發(fā)酵屬于一

7、級種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)，二級發(fā)酵。設(shè)計流程如下： 孢子錐形瓶種子罐發(fā)酵罐 （1）孢子制備 將保存在淀粉瓊脂斜面上的枯草芽孢桿菌孢子用無菌水洗下，接種到錐形瓶中，在35靜置培養(yǎng)24天，待長出大量孢子后作為接種用的種子。 (2)種子制備 將保藏的菌種接種到馬鈴薯茄子瓶斜面（20%馬鈴薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，瓊脂2%，pH 6.77.0），37培養(yǎng)3天。然后接入到20L種子罐，37攪拌，通風(fēng)培養(yǎng)1214小時。此時菌種進(jìn)入對數(shù)生長期（鏡檢細(xì)胞密集，粗壯整齊，大多數(shù)細(xì)胞單獨存在，少數(shù)呈鏈狀，發(fā)酵液pH 6.36.8,酶活510U/mL），再接種到發(fā)酵罐。 (3)發(fā)酵罐培養(yǎng) 培養(yǎng)

8、基的配制：用麥芽糖液配置成含麥芽糖6、豆粕水解液67、Na2HPO4·12H2O0.8、(NH4)2SO4 0.4、CaCl2 0.2、NH4Cl0.15、豆油1kg、深井水20L，調(diào)pH至 6.57.0。 發(fā)酵罐培養(yǎng)基經(jīng)消毒滅菌冷卻后接入3%5%種子培養(yǎng)成熟液。培養(yǎng)條件為：溫度37±1，罐壓0.5kgcm2，風(fēng)量120h 為1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培養(yǎng)時間為2836 h。2.2 耐高溫-淀粉酶的生產(chǎn)方法耐高溫淀粉酶生產(chǎn)工藝，采用地衣芽孢桿菌為菌株，通過一級種子罐發(fā)酵、大罐發(fā)酵、過濾、成品處理制得。 2.2.1 耐高溫-淀粉酶的生產(chǎn)原料有采用地衣芽

9、孢桿菌（Bacillus licheniformis）1.5噸種子罐發(fā)酵 ，玉米淀粉6%10%，玉米漿1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氫鉀0.3%0.6%，磷酸氫二鉀0.5%2%，檸檬酸鈉0.1%0.3%，35噸發(fā)酵罐發(fā)酵, 玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%，豆粕1%8%，玉米漿2%5%，磷酸二氫鉀0.1%0.8%，磷酸氫二鉀0.8%2%，檸檬酸鈉0.05%0.4%等。 2.2.2 耐高溫淀粉酶培養(yǎng)基制作（1） 選取菌種：采用地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)。（2） 1.5噸種子罐發(fā)酵 ，培養(yǎng)基配方：玉米淀粉6%10%，玉米漿1%3%，豆粕2%5%，磷酸二氫鉀0

10、.3%0.6%，磷酸氫二鉀0.5%2%，檸檬酸鈉0.1%0.3%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入種母，溫度37±1，通風(fēng)量25-40m/h，pH值6.4，培養(yǎng)時間24-36小時。（3） 35噸發(fā)酵罐發(fā)酵，培養(yǎng)基配方：玉米淀粉15%30%，玉米粉5%10%，豆粕1%8%，玉米漿2%5%，磷酸二氫鉀0.1%0.8%，磷酸氫二鉀0.8%2%，檸檬酸鈉0.05%0.4%，余量為水，各組分以重量百分比計；加高溫淀粉酶液化，pH6.2-6.4；溫度42±1，風(fēng)量400-1000m/h，pH值6.4-6.8，培養(yǎng)時間80-100小時

11、；在上述條件下補(bǔ)料分批發(fā)酵：以淀粉濃度為150280g/L為發(fā)酵初糖濃度，以質(zhì)量百分比40%70%的淀粉糖溶液作為發(fā)酵補(bǔ)料物，在DE值降至1060mg/ml時以閥門開啟程度的大小為依據(jù)開始持續(xù)流加補(bǔ)料，維持發(fā)酵液中DE值約為1060mg/ml，控制總糖濃度達(dá)到220320g/L時停止補(bǔ)料。（4） 提取濃縮工藝：經(jīng)絮凝、壓濾，二次過濾后，采用超濾膜濃縮，保持料液濃縮過程中溫度2045；最后采用精濾板框過濾機(jī)，配合硅藻土預(yù)涂工藝進(jìn)行過濾除菌，最終生產(chǎn)出成品。 2.2.3耐高溫-淀粉酶的另一種生產(chǎn)方法向成熟的發(fā)酵液中加入占發(fā)酵液重量1-3的鈣離子保護(hù)劑或2-5淀粉中的至少一種，在70-90的條件下，

12、進(jìn)行熱處理。將制得的純化的耐高溫。淀粉酶送至壓力噴霧塔進(jìn)行噴霧干燥，制得酶粉，將酶粉調(diào)配后，分裝即得成品。該耐高溫。淀粉酶呈固體狀態(tài)，酶活力達(dá)2萬單位g以上，具有較高的穩(wěn)定性，易貯存和運輸。2.2.4用菌種枯草芽孢桿菌T2來提取耐高溫淀粉酶枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是當(dāng)今工業(yè)酶制劑的主要生產(chǎn)菌種之一，主要用于生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。本實驗利用高產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌T2生產(chǎn)淀粉酶。（一）用此菌種來提取淀粉酶的生產(chǎn)原料枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）T2，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4

13、.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。（二）此培養(yǎng)基的制備1.培養(yǎng)基的制備與滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。分裝于100mL錐形瓶中，每瓶50mL，121滅菌20min。2.接種與產(chǎn)酶培養(yǎng)接種環(huán)灼燒滅菌后，輕輕刮取斜面種子培養(yǎng)基中的少量菌體，接入液體培養(yǎng)基中，并使環(huán)在液體與管壁接觸的部位輕輕摩擦，使菌體分散于液體中。37振蕩培養(yǎng)48 h。3.離心將發(fā)酵液置高速冷凍離心機(jī)中10000

14、r/min離心10 min，除菌體，上清液即為淀粉酶粗酶液。2.3 a一淀粉酶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化 231不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響單獨選擇面粉、大米粉、糊精、淀粉、蕎麥、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作為碳源，替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米粉，其余培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件不變。測定酶活結(jié)果，由圖1可見，面粉、大米粉、淀粉、蕎麥作為碳源時，都有利于米曲霉產(chǎn)酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖對產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較低。其中面粉對產(chǎn)酶的促進(jìn)作用最大，因此選擇面粉作為最佳唯一碳源。232不同有機(jī)氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在以面粉為唯一的碳源的條件下，選擇玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黃豆餅粉作為有機(jī)氮源，其余條件不

15、變。測定酶活結(jié)果由圖2可看出，牛肉膏作為有機(jī)氮源有利于米曲霉產(chǎn)酶，而玉米漿、蛋白胨、酵母膏、尿素作為有機(jī)氮源時，對產(chǎn)酶的促進(jìn)作用較低。從工業(yè)生產(chǎn)的角度，牛肉膏的成本太高，產(chǎn)酶促進(jìn)作用只較黃豆餅粉作為有機(jī)氮源的高一些，因此選擇黃豆餅粉作為有機(jī)氮源。 2.4-淀粉酶的分離制備-淀粉酶分離純化及活性測定方法粉酶分離純化及活性測定方法粉酶分離純化及活性測定方法粉酶分離純化及活性測定方法 2.4.1 -淀粉酶的分離和純化：高純度淀粉酶是一種重要的水解淀粉類酶制劑，可用于研究酶反應(yīng)機(jī)理和測定生化反應(yīng)平衡常數(shù)等。分離純化淀粉酶的方法很多，一般都是依據(jù)酶分子的大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、穩(wěn)定性、專一性結(jié)合位

16、點等性質(zhì)建立的。要得到高純度淀粉酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。 鹽析沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、疏水作用層析、親和層析和電泳等，是蛋白質(zhì)分離純化的主要方法。通過超濾、濃縮、脫鹽和聚丙烯酰胺垂直板凝膠電泳，對利用基因工程菌生產(chǎn)的重組超耐熱耐酸性一淀粉酶進(jìn)行純化，得到電泳純級的超耐熱耐酸一淀粉酶，純化倍數(shù)為11.7，活力回收率為29.8%。但上述方法存在的共同問題是，連續(xù)操作和規(guī)模放大都比較困難。 反膠團(tuán)萃取具有選擇性高、正萃與反萃可同時進(jìn)行、分離與濃縮同步進(jìn)行、操作簡單和易于放大等優(yōu)點，并能有效防止生物分子變性失活。以CTAB /正丁醇/異辛烷構(gòu)成反膠團(tuán)系統(tǒng)，通過反膠團(tuán)萃取方式純化精制-

17、淀粉酶。最佳反應(yīng)條件為: 萃取溫度40 ， 水相組成為NaCl 0.03 mol/L，pH 12.0，有機(jī)相：無機(jī)相= 1：2， 振蕩時間10min； 反萃取最佳條件為:溫度60， 水相組成為KCl 3 mol/L，pH 4.0,有機(jī)相：無機(jī)相= 2：1， 反萃取振蕩時間10 min。在上述條件下，經(jīng)過一個萃取與反萃取循環(huán)后，淀粉酶的萃取率最高可達(dá)90. 78%。雙水相技術(shù)具有處理容量大、能耗低、易連續(xù)化操作和工程放大等優(yōu)點。應(yīng)用雙水相系統(tǒng)PEG磷酸鹽分離純化淀粉酶，增加PEG濃度有助于酶富集上相。同樣用PEG磷酸鹽雙水相體系從發(fā)酵液中直接萃取分離低溫一淀粉酶，分配系數(shù)及回收率分別為4.8和8

18、7。采用PEG(聚乙二醇)硫酸銨雙水相體系，進(jìn)行分離純化淀粉酶，結(jié)果表明，在室溫下由PEG和硫酸銨所組成的雙水相體系，對淀粉酶的回收率可達(dá)94.84，分配系數(shù)可達(dá)17.10。雙水相技術(shù)有著溶液粘度高、分相時間長，易造成界面乳化等缺點，給實際操作帶來很多問題。為了獲得高純度的一淀粉酶，開始人們利用軟基質(zhì)的離子交換色譜和親和色譜分離純化了-淀粉酶的粗酶提取液。但是，軟基質(zhì)色譜介質(zhì)的機(jī)械強(qiáng)度小，受壓易變形，分析速度慢，分離效率低，柱壽命短，固定相對PH、離子強(qiáng)度和壓力非常敏感，反復(fù)使用時配體碎片容易脫落。由于以上缺點，軟基質(zhì)色譜有逐漸被硬基質(zhì)色譜取代的趨勢。在硬基質(zhì)色譜應(yīng)用方面，李華儒等首次合成一種對一淀粉酶具有特異親和能力的色譜介質(zhì)，并成功地分離純化了工業(yè)粗酶，獲得了高純度產(chǎn)品，其活性回收率>88%，Kato等也用高