總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法)

1、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 (FRAP法)產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱包裝S0116總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒(FRAP法)100次產(chǎn)品簡(jiǎn)介：總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 (FRAP法)，即 Total Antioxidant Capacity Assay Kit with FRAP method，簡(jiǎn)稱 T-AOC Assay Kit，是 一種采用Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP)方法，可以對(duì)血漿、血清、唾液、尿液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解 液、植物或中草藥抽提液、或各種抗氧化物(an tioxida nt)溶液的總抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)的試劑盒?；钚匝?Reactive o

2、xygen species, ROS)主要包括羥基自由基、超氧自由基和過(guò)氧化氫。在細(xì)胞或組織的正常生理代謝過(guò)程 中會(huì)產(chǎn)生活性氧，同時(shí)一些環(huán)境因子例如紫外照射、Y寸線照射、吸煙、環(huán)境污染等也可以誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生?；钚匝醍a(chǎn)生后，可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂、蛋白和DNA等的氧化損傷，誘發(fā)氧化應(yīng)激(Oxidative stress)，繼而導(dǎo)致各種腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病、肝損傷、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等。機(jī)體中存在多種抗氧化物，包括抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶等，可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的各種活性氧，以阻止活性氧 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(oxidative stress)的產(chǎn)生。一個(gè)體系內(nèi)的各種抗氧化大分子、抗

3、氧化小分子和酶的總的水平即體現(xiàn)了該體 系內(nèi)的總抗氧化能力。因此測(cè)定血漿、血清、尿液、唾液等各種體液，細(xì)胞或組織等裂解液中的總抗氧化能力具有非常 重要的生物學(xué)意義。植物或中草藥抽提液、或各種抗氧化物溶液的總抗氧化能力的檢測(cè)可以用于檢測(cè)各種溶液的抗氧化能力的強(qiáng)弱，可以用 于篩選強(qiáng)抗氧化能力的藥物。FRAP法測(cè)定總抗氧化能力的原理是酸性條件下抗氧化物可以還原Ferric-tripyridyltriazine (Fe 3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ,隨后在593nm測(cè)定藍(lán)色的Fe2+-TPTZ即可獲得樣品中的總抗氧化能力。由于反應(yīng)在酸性條件下進(jìn)行，可以抑制內(nèi)源 性的一些干擾因素。并且由于

4、血漿等樣品中的鐵離子或亞鐵離子的總濃度通常低于10側(cè)，因此血漿等樣品中的鐵離子或亞鐵離子不會(huì)顯著干擾FRAP法的檢測(cè)反應(yīng)。由于反應(yīng)體系中的鐵離子或亞鐵離子是和TPTZ螯合的，樣品本身含有的少量金屬離子螯合劑通常也不會(huì)顯著影響檢測(cè)反應(yīng)。An tioxida ntFe3 -TPTZ> Fe -TPTZ (藍(lán)色)提供了抗氧化物Trolox作為對(duì)照。Trolox是一種維生素E的類似物，水溶性較好，抗氧化能力和維生素E相近。本試劑盒方便快捷，加入待測(cè)樣品后 3-5分鐘即可進(jìn)行吸光度測(cè)定，通常10-20個(gè)樣品可以在十多分鐘內(nèi)檢測(cè)完畢。 本試劑盒可以檢測(cè)100個(gè)樣品。包裝清單：產(chǎn)品編號(hào)產(chǎn)品名稱包裝S0

5、116-1 TPTZ稀釋液15mlS0116-2TPTZ溶液1.5mlS0116-3檢測(cè)緩沖液1.5mlS0116-4FeSO4 72O200mgS0116-5 Trolox溶液(10mM)0.1ml說(shuō)明書(shū)1份保存條件：-20C保存，一年有效。其中 S0116-2 TPTZ溶液，S0116-3檢測(cè)緩沖液和S0116-5 Trolox溶液(10mM)需避光保存。注意事項(xiàng)：在酸性條件下呈藍(lán)色或接近藍(lán)色的試劑會(huì)對(duì)本試劑盒的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，需盡量避免。如果樣品中含有外加的較高濃度的鐵鹽或亞鐵鹽，會(huì)干擾測(cè)定。但血漿、血清、細(xì)胞或組織裂解液等樣品中含有的微量 的鐵鹽或亞鐵鹽不會(huì)干擾測(cè)定。樣品中不能添加DTT

6、、巰基乙醇等影響氧化還原反應(yīng)的物質(zhì)，也不宜添加Tween、Triton和NP-40等去垢劑。測(cè)定時(shí)需可以測(cè)定A593的酶標(biāo)儀一臺(tái)(測(cè)585-605nm也可以)或可以測(cè)定微量樣品的分光光度計(jì)一臺(tái)。TPTZ對(duì)人體有刺激性，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。使用說(shuō)明：1. FRAP工作液的配制：(1) 參考下表，根據(jù)待測(cè)定樣品的數(shù)量(含標(biāo)準(zhǔn)曲線)配制適量的FRAP工作液:1個(gè)檢測(cè)5個(gè)檢測(cè)10個(gè)檢測(cè)20個(gè)檢測(cè)50個(gè)檢測(cè)TPTZ稀釋液150微升750微升1500微升3)00 微升7500 微升TPTZ溶液15微升75微升150微升300微升750微升充分混勻后再加入檢測(cè)緩

7、沖液檢測(cè)緩沖液15微升75微升150微升300微升750微升FRAP工作液180微升900微升1800微升3'600 微升9)00 微升FRAP工作液配制后37C孵育，并宜在1-2小時(shí)內(nèi)使用完畢。2. 待測(cè)樣品的準(zhǔn)備：(1) 血清、血漿、唾液或尿液樣品的準(zhǔn)備：血清、血漿、唾液或尿液樣品每個(gè)樣品需要5微升，都可以直接用于測(cè)定。血清、血漿、唾液或尿液樣品都可以使用新鮮樣品進(jìn)行測(cè)定，也可以-80 C凍存后再進(jìn)行測(cè)定。-80 C凍存的樣品至少在一個(gè)月內(nèi)所測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著 變化。注意：血漿制備時(shí)可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝，不宜使用EDTA抗凝。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人血清或血漿中的總抗氧化能力為0

8、.5-2mM，人唾液中的總抗氧化能力為0.3-1mM，人尿液中的總抗氧化能力為0.2-3mM。(2) 細(xì)胞或組織樣品的準(zhǔn)備：對(duì)于細(xì)胞樣品，收集約100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞(不必精確計(jì)數(shù)，直接刮下，不宜使用胰酶和EDTA消化)，放置在200微升冰冷的PBS或HBSS溶液中，勻漿或超聲以充分破碎細(xì)胞并釋放其中的抗氧化物，4C約12000g離心5分鐘，取上清用于后續(xù)測(cè)定。對(duì)于組織樣品，每 20mg組織加入100微升冰冷的PBS或HBSS溶液，勻漿或超聲以充分破碎組織并釋放其中的 抗氧化物，4C約12000g離心5分鐘，取上清用于后續(xù)測(cè)定。以上所有操作均需在4C或冰上操作。制備好的細(xì)胞或組織樣品的上清如果不立即用

9、于測(cè)定，可以在-80 C凍存。-80 C凍存的樣品至少在一個(gè)月內(nèi)所測(cè)定獲得的數(shù)據(jù)沒(méi)有顯著變化。細(xì)胞或組織樣品在測(cè)定總抗氧化能力時(shí)需同時(shí)測(cè)定蛋白濃度，最后測(cè)定獲得的總抗氧化能力通常表示為 每毫克或每克蛋白重量中的總抗氧化能力，表示單位為mmol/mg或mmol/g。(3) 其它樣品的準(zhǔn)備：植物或中草藥抽提液都可以直接用于檢測(cè)。需注意樣品本身的顏色不會(huì)干擾檢測(cè)。植物或中草藥抽提液的抗氧化能力可以表示為每毫克或每克抽提物干重中的總抗氧化能力，表示單位為mmol/mg或mmol/g。各種抗氧化物測(cè)定其抗氧化能力時(shí)，通常配制成0.15-1.5mM，然后進(jìn)行測(cè)定?？寡趸锏臐舛瓤梢砸阅枬舛缺硎緯r(shí)，測(cè)定獲

10、得的總抗氧 化能力可以用相對(duì)總抗氧化能力進(jìn)行表示，例如0.5mM的某抗氧化物其測(cè)定獲得的OD值和1mM的亞鐵鹽測(cè)定獲得的OD值相同，則其相對(duì)總抗氧化能力為2,再如0.2mM的某抗氧化物其測(cè)定獲得的 OD值和1mM的亞鐵鹽測(cè)定獲得的OD值相同，則其相對(duì)總抗氧化能力為 5。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的準(zhǔn)備：稱取27.8 mg本試劑盒提供的FeSQ 72O,溶解并定容到1 ml，此時(shí)濃度即為100 mM。取適量100 mM FeSO 4溶液稀釋至 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM。通常可以使用蒸餾水或樣品配制溶液配制標(biāo)準(zhǔn)品。對(duì)于血清、血漿、唾液或尿液樣品 推薦直接用蒸餾水或PBS配制標(biāo)準(zhǔn)

11、品；對(duì)于細(xì)胞或組織樣品，推薦用用于細(xì)胞或組織勻漿的溶液配制標(biāo)準(zhǔn)品，其它樣品參 考前述方法進(jìn)行。FeS04溶液宜新鮮配制使用。100 mM FeSO 4溶液容易氧化產(chǎn)生三價(jià)鐵鹽，使溶液的顏色從最初的淡綠 色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃色。如果發(fā)現(xiàn)溶液的顏色已經(jīng)呈現(xiàn)明顯的黃色，應(yīng)該棄用該溶液，并使用試劑盒提供的FeSQ 72O重新配制新鮮的FeSO4溶液。4. 總抗氧化能力的測(cè)定：(1) 96孔板的每個(gè)檢測(cè)孔中加入180微升FRAP工作液。(2) 空白對(duì)照孔中加入5微升蒸餾水或PBS等適當(dāng)溶液；標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)孔內(nèi)加入 5微升各種濃度的FeS04標(biāo)準(zhǔn)溶液；樣品檢 測(cè)孔內(nèi)加入5微升各種樣品或0.15-1.5mM的Trolox作為陽(yáng)性對(duì)照。輕輕混勻。(3) 37C孵育3-5分鐘后測(cè)定A593。如果測(cè)定A593有困難，也可以在585-605nm范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。(4) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算岀樣品的總抗氧化能力。如果樣品測(cè)定岀來(lái)的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以外，需把樣品適當(dāng)稀釋后 再進(jìn)行測(cè)定。(5) 總抗氧化能力的表示方式：對(duì)于FRAP方法，總抗氧化能力用FeSQ標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來(lái)表示。例如某血漿樣品測(cè)定獲得的吸光度和1mM FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度相同，則該血漿樣品的總抗氧化能力即為1mM ;再如某血清樣品測(cè)定獲得的吸光度和0.65mM