高抗菌活性乳酸菌的篩選及菌種鑒定

1、高 抗 菌 活 性 乳 酸 菌 的 篩 選 及 菌 種 鑒 定摘 要：研究旨在篩選適用于飼料青貯的高抗菌活性乳酸菌，并進(jìn)行菌種鑒定。以藤黃微球菌、沙門氏菌、大腸桿菌為指示菌，通過牛津杯雙層平板法對從玉米、水稻、蔬菜殘渣、豬糞、雞糞等樣品中分離出的121株乳酸菌進(jìn)行抑菌試驗。通過生理生化，碳源發(fā)酵試驗和16SrRNA分子鑒定及recA基因擴(kuò)增對所選菌株進(jìn)行鑒定。菌株ZZU 575具有較強(qiáng)抗菌活性，排除酸、過氧化氫干擾后，其發(fā)酵上清液對大腸桿菌抑制作用消失，但對藤黃微球菌及沙門氏菌仍有很強(qiáng)的抑制活性；其抑菌活性在酸性條件下較強(qiáng)，在加入蛋白酶K和胰蛋白酶以及100 以上熱處理時明顯下降甚至消失；ZZ

2、U 575被鑒定為植物乳桿菌。菌株ZZU 575在飼料青貯中具有潛在應(yīng)用價值。關(guān)鍵詞：乳酸菌；抑菌活性；16S rRNA；recA乳酸菌是一種廣泛分布于自然界而且普遍應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等領(lǐng)域的益生菌。乳酸菌可以產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，包括有機(jī)酸，過氧化氫及細(xì)菌素等；其中細(xì)菌素是由微生物通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的蛋白類物質(zhì)，抑菌范圍不僅僅局限于同源的細(xì)菌，產(chǎn)生菌對其細(xì)菌素具有自身免疫性。細(xì)菌素與抗生素不同，一些抗生素殺死病原微生物的同時，還會破壞動物腸道正常菌群，導(dǎo)致菌群失調(diào)、抵抗力下降，疾病的發(fā)病率增加等不良情況。而乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素因其具有無毒性，無抗藥性，易被消化道中的蛋白酶

3、降解，不易在體內(nèi)蓄積引起不良反應(yīng)等特性，已經(jīng)引起開發(fā)高效安全飼料添加劑科研人員的密切關(guān)注1-5。細(xì)菌素可防止飼料本身被沙門氏菌等致病菌的污染，防止致病菌對動物的危害，并且可限制帶菌動物排瀉物中病原微生物的傳播。我國農(nóng)業(yè)部第105號公布的允許使用的飼料級微生物添加劑共12種，植物乳桿菌是其中的一種；菌體本身與所產(chǎn)植物乳桿菌素在飼料中主要應(yīng)用于青貯飼料、微生物發(fā)酵飼料及飼料添加劑等方面6-7。盡管乳酸菌在飼料青貯中已有所應(yīng)用，但由于飼料種類繁多，分布區(qū)域環(huán)境條件差異較大，仍然需要廣泛篩選優(yōu)良乳酸菌，開發(fā)新的適合具體需求的高效飼料青貯用乳酸菌添加劑。分離篩選高抗菌活性的乳酸菌，不僅有利于飼料青貯，還

4、可以應(yīng)用于食品、飼料的殺菌防腐和微生態(tài)制劑的研究開發(fā)。本實驗篩選出一株抑菌活性較強(qiáng)的乳酸菌，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行研究，旨在為這一菌株作為飼料青貯添加劑的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 實驗菌株乳酸菌菌株共121株，分離自玉米、水稻、蔬菜殘渣、豬糞、雞糞等樣品；指示菌有藤黃微球菌、大腸桿菌、沙門氏菌，均為實驗室保存。1.1.2 試劑及培養(yǎng)基過氧化氫酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、菌株DNA提取試劑盒、MRS培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基。1.2 方法1.2.1 高抗菌活性菌株的初篩將保存于-80 冰箱中的乳酸菌活化后，接種到MRS 液體培養(yǎng)基，30 培養(yǎng)48 h。發(fā)酵液經(jīng) 10 000

5、r/min離心5 min，取上清液用于高抗菌活性乳酸菌的篩選；采用牛津杯雙層平板法8測定其抑菌活性。1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素菌株的復(fù)篩乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生許多具有抑菌作用的物質(zhì)，如有機(jī)酸、過氧化氫等，因此在篩選細(xì)菌素產(chǎn)生菌時需要排除這些因素的干擾，并初步確定其抑菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)。 酸抑制作用的排除：選取對三種指示菌均有抑制作用的菌株，按上訴方法制備發(fā)酵上清液，測上清液的pH值，用2 mol/l NaOH和2 mol/l乳酸調(diào)發(fā)酵上清液pH值至5.0，并用乳酸調(diào)未接種的MRS液體培養(yǎng)基pH值至5.0作為對照；用牛津杯雙層平板法做抑菌實驗。 過氧化氫酶作用的排除：選取酸排除后依然有抑菌作用的乳

6、酸菌菌株制備發(fā)酵上清液，調(diào)pH值至7.0，按照過氧化氫酶終濃度為5.0 mg/ml加入到發(fā)酵液中，37 水浴2 h，再將pH值調(diào)至5.0，檢測過氧化氫酶處理后發(fā)酵上清液的抑菌活性。 蛋白酶解檢測：選取篩選出的乳酸菌制備發(fā)酵上清液，調(diào)發(fā)酵上清液到胰蛋白酶和蛋白酶K的最適作用pH值，按1.0 mg/ml加入胰蛋白酶和蛋白酶K，同上處理，檢測胰蛋白酶和蛋白酶K對乳酸菌發(fā)酵上清液抑菌活性的影響。1.2.3 細(xì)菌素生物學(xué)特性初步鑒定 熱敏感性：將發(fā)酵上清液分別置 60、80、100 水浴鍋 30 min 和 60 min，121 滅菌鍋15 min；冷卻后進(jìn)行抑菌實驗。 pH敏感性：發(fā)酵上清液，用1 m

7、ol/l 乳酸和1 mol/l NaOH 調(diào)其pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，37 溫育2 h后，進(jìn)行抑菌實驗。1.2.4 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定 菌株表型特征及生理生化實驗：觀察培養(yǎng)皿上菌落的形狀、顏色、大小等，用革蘭氏染色后觀察細(xì)胞的形態(tài)。生理生化實驗包括觀察不同溫度、pH值、鹽(NaCl)濃度條件下的生長狀況、過氧化氫酶實驗、葡萄糖產(chǎn)氣實驗，碳源發(fā)酵實驗9。 16S rRNA基因PCR產(chǎn)物片段的DNA序列分析10。 細(xì)菌基因組的recA擴(kuò)增11-12。2 結(jié)果與分析2.1 初篩結(jié)果對實驗室保存的121株乳酸菌進(jìn)行抑菌實驗，發(fā)現(xiàn)有45株對三種指示菌

8、有較強(qiáng)的抑制作用。選取這45株菌進(jìn)行復(fù)篩實驗。乳酸菌屬于G+菌，傳統(tǒng)觀點認(rèn)為G+菌的抑菌范圍僅限于其他G+菌，但后來發(fā)現(xiàn)一些G+菌所產(chǎn)細(xì)菌素的抑菌譜可以顯著擴(kuò)大，對一些G-菌也有抑制作用13。本實驗篩選出一些乳酸菌菌株對G+菌和G-菌均有抑制作用。2.2 復(fù)篩結(jié)果經(jīng)過酸排除、過氧化氫排除實驗，從豬糞中分離出的編號為 ZZU 575的乳酸菌抑菌活性較強(qiáng)，其發(fā)酵上清液在不同條件下對指示菌的抑菌活性如表1所示，pH值調(diào)至5.0的MRS液體培養(yǎng)基對三種指示菌都沒有抑制作用，說明這三種指示菌可以耐受pH值5.0的環(huán)境。在排除酸的作用后，菌株 ZZU 575 的上清液對大腸桿菌的抑制作用消失。但排除酸和過

9、氧化氫作用后，菌株ZZU 575對藤黃微球菌及沙門氏菌仍具有較強(qiáng)的抑制活性，說明該菌株發(fā)酵上清液中存在除酸和過氧化氫以外的其它抑菌物質(zhì)。表1 ZZU 575的抑菌效果試驗菌株ZZU575ZZU575ZZU575ZZU575MRS抑菌活性藤黃微球菌+-+-大腸桿菌-沙門氏菌+-注：抑菌圈直徑包含牛津杯外徑（7.80 mm）；+：抑菌圈直徑8.0012.00 mm；+：12.0016.00 mm；+:16.0020.00 mm；-：表示無抑制作用（直徑8.00 mm），表2、表3同；代表酸排除處理；代表過氧化氫酶處理；代表蛋白酶K處理；代表胰蛋白酶處理。將菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液進(jìn)行胰蛋白酶

10、和蛋白酶K的酶解實驗，發(fā)現(xiàn)在加入胰蛋白酶后抑菌活性微弱，加入蛋白酶K后的抑菌活性消失，說明菌株ZZU 575發(fā)酵上清液中存在細(xì)菌素類抑菌物質(zhì)。2.3 細(xì)菌素生物學(xué)特性的初步鑒定2.3.1 熱敏感性菌株ZZU 575發(fā)酵上清液在不同溫度處理下的抑菌效果如表2所示，菌株ZZU 575 產(chǎn)生的細(xì)菌素表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性。在60 和80 條件下熱處理30 min和60 min，抑菌活性基本保持14不變，說明在低于或等于80 條件下該抑菌活性B藝設(shè)備工D道健康腸E機(jī)微量元素有A家論壇專F芻動物營養(yǎng)反G濟(jì)動物經(jīng)H測技術(shù)檢I題論述專SILIAO GONGYEC驗研究試物質(zhì)穩(wěn)定性較強(qiáng)。但隨著溫度繼續(xù)升高，其活

11、性受到影響，在100 條件下處理30 min或60 min,活性有所減弱，在121 處理15 min后，抑菌活性消失。指示菌沙門氏菌藤黃微球菌加熱處理后的抑菌活性60 30 min+60 min+80 30 min+60 min+100 30 min+60 min+121 15 min-表2 溫度對細(xì)菌素抑菌活性的影響指示菌沙門氏菌藤黃微球菌抑菌活性pH值2.0+3.0+4.0+5.0+6.0+7.0-8.0-9.0-表3 pH值對抑菌活性的影響實驗菌株ZZU 575革蘭氏染色+細(xì)胞形態(tài)桿發(fā)酵類型同型生長溫度（）5w10+40+45w50w可適生長pH值3.0+3.5+4.0+4.5+5.0+

12、6.0+7.0+8.0+9.0+NaCl 濃度（%）3.5+6.5+葡萄糖產(chǎn)氣-過氧化氫酶-表4 菌株形態(tài)及生理生化特性鑒定結(jié)果注：+：代表反應(yīng)為陽性；-：代表反應(yīng)為陰性；w：代表反應(yīng)為弱陽性。表5同。2.4.1 菌落形態(tài)菌落呈圓形，顏色為乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊。2.4.2 菌株的形態(tài)及生理生化特性（見表4）2.3.2 pH敏感性將菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液調(diào)至不同的pH值后分別進(jìn)行抑菌實驗，抑菌效果如表3所示。表3結(jié)果表明，在pH值2.06.0范圍內(nèi)，菌株ZZU 575的發(fā)酵上清液對沙門氏菌和藤黃微球菌均有抑制作用；當(dāng)pH值7.0時，菌株產(chǎn)生的細(xì)菌素基本無抑菌活性。2.4 菌

13、株ZZU 575的鑒定由表4可以看出，菌株ZZU 575可以在10 低溫下生長良好，而對45 、50 高溫及5 低溫的耐受能力微弱；可以在pH值3.09.0的范圍內(nèi)生長良好；可以耐受3.5%及6.5%的鹽濃度。2.4.3 碳源發(fā)酵實驗結(jié)果（見表5）由表5可知，菌株ZZU 575 可以利用核糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、甘露醇等18種碳源，對攏牛兒糖、D-阿拉伯糖醇、葡萄糖酸鹽有微弱利用。2.4.4 16S rRNA序列分析將測得的16S rDNA序列與通過Blast在GenBank 中檢測得到的標(biāo)準(zhǔn)菌株序列信息通過CLUSTAL W軟件比對。采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹（neighbor-join

14、ing method），如圖1所示，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis被用作外圍菌株。根據(jù)菌株的生理生化性狀，和其在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的位置，將菌株ZZU 575初步鑒定屬于植物乳桿菌群。將其和4株標(biāo)準(zhǔn)菌株L. plantarum subsp. plantarum，L. plantarum subsp. argentoratensis，L. pentosus，L. paraplantarum進(jìn)行recA基因部分?jǐn)U增產(chǎn)物的比對。結(jié)果如圖2所示。菌株ZZU 575和標(biāo)準(zhǔn)菌株植物乳桿菌一樣具有相同的recA基因擴(kuò)增產(chǎn)物（318 bp）。因此ZZU 575被鑒定為植物乳桿菌(L. plantar

15、um subsp. plantarum)。3 討論對實驗室保存的乳酸菌進(jìn)行抑菌活性實驗后，篩選到一株有較強(qiáng)抑菌活性的乳酸菌菌株ZZU 575，這株乳酸菌在排除有機(jī)酸和過氧化氫的作用后仍有抗菌活性，而蛋白酶K，胰蛋白酶的作用可以使其抑菌活性明顯下降甚至喪失，這與已報道的細(xì)菌素Sakacin C214情況類似，初步說明菌株ZZU 575產(chǎn)生的是蛋白類抑菌物質(zhì)，有可能是一類細(xì)菌素。決定細(xì)菌素應(yīng)用價值的關(guān)鍵因素是 15B藝設(shè)備工D道健康腸E機(jī)微量元素有A家論壇專F芻動物營養(yǎng)反G濟(jì)動物經(jīng)H測技術(shù)檢I題論述專2013年第34卷第19期 總第448期C驗研究試編號0123456789101112131415

16、161718192021222324碳源對照甘油赤癬醇D-阿拉伯糖L-阿拉伯糖核糖D-木糖L-木糖阿東醇-甲基-D-木糖甙半乳糖葡萄糖果糖甘露糖山梨糖鼠李糖衛(wèi)茅醇肌醇甘露醇山梨醇-甲基-D-甘露糖甙-甲基-D-葡萄糖甙N-乙酰-葡糖胺苦杏仁甙熊果甙結(jié)果-+-+-+-+編號25262728293031323334353637383940414243444546474849碳源七葉靈柳醇纖維二糖麥芽糖乳糖蜜二糖蔗糖海藻糖菊糖松三糖棉籽糖淀粉糖原木糖醇攏牛兒糖D-松二糖D-來蘇糖D-塔塔糖D-巖糖L-巖糖D-阿拉伯糖醇L-阿拉伯糖醇葡萄糖酸鹽2-酮基-葡萄糖酸鹽5-酮基-葡萄糖酸鹽結(jié)果+-+-w-w

17、-w-表5 碳源發(fā)酵實驗結(jié)果16圖1 ZZU 575的16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹B藝設(shè)備工D道健康腸E機(jī)微量元素有A家論壇專F芻動物營養(yǎng)反G濟(jì)動物經(jīng)H測技術(shù)檢I題論述專SILIAO GONGYEC驗研究試細(xì)菌素的穩(wěn)定性，因其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，各類細(xì)菌素的穩(wěn)定性不一樣。細(xì)菌素的穩(wěn)定性主要受到溫度和pH值的影響，對溫度而言，不同的細(xì)菌素對溫度的敏感性不同，本實驗篩選的菌株ZZU 575的抑菌物質(zhì)在6080 高溫處理后抑菌作用基本保持穩(wěn)定。溫度高于 100 時抑菌活性明顯降低，推測原因可能是高溫使多肽或者蛋白質(zhì)的高級構(gòu)象和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致多肽或蛋白質(zhì)失活，從而使得細(xì)菌素活性降低。對pH

18、值而言，大部分細(xì)菌素在酸性條件下穩(wěn)定，在中性和堿性條件下活性降低或失活，菌株ZZU 575產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在酸性條件下活性較強(qiáng)，表明其抑菌物質(zhì)可以在弱酸性的青貯飼料中發(fā)揮作用。注：M代表DNA marker；1、2、3、4、5分別代表L. case（i陰性對照），L. paraplantarum，L. pentosus，L. plantarum subsp. plantarum, L. plantarum subsp. argentoratensis 的擴(kuò)增產(chǎn)物；6代表待測菌株ZZU 575的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2 recA基因擴(kuò)增產(chǎn)物分析在對菌株ZZU 575進(jìn)行鑒定中發(fā)現(xiàn)單憑該菌株的生理生化，碳源發(fā)

19、酵特征很難將其鑒定到種的水平。通過16S rRNA序列分析，發(fā)現(xiàn)ZZU 575歸于Lactobacillus屬，但不能明確鑒定到種，因此又補(bǔ)充了recA基因擴(kuò)增產(chǎn)物分析。結(jié)果顯示菌株ZZU 575 屬 于 植 物 乳 桿 菌 (L. plantarum subsp.plantarum)。菌株ZZU 575所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的分離純化及作用機(jī)理等有待進(jìn)一步研究。4 結(jié)論本研究篩選到一株高抗菌活性乳酸菌，對G+菌和G-菌均有抑制作用，且其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在酸性條件下活性較強(qiáng)，在6080 高溫范圍內(nèi)活性穩(wěn)定。該菌在1040 、pH值3.09.0環(huán)境中生長良好，能夠耐受6.5%的鹽濃度。以上結(jié)果表明該菌株在青

20、貯飼料中具有潛在應(yīng)用價值。參考文獻(xiàn)1 田召芳，牛鐘相, 常維山，等. 乳酸菌細(xì)菌素的研究進(jìn)展J.徽生物學(xué)雜志，2003，23(6): 47-49.2 張艾青，劉書亮，詹莉，等. 產(chǎn)廣譜細(xì)菌素乳酸菌的篩選J.中國釀造, 2007, 167(2): 45-48.3 王成濤，曹雁平，孫寶國，等. 產(chǎn)類細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其生物學(xué)特性研究J. 中國釀造, 2008, 200(23):50-53.4 韓雪，李研東，王穎. 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的分離與篩選J. 中國飼料, 2011(7):31-32.5 儲衛(wèi)華，曹映海，高國峰. 篩選產(chǎn)類細(xì)菌素乳酸菌及類細(xì)菌素特性研究J. 微生物學(xué)雜志, 2006, 26(1)

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