第八章酶分子的定向進(jìn)化

1、1第 八章 酶分子的定向進(jìn)化2第一節(jié)簡(jiǎn)介一、理論來(lái)源o隨著電子科學(xué)的迅猛發(fā)展及計(jì)算機(jī)的廣泛應(yīng)用，酶學(xué)研究跨入了新的階段。o利用基因工程的原理，可以在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然界中的漫長(zhǎng)進(jìn)化過(guò)程，并由此建立了酶分子的定向進(jìn)化方法，用于構(gòu)建新的非天然酶或改造天然酶分子。4三、發(fā)展方向n酶催化的精確性和有效性往往并不能滿足通常的工業(yè)化要求，天然酶通常缺乏有商業(yè)價(jià)值的催化功能及其他性質(zhì)。因此，對(duì)天然酶分子水平上的改造，顯得十分重要。n酶分子仍具有巨大的進(jìn)化潛力，是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件。n酶分子存在進(jìn)化潛力的主要原因如下：n天然酶在生物體內(nèi)存在的環(huán)境與酶的實(shí)際應(yīng)用環(huán)境不同n實(shí)際應(yīng)用中，期待酶的活力和穩(wěn)定

2、性越高越好，但在生物體內(nèi)對(duì)環(huán)境適應(yīng)的進(jìn)化主要表現(xiàn)在整體的適應(yīng)能力、調(diào)控能力的增強(qiáng)n某些酶或蛋白質(zhì)待進(jìn)化的性質(zhì)不是在生物體內(nèi)所涉及的，如對(duì)蛋白質(zhì)藥物改造消除其副作用5v酶分子的定向進(jìn)化是從一個(gè)或多個(gè)已經(jīng)存在的親本酶（天然或人為獲得的）出發(fā)，經(jīng)過(guò)基因的突變和重組，構(gòu)建一個(gè)人工突變酶庫(kù)，通過(guò)篩選最終獲得預(yù)先期望的具有某些特性的進(jìn)化酶。v其原理如圖81：6711第三節(jié)定向進(jìn)化的策略n一、易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化n二、DNA改組技術(shù)為代表的有性進(jìn)化n三、基因家族之間的同源重組n四、外顯子改組n五、雜合酶n六、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)n七、突變庫(kù)的構(gòu)建及應(yīng)用12一、易錯(cuò)PCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化 易錯(cuò)PCR是

3、在采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增 目的基因時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，改變Taq酶的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變構(gòu)建突變庫(kù)。 如提高鎂離子濃度、加入錳離子、改變體系中四種dNTP濃度等。 關(guān)鍵：突變頻率適中，理論上每個(gè)靶基因?qū)氲娜〈鷼埢鶄€(gè)數(shù)為1.55之間。 連續(xù)易錯(cuò)PCR（sequential error-prone PCR），將一次PCR擴(kuò)增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴(kuò)增的模板，連續(xù)反復(fù)地進(jìn)行隨機(jī)誘變，使每一次獲得的小突變累積產(chǎn)生重要的有益突變。13141516 以單一的酶分子基因進(jìn)行定向進(jìn)化時(shí)，基因的多樣化起源于PCR等反應(yīng)中的隨機(jī)突變，但由于突變大多是有害的或者是中

4、性的，采用這種過(guò)程集中有利突變的速度比較慢。 從自然界中存在的基因家族出發(fā)，利用它們之間的同源順序進(jìn)行DNA改組實(shí)現(xiàn)同源重組，由于每一個(gè)天然酶的基因都經(jīng)過(guò)千百萬(wàn)年的進(jìn)化，并且基因之間存在比較顯著的差異，所以獲得的突變重組基因庫(kù)中既體現(xiàn)了基因的多樣化，又最大限度的排除了那些不需要的突變。 此策略拓寬了酶分子突變庫(kù)中的序列空間，而且限制了有害突變的摻入而不會(huì)增加突變庫(kù)的大小和篩選難度，從而保證了對(duì)很大的序列空間中有希望的區(qū)域進(jìn)行快速定位。1718五、雜合酶v1.雜合酶的定義v把來(lái)自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是整個(gè)酶分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。192.研究雜合酶的意義與應(yīng)用v

5、蛋白質(zhì)工程應(yīng)用于酶學(xué)的主要目的是通過(guò)改變現(xiàn)存酶的特性，創(chuàng)造出具有新特性或性能有所改善的酶。v研究雜合酶的意義天然酶在現(xiàn)存的工業(yè)條件下穩(wěn)定性較差或其催化水平很低；天然酶在工程菌中的折疊效率較差或?qū)Φ鞍酌该舾校幻傅拇呋盍π枰獢U(kuò)大或減?。恍枰?jiǎng)?chuàng)造具有新反應(yīng)活力的酶。v雜合酶的應(yīng)用：改變酶的非催化特性；創(chuàng)造具有新活力的酶；研究酶的結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。203.展望v在新酶的開(kāi)發(fā)和現(xiàn)有酶的改造利用方面，雜合酶技術(shù)顯示了巨大的應(yīng)用前景。v雜合酶技術(shù)是將DNA水平上的突變篩選與蛋白質(zhì)水平上的酶學(xué)研究相結(jié)合的一門(mén)綜合技術(shù)，將傳統(tǒng)酶學(xué)活性篩選法同簡(jiǎn)便的DNA重組技術(shù)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，使酶工程的研究摒棄了繁瑣的蛋

6、白質(zhì)序列研究和繁重的菌種選育的傳統(tǒng)做法，為加快構(gòu)建新酶和改進(jìn)生物工藝過(guò)程開(kāi)創(chuàng)了一條新路。vDNA與蛋白質(zhì)研究技術(shù)的突破也必將推動(dòng)雜合酶技術(shù)的發(fā)展。新克隆的基因序列不斷增多，基因組序列信息日新月異，提供了越來(lái)越多的同工酶信息，使我們能夠更正確地預(yù)測(cè)可作為分子篩選引物的保守序列和用這些引物對(duì)培養(yǎng)和未經(jīng)培養(yǎng)的微生物進(jìn)行篩選。v從篩選的角度看，發(fā)展趨勢(shì)是從活性篩選向分子篩選轉(zhuǎn)移。v基因數(shù)據(jù)庫(kù)和其他生物信息工具的利用將越來(lái)越頻繁。v篩選工作的最終關(guān)鍵是開(kāi)發(fā)具有特異性的分析方法。21六、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)信息及其它與酶分子相關(guān)的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的充分利用可以大大減小由于盲目的隨機(jī)突變形成的突變庫(kù)容量過(guò)大而

7、給篩選帶來(lái)的困難。Frances H Arnold 用計(jì)算機(jī)的方法限制突變庫(kù)的大小，減小搜索范圍從而優(yōu)化酶的定向進(jìn)化方法。篩選正向突變可能性大的突變庫(kù)有效地減小了突變庫(kù)的大小，增大了篩選效率和成功的可能性。22七、突變庫(kù)的構(gòu)建及應(yīng)用n（一）構(gòu)建理想的基因文庫(kù)要考慮的因素n1.基因文庫(kù)的質(zhì)量n（1）基因文庫(kù)的代表性文庫(kù)中包含的DNA分子應(yīng)能完整地反映來(lái)源基因的全部可能的變化和改變，文庫(kù)質(zhì)量的最重要的指標(biāo)，可用庫(kù)容量來(lái)表示。n（2）突變基因片段的序列完整性文庫(kù)中重組或突變DNA片段應(yīng)盡可能完整地反映出天然基因的結(jié)構(gòu)。n2.文庫(kù)篩選可選擇的具體方法最理想的情況是對(duì)于具體構(gòu)建出的一個(gè)突變基因文庫(kù)應(yīng)能夠

8、使用多種篩選方法。23（二）構(gòu)建突變文庫(kù)的載體系統(tǒng)n1.噬菌體載體系統(tǒng)n最早使用的載體系統(tǒng)，在載體本身的設(shè)計(jì)方面已經(jīng)相當(dāng)成熟。n優(yōu)點(diǎn)：插入片段的載容量大，適合于大片段的克隆。感染效率高、鑒定容易，有較好的質(zhì)量控制指標(biāo)。基因文庫(kù)質(zhì)量高、代表性好，穩(wěn)定性好，適合長(zhǎng)期保存。n缺點(diǎn)：構(gòu)建成文庫(kù)后，可采用的文庫(kù)篩選方法有限。基因片段無(wú)法在宿主細(xì)胞中表達(dá)。242.質(zhì)粒載體系統(tǒng)n優(yōu)點(diǎn)：可實(shí)現(xiàn)對(duì)基因文庫(kù)的功能性篩選。n實(shí)現(xiàn)基因的功能性篩選需滿足的條件：文庫(kù)中的基因編碼序列能在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生具有天然構(gòu)象的編碼產(chǎn)物；在檢測(cè)出目的功能的同時(shí)，能直接或間接編碼這一表型的基因。n缺點(diǎn)：n載體容量小，長(zhǎng)片段易丟失。

9、n轉(zhuǎn)化效率低，易失活。253.哺乳類(lèi)細(xì)胞表達(dá)載體n這種研究策略在發(fā)現(xiàn)和鑒定出人類(lèi)細(xì)胞中與重大生理現(xiàn)象和重大疾病相關(guān)的功能基因的工作中顯示了良好的應(yīng)用前景，是基因文庫(kù)技術(shù)發(fā)展的一個(gè)新動(dòng)向。26（三）文庫(kù)的篩選n1.篩選文庫(kù)的策略n根據(jù)已知基因編碼產(chǎn)物的特定活性進(jìn)行篩選。不需要附加任何先決條件，通過(guò)檢測(cè)在特定條件下來(lái)源于兩個(gè)文庫(kù)的基因編碼產(chǎn)物之間發(fā)生相互作用的情況從而確定出兩個(gè)文庫(kù)中所有可能在生理上發(fā)生相互作用的基因?qū)Γ枥L出某一特定類(lèi)型細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的基因之間發(fā)生的基因相互作用的聯(lián)絡(luò)圖。n2.基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測(cè)篩選表達(dá)文庫(kù)（1）噬菌體表面展示系統(tǒng)（2）酵母雙雜交系統(tǒng)（3）酵母單雜交系統(tǒng)27（

10、四）基因文庫(kù)技術(shù)在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用n人類(lèi)基因組計(jì)劃n功能基因組學(xué)28第四節(jié)定向進(jìn)化的應(yīng)用一、提高酶分子的催化活力w實(shí)例1：L-天冬氨酸酶定向進(jìn)化研究w實(shí)例2：-天冬氨酰二肽酶的定向進(jìn)化w實(shí)例3：31四、提高底物的專(zhuān)一性和增加對(duì)新底物催化活力n提高底物專(zhuān)一性，可以使酶更加適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)，而底物專(zhuān)一性是可以通過(guò)進(jìn)化來(lái)提高的n利用結(jié)合能力來(lái)代替催化能力進(jìn)行篩選的不利之處是，有時(shí)提高結(jié)合能力超出了酶反應(yīng)所需最適值，反而降低酶的催化效率五、對(duì)映體選擇性的定向進(jìn)化n定向進(jìn)化可以提高R轉(zhuǎn)氨酶的對(duì)映體選擇性32六、變換催化反應(yīng)專(zhuān)一性 最近研究表明，立體選擇性酶的專(zhuān)一性是可以變化的，也就是酶的柔性，利用定向進(jìn)化方法可以改變酶的專(zhuān)一性 調(diào)整酶的底物專(zhuān)一性對(duì)于合理化設(shè)計(jì)而言是十分困難的，但對(duì)于定向進(jìn)化卻是一種比較容易達(dá)到的目的33第五節(jié)總結(jié)與展望w酶分子定向進(jìn)化策略是非常有效的、更接近于自然進(jìn)化過(guò)程的一種蛋白質(zhì)工程研究新策略，是分子進(jìn)化的一個(gè)重要分支，是組合化學(xué)的思想和方法在酶分子改造上的應(yīng)用w以基因重組技術(shù)為表現(xiàn)形式，有性進(jìn)化思想對(duì)于酶（