核磁共振技術的研究進展

1、核磁共振技術的研究進馬曉菲摘要：核磁共振技術是一種測定化合物結構的強有力手段，具有不破壞樣品、檢測速度快、信息豐富、方法靈活等特點。由于受到人們對其靈敏度、精確度的質疑，核磁共振技術的應用范圍遠不及色譜和質譜技術。但隨著磁場強度的提高，高敏探頭的出現(xiàn)及實驗方法的改進，核磁共振技術的靈敏度已大幅提高，其在藥學領域的應用前景將會越來越廣闊。本文從核磁共振技術的儀器進展，方法進展，應用進展三方面進行綜述。關鍵詞：核磁共振 高敏探頭 固體高分辨 聯(lián)用技術 應用前言 在磁場中用無線電波照射分子時，能引起原子核自旋能級的躍遷。原子核能級躍遷時核磁矩方向的改變而產生的感應電流，即核

2、磁共振的信號。 核磁共振（NMR）最早由Bloch、Purcell發(fā)現(xiàn)并獲得諾貝爾物理學獎，經歷了固體高分辨核磁共振、脈沖傅里葉變換技術、核磁共振成像、高場譜儀的出現(xiàn)等一系列重大突破，從早期的單一的核物理的應用領域拓展到化學，食品，醫(yī)學，藥學，生物學，遺傳學以及材料科學等領域，并成為研究工作的有力工具。 與其他分析手段相比，核磁共振具有如下優(yōu)勢：1.鑒定和檢測的同步性2.不破壞樣品，試劑可回收3.樣品制備方法簡單4.測定迅速、操作簡單、重現(xiàn)性好5.檢測方法靈活多變。但由于核磁共振靈敏度較低，相比于色譜和質譜，其應用范圍相對小得多，并一度成為其發(fā)展的瓶頸。近年來，隨著磁場強度的提高，高敏探頭的出

3、現(xiàn)，實驗方法的改進，以及人們對核磁共振關注的提高，國內外對其研究報道明顯增加。本文從核磁共振技術的儀器進展，方法進展，應用進展三方面進行綜述。1. 儀器進展1.1磁體技術 核磁共振譜儀的硬件主要構成可以分為四個部分，磁體、探頭、數據采集和接收系統(tǒng)、操作系統(tǒng)。磁體的功能是產生一個恒定的磁場，儀器的靈敏度與磁體提供的磁場密切相關?，F(xiàn)代核磁共振超導磁體需要液氮液氦提供的低溫條件來維持磁體的超導狀態(tài)，維護成本非常高。針對這一問題，布魯克公司研制出 Ascend Aeon系列磁體。它能將磁體內揮發(fā)出的氦氣直接液化重新加注回磁體，完成氦氣的循環(huán)，避免了重復添加液氮的麻煩，極大地簡化了磁體的維護工

4、作，降低了維護成本。并且Ascend Aeon系列磁體表現(xiàn)出極佳的磁場均勻度和最小的漏磁場，極大地促進了NMR的發(fā)展。1.2探頭 1.2.1超低溫探頭 探頭則置于靜磁場之中，用于激發(fā)檢測核并探測核磁共振信號。超低溫探頭把低溫技術與先進的射頻硬件設計結合起來，用低溫的氦氣來冷卻探頭檢測線圈到25K，前放電子線圈到70K附近，最大程度降低了檢測到的電子噪聲，探頭檢測靈敏度提高4倍以上。 1.2.2微量探頭 微量探頭是超小型探頭, 通過減少溶劑的體積而相應增加樣品濃度，適用于樣品量小的情況，特別是適用于天然產物研究領域，本身的線圈設計使得其能達到與低溫探頭相當的高靈敏，并且微量探頭安裝與維

5、護簡便。 1.2.3流動探頭 流動探頭能夠在樣品流動的情況下檢測溶液中的結構信息。這種探頭能夠完成樣品的實時檢測，并能與HPLC和質譜聯(lián)合在一起，組成LCNMRMS的強大分析工具。 1.3 樣品變溫裝置 變溫核磁共振實驗在物質結構分析和化學反應跟蹤等應用中有著重要的作用。布魯克公司研制的Thermometer技術通過檢測兩種氘共振的化學位移差值來實現(xiàn)完全自動化溫度控制，與傳統(tǒng)的熱電偶檢測法相比，NMR Thermometer直接測量樣品實際溫度，不再依賴于熱電偶，從而避免在去偶實驗或控溫氣流變化時外部熱電偶測溫導致溫度偏差。2.方法進展2.1固體高分辨核磁共振 普通核磁共振波譜儀所測樣品多為液

6、體, 物質在固態(tài)時的許多性質在液態(tài)時是無法觀察到的。固體分子中分子之間位置相對固定，各向異性作用效果顯著，NMR譜線比液體寬得多，進而導致分辨率的降低。固體高分辨核磁共振主要通過魔角旋轉法、偶極去偶法、多脈沖去偶法、交叉極化法等來獲得高分辨譜圖。 現(xiàn)在固體NMR已廣泛用于研究無機材料（如分子篩、催化劑、陶瓷、玻璃等）和有機材料（如高分子聚合物、膜蛋白等）的微結構。固體高分辨核磁共振在高分子材料方面的研究較多，利用固體NMR 譜圖和各種弛豫參數，人們可以表征材料的分子結構進而監(jiān)視反應的進度。固體NMR不僅為聚合物分子結構的解析提供了豐富和可靠的信息，同時NMR的各個參數也可作為機械性能及動力學研

7、究的重要手段。2.2多維核磁共振 傅里葉脈沖變換技術促進了多維核磁共振技術的發(fā)展。引入二維后，不僅可將化學位移、偶合常數等參數展開在二維平面上，減少了譜線的擁擠和重疊；而且通過提供HH、CH、CC之間的偶合作用以及空間的相互作用，確定它們之間的連接關系和空間構型，有利于復雜化合物的解析，特別是天然產物和生物大分子的結構鑒定。 但隨研究對象分子量的增加，質子數目增加，使其譜線重疊亦越加嚴重, 如何提高分辨又成為關鍵問題。于是三維核磁共振技術便興起。美中不足的是, 三維核磁共振實驗需時長, 且蛋白質標記過程復雜,一定程度上限制了三維核磁共振技術的廣泛應用。 針對多維核磁共振耗時長的問題，近來文獻中

8、報道了一種稱為Hadamard 譜的快速多維譜方法。在相同的分辨率和信噪比的前提下，基于Hadamard 的快速實驗時間比常規(guī)實驗時間減少約20 倍。2.3聯(lián)用技術 2.3.1 高效液相-核磁共振（HPLC-NMR） 高效液相-核磁共振儀（HPLC-NMR）聯(lián)用技術是由液相色譜提供分離技術，核磁共振儀提供結構解析技術，從復雜的藥物代謝產物獲得單一組分的圖譜進行結構推測。解決了固相萃取對于結構復雜的藥物代謝產物的鑒定困難的問題。隨著核磁共振儀磁場強度的增強，靈敏度有了很大的提高，溶劑峰抑制技術的不斷完善，促進了HPLC-NMR 聯(lián)用技術在藥物代謝研究中的發(fā)展。 2.3.2高效液相-核磁共振-質譜

9、（HPLC-NMR-MS） 若用核磁共振譜法確定新化合物的結構，則常常需要其他方法的進一步證實。當基團中不含有質子或者質子極易與溶劑進行化學交換，使信號不能被檢測，加之一些非磁性的核在圖譜中也不會顯示，此時NMR 譜就很難提供代謝物的結構信息了。HPLC-NMR-MS聯(lián)用技術的出現(xiàn)則很好的彌補了這些不足，因為質譜可以提供化合物的分子量，碎片峰也包含了大量的結構信息，為解析復雜的藥物代謝產物的結構提供了全面的信息。 2.3.3超臨界流體分離-核磁共振(SFC-NMR)(SFE-NMR) 超臨界流體是指處于臨界溫度、臨界壓力狀態(tài)下的物質,這時其物理性質介于氣體和液體之間。采用超臨界流體作流動相的色

10、譜法稱為超臨界流體色譜（SFC)，采用超臨界流體作洗脫劑的萃取法稱為超臨界流體萃取(SFE)。SFC-NMR和SFE-NM R聯(lián)用技術避免了HPLC-NMR聯(lián)用技術中溶劑峰干擾問題,解決了樣品在處理過程可能造成的損失、污染或分解,從而提供了一種快捷有效的分離,并能提供混合物的組成和結構信息的分析方法。目前其已成為分析難揮發(fā)、不耐熱的大分子化合物和生物樣品的有效方法。2.3.4 毛細管電泳-核磁共振（CE-NMR） 要將毛細管電泳和核磁共振實現(xiàn)聯(lián)用，需克服兩者進樣量差別所帶來的問題。CE-NM R方法與常規(guī)分離鑒定方法相比大大節(jié)省了時間,省去了單調乏味的工作,提供了一種利用快捷有效的分離獲取豐富

11、的結構信息的方法。3. 應用進展 3.1代謝組學研究 NMR是當前代謝組學研究中的主要分析技術，特別是1H-NMR，對含氫代謝產物均有響應，能完成代謝產物中大多數化合物的檢測，滿足了代謝組學對盡可能多化合物檢測的目標，它所產生的波譜可檢測血漿、尿液、膽汁等生物基質中具有特殊意義的微量物質的異常成分。 代謝組學涉及到的是藥物在體內的原型或其代謝物，內源性干擾物質多且濃度低?；贜MR 技術的代謝組學研究主要包含以下幾個步驟: 首先針對要解決的問題, 設計實驗方案, 采集足夠數量的樣本；然后進行核磁共振波譜數據采集和對系列NMR 譜進行統(tǒng)計分析， 從而提取不同組別之間代謝物種類和含量的相對變化信息

12、。QNMR技術可以測定藥物在體內的變化過程，測定各種代謝物的含量。Abdul 等體外模擬了人微粒體中高度代謝的某種藥物，并對其代謝產物進行了鑒別和測定，有利于化學合成及藥理學的研究。 3.2 復雜體系藥物的定性定量分析 3.2.1 同分異構體混合物的分析 3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯甲酸是制備化學藥物羅氟司特的一個中間體，其同分異構體4-環(huán)丙基甲氧基-3-二氟甲氧基苯甲酸常作為伴生產物出現(xiàn)在制備過程中。實現(xiàn)這兩種化合物的快速鑒別，對于該類藥的工藝研發(fā)和實際生產過程的質量監(jiān)控具有重要意義。鄧志威，等在1H NMR 和13C NMR 測試的基礎上，采用兩種選擇性NMR 實驗技術完成了對藥物合

13、成中間體中同分異構體的鑒別和相對含量的測定。3.2.2順反異構體混合物的分析 申藥報批樣品(SY)含有一個非共軛烯烴結構，不僅需要給出分子結構，還需對化合物烯烴基團的順反式結構和組分含量進行確證。鄧志威，等用對苯二酚作為內標參比物，在500 MHz 的譜儀上獲取1H NMR 譜。經過解譜，確定了樣品順反異構體的結構和含量。3.3 生物大分子體系的研究3.3.1蛋白質三維結構解析 目前蛋白質的結構測定方法主要是X射線晶體衍射和NMR 技術。 NMR 技術在液態(tài)環(huán)境下測定蛋白質的結構，可以對蛋白質所處環(huán)境的pH 值、鹽濃度、溫度等進行靈活調控, 因而比X 射線晶體衍射更接近于生理環(huán)境。順磁弛豫增強

14、(PRE)技術是近年來蛋白質NMR 方法學研究的又一重大突破。PRE-NMR 可用于測定1.52.4 nm 的遠程結構信息, 以及蛋白質瞬態(tài)結構和瞬態(tài)相互作用信息。3.3.2蛋白質復合物的動力學研究 蛋白質往往是與其他蛋白質或生物分子形成蛋白復合物而執(zhí)行功能的。蛋白復合物執(zhí)行功能的過程中，經歷一個相互接觸、結構變化、然后相互分離的過程。NMR特別適合研究瞬時存在、不穩(wěn)定的復合物， 對于溶液中蛋白復合物的研究具有獨特的優(yōu)勢，能很好的描述蛋白質肽鏈的動力學特征。4 結語 核磁共振以其不破壞樣品、試驗方法多、信息豐富、選擇性強和定量分析方法靈活等技術特點，已在化合物的結構鑒定、含量檢測、化學反應過程

15、的動態(tài)跟蹤、生物分子溶液構象研究等方面表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，在藥物分析鑒定中具有很高的實用價值。近年來，隨著磁場強度的提高，高敏探頭的出現(xiàn)及實驗方法的改進，以及人們對核磁共振關注的提高，核磁共振的應用前景將會越來越廣闊。參考文獻1. 高明珠，核磁共振技術及其應用進展J，信息記錄材料，2011 年第12卷第3 期2. 胡揚，薛佳，陳奇，等，核磁共振及其聯(lián)用技術在藥物代謝研究中的應用J，China Academic Journal Electronical Publishing House3. 張芬芬，蔣孟虹，沈文斌，丁婭，等，定量核磁共振( QNMR) 技術及其在藥學領域的應用進展J，南京師范大學學報

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